CN111903860B - 千金子提取物在制备促猪肌肉发育饲料中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了千金子多糖在制备促猪肌肉发育饲料中的应用，属于猪饲料技术领域。本发明通过CCK‑8和EDU实验证明了千金子多糖能够有效的促进猪骨骼肌卫星细胞增殖。此外，本发明通过Western Blot检测发现，千金子多糖能够显著的促进猪骨骼肌卫星细胞分化相关蛋白MyHC和MyoG的蛋白表达。因此可将千金子多糖用于制备猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化促进剂，并且可以将千金子多糖用于制备促猪肌肉发育饲料。
Description
技术领域
本发明属于猪饲料技术领域，尤其涉及一种千金子提取物在制备促猪肌肉发育饲料中的应用。
背景技术
猪肉是我们国家食用最多的肉类，也是我们国家最经济的动物蛋白来源之一。相较于其他牲畜，猪具有繁殖能力高，生长速度快的性能。目前，生猪产业已经是我国农业和畜牧业生产中的支柱产业。随着我国经济水平的发展和人民生活水平的提高，消费者对于猪肉品质的要求越来越高。产肉品质一直是一项重要的经济指标，其中肌纤维是构成猪肌肉的基本单位，与猪的产肉品质密切相关。肌纤维是由骨骼肌卫星细胞分化融合而成，因此，研究猪骨骼肌卫星细胞生长发育过程中的机制，对于提高生猪产肉力、提高猪肉品质、满足人民对于猪肉的需求具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种千金子多糖在促进猪骨骼肌卫星细胞增殖和细胞分化中的应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种千金子多糖在制备促猪肌肉发育饲料中的应用。
优选地，所述千金子多糖的制备方法如下：
（1）将千金子洗净后，烘干，粉碎为粉末，得到千金子粉末；
（2）加入20倍量石油醚-甲醇混合液（2:1），脱脂5h，得到脱脂千金子混合液；
（3）对脱脂千金子混合液进行过滤，得到千金子滤渣；
（4）在所述千金子滤渣中加入25倍量的水，85℃浸提5h，得到千金子滤液；
（5）使用截留分子量为10000的超滤膜过滤去除杂质，并将千金子滤液减压浓缩至原体积的1/3，得到千金子粗多糖液；
（6）加入4倍量的95%乙醇，醇沉24h，8000rpm/min离心10min，去除上清，得到千金子粗多糖；
（7）使用无水乙醇、丙酮洗涤千金子粗多糖，sevage法除去蛋白，冷冻干燥得到千金子多糖。
此外，本发明提供了千金子多糖在制备促猪骨骼肌卫星细胞增殖促进剂中的应用，所述千金子多糖的制备方法如下：
（1）将千金子洗净后，烘干，粉碎为粉末，得到千金子粉末；
（2）加入20倍量石油醚-甲醇混合液（2:1），脱脂5h，得到脱脂千金子混合液；
（3）对脱脂千金子混合液进行过滤，得到千金子滤渣；
（4）在所述千金子滤渣中加入25倍量的水，85℃浸提5h，得到千金子滤液；
（5）使用截留分子量为10000的超滤膜过滤去除杂质，并将千金子滤液减压浓缩至原体积的1/3，得到千金子粗多糖液；
（6）加入4倍量的95%乙醇，醇沉24h，8000rpm/min离心10min，去除上清，得到千金子粗多糖；
（7）使用无水乙醇、丙酮洗涤千金子粗多糖，sevage法除去蛋白，冷冻干燥得到千金子多糖。
除此之外，本发明提供了千金子多糖在制备促猪骨骼肌卫星细胞分化促进剂中的应用，所述千金子多糖的制备方法如下：
（1）将千金子洗净后，烘干，粉碎为粉末，得到千金子粉末；
（2）加入20倍量石油醚-甲醇混合液（2:1），脱脂5h，得到脱脂千金子混合液；
（3）对脱脂千金子混合液进行过滤，得到千金子滤渣；
（4）在所述千金子滤渣中加入25倍量的水，85℃浸提5h，得到千金子滤液；
（5）使用截留分子量为10000的超滤膜过滤去除杂质，并将千金子滤液减压浓缩至原体积的1/3，得到千金子粗多糖液；
