CN111821333A - 视神经保护用组合物 - Google Patents

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Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明提供一种视神经保护用组合物。本发明为视神经细胞保护用、青光眼的预防用或治疗用、视网膜神经节细胞死亡抑制用、或用于延缓人视力丧失加剧的组合物，所述组合物含有选自由将小麦蒸后干燥而成的物质、脱脂小麦胚芽、脱脂米胚芽、脱脂大豆、发酵葡萄、橙皮苷、乳酸菌属的唾液乳杆菌、和野葡萄、罗望子、蓝锭果、石榴籽、甘草粉和肉桂粉组成的组中的至少一种。

Description

视神经保护用组合物
本申请是申请日为2016年7月13日、申请号为201680042449.1、发明名称为“视神经保护用组合物”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及视神经保护用组合物。
背景技术
位于视网膜最内层的视网膜神经节细胞是视网膜细胞中所含的神经细胞，其承担着汇总源自视细胞的刺激并传递至视神经的功能。若该一系列的传递通路发生病变，则导致视觉功能降低。
40岁以上的日本人中有5％发病，作为失明首位原因的青光眼，作为最终的病理状态也是由于视网膜神经节细胞的细胞死亡而使视神经受损，引起视野病变的疾病。
因此，认为预防视网膜神经节细胞死亡或者最小限度地抑制视网膜神经节细胞死亡的治疗与青光眼治疗相关联这样的想法是很普遍的(非专利文献1)。
然而，目前针对青光眼唯一有实证的治疗法是通过药物、激光、创手术进行的降眼压疗法。如正常眼压青光眼的协作研究(Collaborative Normal-Tension GlaucomaStudy)中所提倡的那样，治疗的重点在于使眼压降低30％从而保持视野。随着多种降眼压药的问世，通过降眼压作用带来的治疗效果得以提高，展开了品质高的治疗。然而，日本青光眼患者的大多数病型是眼压在正常范围的正常眼压青光眼，因此难以获得30％降眼压的患者、以及尽管眼压足够低但观察到视野病变加剧的病例也并不少。因此，认为目前进行的仅通过降眼压来治疗青光眼的疗法是存在界限的，需要关注眼压以外的危险因素，进行与其对应的治疗。(非专利文献2)
另一方面，对于青光眼疾病的加剧，作为其原因之一，可推断定与全身和视网膜视神经中的抗氧化系统的崩溃相关，可以期待开发出显示出针对由抗氧化物质带来的青光眼视神经症的神经保护效果并且通过抗氧化药的应用而介导了抗氧化的新型神经保护药(非专利文献3)，但目前还没有已确立的有效治疗法。
进而，近些年对青光眼中内质网应激的参与有所关注，并证实了由于各种各样的细胞应激，视网膜神经节细胞在细胞死亡之前诱导内质网应激。另外，还启示了过度的内质网应激与阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化和帕金森病等神经性疾病的发病及进行相关(非专利文献4)，但就这些而言目前也没有已确立的有效治疗法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：眼科,40,251-273
非专利文献2：日本の眼科(日本的眼科),85,6号,762-765
非专利文献3：あたらしい眼科(新的眼科),31,5号,699-700
非专利文献4：脳(脑)21,17,4号,459-465
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供用于保护视神经细胞的有效手段，且目的在于提供用于预防或治疗与视神经细胞死亡相关的疾病或病变、尤其是青光眼的组合物。
用于解决问题的方案
本发明人等使用作为青光眼的病态模型的小鼠视神经破碎模型以及由与小鼠视神经破碎模型不同的细胞病变机理而诱导细胞死亡的通过给予NMDA导致的青光眼病态模型，通过利用经口给予或眼内给予的各种试验进行了深入研究，结果发现：分别单独使用将小麦蒸后干燥而成的物质、脱脂小麦胚芽、脱脂米胚芽、脱脂大豆、发酵葡萄、橙皮苷、乳酸菌属的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius、以下简记为“乳酸菌LS”)、野葡萄、罗望子、蓝锭果、石榴籽、甘草粉、肉桂粉这13种原材料对于视网膜神经节细胞中的细胞死亡具有优异的保护效果；还发现：分别单独使用野葡萄、罗望子、蓝锭果、石榴籽、甘草粉、将小麦蒸后干燥而成的物质、肉桂粉这7种原材料对于内质网应激具有优异的抑制作用。
即，根据本发明，提供以下的组合物：
[1]一种视神经细胞保护用组合物，其含有选自由将小麦蒸后干燥而成的物质、脱脂小麦胚芽、脱脂米胚芽、脱脂大豆、发酵葡萄、橙皮苷和乳酸菌属的唾液乳杆菌(Lacticacid bacterium Lactobacillus salivarius)组成的组中至少一种有效成分。
[2]一种青光眼的预防用或治疗用组合物，其含有选自由将小麦蒸后干燥而成的物质、脱脂小麦胚芽、脱脂米胚芽、脱脂大豆、发酵葡萄、橙皮苷和乳酸菌属的唾液乳杆菌组成的组中至少一种有效成分。
[3]一种用于抑制视神经细胞死亡、或抑制视网膜神经节细胞死亡、或延缓人视力丧失加剧的组合物，其含有选自由将小麦蒸后干燥而成的物质、脱脂小麦胚芽、脱脂米胚芽、脱脂大豆、发酵葡萄、橙皮苷和乳酸菌属的唾液乳杆菌组成的组中至少一种有效成分。
[4]一种视神经细胞保护用组合物，其含有选自由野葡萄、罗望子、蓝锭果、石榴籽、甘草粉和肉桂粉组成的组中至少一种有效成分。
[5]一种青光眼的预防用或治疗用组合物，其含有选自由野葡萄、罗望子、蓝锭果、石榴籽、甘草粉和肉桂粉组成的组中至少一种有效成分。
[6]一种用于抑制视神经细胞死亡、或抑制视网膜神经节细胞死亡、或延缓人视力丧失加剧的组合物，其含有选自由野葡萄、罗望子、蓝锭果、石榴籽、甘草粉和肉桂粉组成的组中至少一种有效成分。
[7]一种内质网应激抑制用组合物，其含有选自由野葡萄、罗望子、蓝锭果、石榴籽、甘草粉、将小麦蒸后干燥而成的物质和肉桂粉组成的组中至少一种有效成分。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的组合物，其为经口给予用或眼内给予用药物。
[9]根据[1]～[7]中任一项所述的组合物，其为食品的形态。
[10]根据[9]所述的组合物，其附有具有如下功能的标示选自由抗氧化活性、内质网应激抑制、视神经细胞死亡的抑制、视网膜神经节细胞死亡抑制、抑制人视野障碍加剧和抑制人视力丧失加剧组成的组中至少一种功能。
发明的效果
通过本发明的视神经保护用组合物，能够有效地预防或治疗与视神经细胞死亡相关的眼疾病、尤其是青光眼。
附图说明
图1示出试验1的结果(各成分的抗氧化能力)。
图2示出试验2的结果(通过各成分的视网膜神经节细胞存活比例)。
图3示出试验3的结果(经口给予酶处理橙皮苷时的视网膜神经节细胞存活比例)。
图4示出试验4的结果(眼内给予酶处理橙皮苷时的视网膜神经节细胞存活比例)。
图5示出试验4的结果(眼内给予酶处理橙皮苷时的存活视网膜神经节细胞的照片)。
图6示出试验5的结果(眼内给予酶处理橙皮苷时的视网膜神经节细胞特异性基因的表达量)。
图7示出试验6的结果(通过酶处理橙皮苷的RBPMS细胞数存活比例)。
图8示出试验6的结果(眼内给予酶处理橙皮苷时的RBPMS表达细胞的照片)。
图9示出试验7的结果(眼内给予酶处理橙皮苷时的电生理性功能评价)。