（6）加入4倍量的95%乙醇，醇沉24h，8000rpm/min离心10min，去除上清，得到千金子粗多糖；
（7）使用无水乙醇、丙酮洗涤千金子粗多糖，sevage法除去蛋白，冷冻干燥得到千金子多糖。
本发明的有益效果在于：
本发明发现千金子多糖能够有效的促进猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化，因此可将千金子多糖用于猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化促进剂的制备，并且可以将千金子多糖用于制备促猪肌肉发育饲料。
附图说明
图1 EDU染色结果
图2 MyHC和MyoG Western Blot检测结果。
具体实施方式
实施例1
（1）将千金子洗净后，烘干，粉碎为粉末，得到千金子粉末；
（2）加入20倍量石油醚-甲醇混合液（2:1），脱脂5h，得到脱脂千金子混合液；
（3）对脱脂千金子混合液进行过滤，得到千金子滤渣；
（4）在所述千金子滤渣中加入25倍量的水，85℃浸提5h，得到千金子滤液；
（5）使用截留分子量为10000的超滤膜过滤去除杂质，并将千金子滤液减压浓缩至原体积的1/3，得到千金子粗多糖液；
（6）加入4倍量的95%乙醇，醇沉24h，8000rpm/min离心10min，去除上清，得到千金子粗多糖；
（7）使用无水乙醇、丙酮洗涤千金子粗多糖，sevage法除去蛋白，冷冻干燥得到千金子多糖。
分离猪骨骼肌卫星细胞
1.将7日龄的大白仔猪处死后，取仔猪后腿的全部肌肉置于含有双抗的30mlPBS中，漂洗干净后，去除肌肉表面的筋膜并且将肌肉组织剪切为1mm3的肉糜；
2.将肉糜转移至离心管中，1000rpm/min，离心10min，将沉淀转移至培养皿中，加入0.1%的Ⅱ型胶原蛋白酶，放置在37℃培养箱中消化1-2h；
3.消化结束后，用100μm的细胞筛对悬液进行过滤，将得到的过滤液转移至新的离心管中，2000rpm/min，离心10min；
4.去除上清，PBS重悬细胞，1500rpm/min，离心10min；
5.去除上清，加入红细胞裂解液进行重悬，静置10min中后，用40μm的细胞筛对悬液进行过滤，将液体转移至新的离心管中，1500rpm/min，离心10min；
6.去除上清，实验完全培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于细胞培养箱中培养。
实施例3
千金子多糖促进猪骨骼肌卫星细胞增殖
（1）将2000个处于对数生长期的猪骨骼肌卫星细胞接种于96孔板中，培养过夜，共设置；
（2）更换为含有0mg/ml千金子多糖，25mg/ml 千金子多糖，50mg/ml千金子多糖，100mg/ml千金子多糖，200mg/ml千金子多糖的完全培养基，培养48h后，加入10μl CCK-8检测450nm OD值。
实验结果如表1所示：
表1 不同浓度千金子多糖对于猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响
| 添加物 | 0mg/ml千金子多糖 | 25mg/ml千金子多糖 | 50mg/ml千金子多糖 | 100mg/ml千金子多糖 | 200mg/ml千金子多糖 |
| OD值 | 0.594±0.031 | 0.644±0.021 | 0.732±0.026 | 0.810±0.022 | 0.907±0.014 |
从表中可以看出，千金子多糖能够显著的促进猪骨骼肌卫星细胞的细胞增殖。
实施例4
Edu染色进一步验证千金子多糖对于猪骨骼肌卫星细胞的细胞增殖的影响
（1）将猪骨骼肌卫星细胞接种于96孔板中，使用0mg/ml千金子多糖和200mg/ml千金子多糖处理24h后，去除培养基，加入100μl EDU孵育2h；
（2）去除EDU，使用PBS清洗细胞2次，每次5min；
（3）加入4%的多聚甲醛室温固定30min，去除固定液加入100μl 0.2%甘氨酸孵育5min，PBS清洗细胞2次，每次5min；