图10示出试验8的结果(眼内给予酶处理橙皮苷时的视力的变化)。
图11示出试验9的结果(通过各成分的Trb3表达量比例)。
具体实施方式
〔有效成分〕
本发明含有选自由将小麦蒸后干燥而成的物质、脱脂小麦胚芽、脱脂米胚芽、脱脂大豆、发酵葡萄、橙皮苷、乳酸菌属的唾液乳杆菌、野葡萄、罗望子、蓝锭果、石榴籽、甘草粉、肉桂粉、它们的提取液和它们的组合组成的组中的至少一种作为有效成分。
将小麦蒸后干燥而成的物质可以利用公知的方法来制造，或也可以使用市售品。例如作为市售品，可列举出商品名“Kojimugi(注册商标)ST”(Fresh Food Service co.,Ltd.制)等。
脱脂小麦胚芽可以利用公知的方法来制造，或也可以使用市售品。例如作为市售品，可列举出商品名“Dasshi Komugi Haiga Furawah TYPE-R”(光洋商会株式会社制)等。
脱脂米胚芽可以利用公知的方法来制造，或也可以使用市售品。作为公知的方法，通过使用正己烷等有机溶剂来将米胚芽分离(脱脂)出脂溶性组分，从而能够得到目标物。可以通过加热使有机溶剂蒸发来去除有机溶剂。
脱脂大豆可以利用公知的方法来制造，或也可以使用市售品。例如作为市售品，可列举出商品名“Dasshi Daizu HAIPURO”(J-Oil Mills Inc.制)等。
发酵葡萄可以利用公知的方法来制造，或也可以使用市售品。作为公知的方法，例如，捣碎带有外皮的葡萄的果实，利用皮中所含的酵母进行发酵。也可以仅将葡萄的果皮、种子发酵。另外，还可以添加酵母、乳酸菌。还可以使用发酵后压碎的果实，或还可以使用提取物。葡萄的种类没有特别限定，甲州种是适合的。作为市售品，可列举出商品名“Fermented Grape Food”(Vino Science Japan株式会社制)等。
橙皮苷和酶处理橙皮苷(使用酶在橙皮苷中添加了糖而成的物质)可以利用公知的方法来制造，或也可以使用市售品。作为橙皮苷的市售品，可列举出商品名“Hesperidin”(橙皮苷)(Alps Pharmaceutical Industry Co.,Ltd.制)等，作为酶处理橙皮苷的市售品，可列举出商品名“αG Hesperidin H”(αG橙皮苷H)、“αG-Hesperidin PA”(αG-橙皮苷PA)、“αG-Hesperidin PA-T”(αG-橙皮苷PA-T)(东洋精糖株式会社制、Glico Nutrition Co.,Ltd.)等。
乳酸菌LS可以适宜地使用例如活菌体、湿菌、干燥菌、死菌体、培养上清液、包含培养基成分的培养物、经冷冻干燥的菌体或其双散射体等。作为乳酸菌LS，例如可以使用Wakamoto Pharmaceutical Co.,Ltd.所保藏的、唾液乳杆菌WB21株(保藏号FERM BP-7792)。
野葡萄可以适宜地使用例如带着外皮的果实、果肉、枝、叶、或其干燥物、提取物等。作为市售品，例如可列举出商品名“Nobudou Kansou Ekisu F”(丸善制药株式会社制)等。
罗望子可以适宜地使用例如带着外皮的果实、果肉、果实种子、种皮、或其干燥物、提取物等。作为市售品，例如可列举出商品名“Indian date extract powder MF”(丸善制药株式会社制)等。
蓝锭果可以适宜地使用例如带着外皮的果实、果肉、或其干燥物、提取物等。作为市售品，例如可列举出商品名“Haskap Powder S”(日本新药株式会社制)等。
石榴籽可以适宜地使用例如种子、或其干燥物、提取物等。作为市售品，例如可列举出商品名“Zakuro shusi Kansou Ekisu”(Ask Chemicals Co.,Ltd.制)等。
甘草粉可以适宜地使用例如根、匍匐茎、或其干燥物、提取物等。例如作为市售品，可列举出商品名“Shokuhin Genryou yo Kanzoumatsu”(日本粉末药品株式会社制)等。
肉桂粉可以适宜地使用例如树皮、或其干燥物、提取物等。例如作为市售品，可列举出商品名“Shokuhin Genryou yo Keihimatsu”(日本粉末药品株式会社制)等。
提取液可以通过如下方式制得，例如，将上述有效成分投入水、乙醇等药理学上能够容许的提取溶剂中，使各有效成分中所含的一个以上的成分浸出。
相对于组合物100质量份，本发明的组合物中的将小麦蒸后干燥而成的物质的配混量优选为0.05～100质量份。
相对于组合物100质量份，本发明的组合物中的脱脂小麦胚芽的配混量优选为0.05～100质量份、更优选为0.5～100质量份、进一步优选为5～100质量份。
相对于组合物100质量份，本发明的组合物中的脱脂米胚芽的配混量优选为0.05～100质量份、更优选为0.5～100质量份、进一步优选为5～100质量份。
相对于组合物100质量份，本发明的组合物中的脱脂大豆优选为0.05～100质量份、更优选为0.5～100质量份、进一步优选为5～100质量份。
相对于组合物100质量份，本发明的组合物中的发酵葡萄的配混量优选为0.05～100质量份、更优选为0.5～100质量份。
对于组合物100质量份，本发明的组合物中的橙皮苷的配混量优选为0.01～100质量份。
相对于组合物100质量份，本发明的组合物中的酶处理橙皮苷的配混量优选为0.025～100质量份。
每组合物100质量份，本发明的组合物中的乳酸菌LS优选为以乳酸菌菌数为100万个～100兆个的方式进行配混。
相对于组合物100质量份，本发明的组合物中的野葡萄的配混量优选为0.005～100质量份、更优选为0.05～100质量份。
对于组合物100质量份，本发明的组合物中的罗望子的配混量相优选为0.0001～100质量份、更优选为0.005～100质量份。
相对于组合物100质量份，本发明的组合物中的蓝锭果的配混量优选为0.005～100质量份、更优选为0.05～100质量份。
相对于组合物100质量份，本发明的组合物中的石榴籽的配混量优选为0.005～100质量份、更优选为0.05～100质量份。
相对于组合物100质量份，本发明的组合物中的甘草粉的配混量优选为0.005～100质量份、更优选为0.05～100质量份。
相对于组合物100质量份，本发明的组合物中的肉桂粉的配混量优选为0.005～100质量份、更优选为0.05～100质量份。
本发明的组合物可以作为用于预防或治疗青光眼尤其是以视神经细胞死亡为原因的疾病的食品或药品来使用。
食品形态的情况，进而还可以通过配混糖质、脂质、蛋白质、氨基酸、维生素类、其它矿物类、蜂王浆、蜂胶、蜂蜜、食物纤维、虾青素、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六稀酸(DHA)、乳铁蛋白、落叶松蕈(agaricus)、甲壳质、壳聚糖、辣椒素、多酚、类胡萝卜素、脂肪酸、黏多糖、辅酶、抗氧化物质等，而制成营养强化剂等健康食品或营养功能食品。
食品组合物的形态没有特别限定，可以示例出：片剂；胶囊剂；用于溶解于水、牛乳等来服用的粉末剂；饮料；零食；冰糕等。
药品形态的情况，可以与药理学上能够容许的载体或稀释剂、例如羧甲基纤维素/乙基纤维素等纤维素衍生物、马铃薯淀粉/玉米淀粉等淀粉类、乳糖/蔗糖等糖类、花生油/玉米油/芝麻油等植物性油、聚乙二醇、褐藻酸、明胶、滑石等进行混合，制成片剂/胶囊剂/颗粒剂/散剂等经口给予的制剂、口腔用片剂/口腔用半固体剂等用于口腔内的制剂、注射剂、滴眼剂、栓剂/灌肠剂等用于直肠的制剂、软膏剂/贴剂等用于皮肤等的制剂、萃取剂/丸剂/煎剂等用于生药相关制剂等的剂型。本发明的药品可以经口或非经口(例如眼内给予、玻璃体内给予)地进行给予。