（4）加入100μl 0.5% Triton-100处理10min，PBS清洗5min；
（4）每孔加入100μl Apollo处理10min，PBS清洗5min；
（5）加入100μl 0.5% Triton-100摇床处理2次，每次10min；
（6）加入100μl甲醇清洗2次，每次5min，PBS清洗5min；
（7）加入DAPI染色15min，PBS清洗3次，每次5min，荧光显微镜下观察并拍照。
实验结果如图1所示，可以看出200mg/ml千金子多糖染色细胞的数量显著多于0mg/ml千金子多糖，该结果进一步证明千金子多糖能够促进猪骨骼肌细胞增殖。
实施例5
（1）将猪骨骼肌卫星细胞接种于6孔板中，培养过夜后，更换为加有0mg/ml千金子多糖，100mg/ml千金子多糖和200mg/ml千金子多糖的分化培养基；
（2）培养72h后，弃去培养基，加入1mlPBS清洗细胞，加入100μl使用细胞刮刀将细胞刮下，使用移液枪将细胞转移到EP管；
（3）冰上裂解30min，置于离心机中，4℃，12000rpm/min，离心15min；
（4）离心结束后，小心吸取上清，得到蛋白样品；
（5）使用BCA法测量蛋白浓度，并调整蛋白样品浓度为2μg/μl。
（6）配制12%分离胶，5%浓缩胶，每孔加入10μl蛋白样品和蛋白Marker；
（7）浓缩胶恒压90V，分离胶恒压120V，当溴酚蓝跑至凝胶的底部时停止电泳；
（8）小心取出凝胶，按照海绵垫，三层滤纸，PAGE胶，PVDF膜，三层滤纸，海绵垫的模式安装转印夹，将转印夹放入电转槽中，室温电转1.5小时；
（9）电转结束后，将PVDF膜取出，放入5%脱脂奶粉中，室温摇床封闭1h。
（10）封闭完成后，使用TBST洗膜3次，每次10分钟；
（11）根据相应蛋白条带大小，裁切PVDF膜，孵育MyHC，MyoG和β-actin一抗，4℃，孵育过夜；
（12）一抗孵育结束后，使用TBST洗膜3次，每次10分钟，孵育相应的2抗，室温孵育1h；
（13）二抗孵育结束后，使用TBST洗膜3次，进行显影曝光。
结果如图2所示，从图中可以看出，随着千金子多糖浓度的增大，MyHC和MyoG的蛋白表达量明显升高。
Claims (2)
1.千金子多糖在制备促猪肌肉发育饲料中的应用，其特征在于，所述千金子多糖的制备方法如下：
（1）将千金子洗净后，烘干，粉碎为粉末，得到千金子粉末；
（2）加入20倍量体积比2:1的石油醚-甲醇混合液，脱脂5h，得到脱脂千金子混合液；
（3）对脱脂千金子混合液进行过滤，得到千金子滤渣；
（4）在所述千金子滤渣中加入25倍量的水，85℃浸提5h，得到千金子滤液；
（5）使用截留分子量为10000的超滤膜过滤去除杂质，并将千金子滤液减压浓缩至原体积的1/3，得到千金子粗多糖液；
（6）加入4倍量的95%乙醇，醇沉24h，8000rpm离心10min，去除上清，得到千金子粗多糖；
（7）使用无水乙醇、丙酮洗涤千金子粗多糖，sevage法除去蛋白，冷冻干燥得到千金子多糖。
2.千金子多糖在制备促猪骨骼肌卫星细胞增殖促进剂中的应用，其特征在于，所述千金子多糖的制备方法如下：
（1）将千金子洗净后，烘干，粉碎为粉末，得到千金子粉末；
（2）加入20倍量体积比2:1的石油醚-甲醇混合液，脱脂5h，得到脱脂千金子混合液；
（3）对脱脂千金子混合液进行过滤，得到千金子滤渣；
（4）在所述千金子滤渣中加入25倍量的水，85℃浸提5h，得到千金子滤液；
（5）使用截留分子量为10000的超滤膜过滤去除杂质，并将千金子滤液减压浓缩至原体积的1/3，得到千金子粗多糖液；
（6）加入4倍量的95%乙醇，醇沉24h，8000rpm离心10min，去除上清，得到千金子粗多糖；
（7）使用无水乙醇、丙酮洗涤千金子粗多糖，sevage法除去蛋白，冷冻干燥得到千金子多糖。
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