本发明的组合物适合每天连续地摄取。体重约60kg的成人摄取的情况下，就每1次的摄取量而言，有效成分量优选为0.0001～3.3g、更优选为0.0003～3.3g。体重约60kg的成人摄取的情况下，就1天每的摄取量而言，有效成分量期望为0.0003～10g、更优选期望为0.001～10g的量。
实施例
试验1.抗氧化能力的研究
作为可期待视神经保护的成分，在配混了各成分的神经细胞用培养基中培养小鼠的视网膜分离细胞，基于各成分的抗氧化能力的有无，确认出对视网膜分离细胞的效果。
〔材料和方法〕
＜材料＞
作为期待视神经保护的成分，将以下物质或其提取液供于试验。
将小麦蒸后干燥而成的物质(商品名“Kojimugi(注册商标)ST”、Fresh FoodService co.,Ltd.制(以下示为“小麦”))、脱脂米胚芽(通过使用正己烷等有机溶剂来将米胚芽分离(脱脂)出脂溶性组分，从而能够得到目标物。通过加热使有机溶剂蒸发来去除有机溶剂。)、脱脂大豆(商品名“Dasshi Daizu HAIPURO”、J-Oil Mills Inc.制)、发酵葡萄(商品名“Fermented Grape Food”、Vino Science Japan株式会社)橙皮苷(商品名“Hesperidin”、Alps Pharmaceutical Industry Co.,Ltd.)、酶处理橙皮苷(商品名“αGHesperidin H”(αG-橙皮苷H)、商品名“αG-Hesperidin PA”(αG-橙皮苷PA)、GlicoNutrition Co.,Ltd.)、乳酸菌属的唾液乳杆菌WB21株(以下简记为“乳酸菌WB21”。)(保藏号FERM BP-7792)
试验细胞小鼠成体视网膜分离细胞
试验培养基神经细胞用培养基(组成：Neurobasal-A Medium(1×),Liquid(LifeTechnologies)、B-27(注册商标)supplement Minus AO(50×),Liquid(LifeTechnologies)(以下简记为“B-27补充剂(AO-)”。)2％、庆大霉素(Gentamicin)12μg/mL、L-谷氨酰胺(L-glutamine)2mM、胰岛素(insulin)1μg/mL)
细胞数制备用培养基(组成：Neurobasal-A Medium(1×),Liquid(LifeTechnologies)、庆大霉素0.25mg/mL、L-谷氨酰胺0.5mM、胰岛素0.005mg/mL、B-27补充剂(AO-)2％
＜方法＞
1.使用了小鼠成体视网膜分离细胞的各候补健康食品成分的抗氧化能力的确认
小鼠成体视网膜分离细胞的培养，在添加了B-27补充剂(AO-)的神经细胞用培养基中进行，细胞选择在短期内死亡的条件。B-27补充剂(AO-)是排除了在研究自由基对神经元的损伤时会产生影响的5种抗氧化物质(维生素E、维生素E乙酸酯、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、和谷胱甘肽)的B-27(注册商标)补充剂。存活细胞利用能够对细胞存活进行定量化的阿拉莫蓝(AlamarBlue)(商标)法进行解析。阿拉莫蓝(Invitrogen、型号DAL1100)被存活细胞还原，从氧化型的深蓝色变为还原型的荧光红色。
实验将各组的样品数设为4，按以下步骤进行。
(1)小鼠成体视网膜分离细胞如下所述，可以使用gentleMACS(Miltenyi BiotecK.K.)和Neural Tissue Dissociation Kit(P)(Miltenyi Biotec K.K.)。
1)使小鼠(雄性C57BL/6系小鼠、8-11周龄)安乐死，摘出眼球，将视网膜组织采集至HBSS(-)with phenol red(和光纯药工业株式会社、代码No.084-08345)内。
2)在gentleMACS Tube中加入Neural Tissue Dissociation Kit(P)的BufferX1.9ml和Enzyme P 50μl及4张视网膜后，放置在MACSmix Tube Rotator中，在37℃、CO25％的孵化器内以最慢的速度搅拌5分钟。
3)实施gentleMACS Octo Dissociator的程序“m_brain_01”后，放置在MACSmix(商标)中，在37℃、CO25％的孵化器内以最慢的速度搅拌3分钟。
4)实施gentleMACS的程序“m_brain_02”后，添加Buffer Y 20μl和Enzyme A 10μl的混合液，放置在MACSmix中，在37℃、CO25％的孵化器内以最慢的速度搅拌5分钟。
5)实施gentleMACS Octo Dissociator的程序“m_brain_03”后，放置在MACSmixTube Rotator中，在37℃、CO25％的孵化器内以最慢的速度搅拌5分钟。
6)用Cell Strainer
Figure BDA0002644174670000101
对溶液进行过滤、离心分离，悬浮于神经细胞用培养基中。
7)取出一部分细胞溶液并利用血细胞计数板通过台盼蓝染色计数未被染色的存活细胞。
(2)基于计数结果来稀释小鼠成体视网膜分离细胞，以存活细胞成为1.8×105个细胞/50μL细胞数调整用培养基/孔的方式播种至96孔板的各孔中，在CO25％的孵化器内以37℃培养15分钟，贴在96孔板的各孔底面。
(3)对于实验组，如表1所述将使用神经细胞用培养基制得的各成分50μL加入(2)的各孔中；对于小麦、脱脂米胚芽、脱脂大豆、发酵葡萄、αG-橙皮苷H、αG-橙皮苷PA-T、乳酸菌WB21的对照组，仅将神经细胞用培养基50μL加入(2)的各孔中；对于橙皮苷的对照组，将二甲基亚砜(和光纯药工业株式会社)以最终浓度成为0.1％的方式用神经细胞用培养基稀释而成的物质50μL加入(2)的各孔中，并在37℃、CO25％的孵化器内进行2小时培养。
[表1]
Figure BDA0002644174670000121
(4)向(3)的各孔中追加阿拉莫蓝10μL、在CO25％的孵化器内以37℃进行约24小时的显色反应。
(5)显色反应后，通过测定荧光强度(激发波长544-570nm、测定波长590nm)而评价了存活细胞数。
作为结果，对照组中的荧光强度的测定值为1时的、实验组8种中各自的荧光强度的测定值之比示于图1。与对照组相比，实验组8种中的测定值均为高值。由此，与对照组中的存活细胞数相比，实验组中的存活细胞数多，因此可知表1所示的各成分具有抗氧化能力力。因此，能够推测出表1所示的各成分具有视神经保护效果。
试验2.通过小鼠青光眼模型的视神经保护效果的研究
对于各成分，使用作为啮齿类的青光眼的病态模型的小鼠视神经破碎模型，确认了神经保护效果。
〔材料和方法〕
＜材料＞
成分
作为期待视神经保护的成分，将以下物质供于试验。
酶处理橙皮苷(商品名“αG-Hesperidin PA-T(αG-橙皮苷PA-T)”、GlicoNutrition Co.,Ltd.制)、发酵葡萄(商品名“Fermented Grape Food”、Vino ScienceJapan株式会社)、将小麦蒸后干燥而成的物质(商品名“Kojimugi(注册商标)ST”、FreshFood Service co.,Ltd.制(以下示为“小麦”))、脱脂小麦胚芽(商品名“Dasshi KomugiHaiga Furawah TYPE-R”、光洋商会株式会社制、脱脂米胚芽(通过使用正己烷的有机溶剂而将米胚芽分离(脱脂)出脂溶性组分，从而能够得到目标物。通过加热有机溶剂使有机溶剂蒸发来去除。)、脱脂大豆(商品名“Dasshi Daizu HAIPURO”、J-Oil Mills Inc.制)、乳酸菌属的唾液乳杆菌WB21株(以下简记为“乳酸菌WB21”。)(保藏号FERM BP-7792))
试验动物雄性C57BL/6系小鼠9-12周龄约25g
实验将各组的样品数设为8，利用以下方法进行。
＜方法＞
(1)为了标记视网膜神经节细胞，在视神经破碎手术1周前，在麻醉下将1％荧光金(Fluorochrome,LLC)注入小鼠脑的上丘中。
(2)对于实验组的小鼠，将如表2所述制得的各成分、以如表2所述的给予量自在视神经破碎处置前1周起进行1天1次经口给予，对于对照组的小鼠，将蒸馏水或磷酸缓冲生理盐水(不含Ca、Mg，pH7.4、以下简记为“PBS(-)”)100μL，自视神经破碎处置前1周起进行1天1次经口给予。
[表2]
Figure BDA0002644174670000141
(3)通过给予氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(5mg/kg)在麻醉下实施小鼠的视神经破碎处置。仅对单眼进行视神经破碎处置，另一只眼未进行处置。视神经破碎处置结束后，将抗菌剂眼软膏滴入小鼠的眼中。
(4)在视神经破碎处置第二天，对于实验组的小鼠，将表2的各成分进行1天1次经口给予；对于对照组的小鼠，将蒸馏水或PBS(-)100μL进行1天1次经口给予。
(5)在视神经破碎处置后第10天摘出小鼠的视网膜，用4％多聚甲醛·磷酸缓冲液(和光纯药工业株式会社)固定视网膜后，用作为荧光用封入剂的VECTASHIELD MountingMedium(Vector Laboratories、商品代码H-1000)进行封入。
(6)对1个视网膜上拍摄12处500像素的正方形。
(7)对用荧光金标记的细胞数进行计数而求出12处的平均数，将其作为每1平方毫米的存活视网膜神经节细胞数，求出了每组的平均值。
作为结果，将对照组中的每1平方毫米的平均存活视网膜神经节细胞数作为1时的、实验组中的每1平方毫米的平均存活视网膜神经节细胞数之比示于图2。实验组中的存活视网膜神经节细胞数多于对照组的每1平方毫米的存活视网膜神经节细胞数。即，可知表2所示的各成分抑制了由于视神经破碎所诱导的视网膜神经节细胞死亡。确认出实施的所有各成分均具有视神经保护效果。
试验3.通过酶处理橙皮苷的经口给予的视网膜神经节细胞保护效果的研究
对于作为视神经破碎以外的青光眼模型并且是通过给予7N-甲基-D-天冬氨酸(以下称为“NMDA”。)而诱导神经節细胞死亡的模型，研究了酶处理橙皮苷的细胞保护作用。
〔材料和方法〕
＜材料＞
试验物质：酶处理橙皮苷(商品名“αG-Hesperidin PA-T”(αG-橙皮苷PA-T)、GlicoNutrition Co.,Ltd.)
使用动物：C57BL/6小鼠雄8-12周龄约25g
实验将各组的样品数设为5，利用以下方法进行。
＜方法＞
(1)小鼠到货后，适应了1周的时间。在此期间自由摄取水和饵料。
(2)对于实验组的小鼠，将200μL以成为20％(w/v)的方式添加了酶处理橙皮苷的磷酸缓冲生理盐水(不含KCl)(pH 7.2)(Nakarai Tesque、产品编号11480-35)(以下称为“PBS”。)使用经口探针经口给予1天3次进行7天，对于对照组的小鼠，将PBS200μL使用经口探针经口给予1天3次进行7天。
(3)对小鼠经口给予7天后，将10％戊巴比妥钠0.3mL进行筋中给予至大腿部，进行了全身麻醉。
(4)用30G注射针对小鼠的角膜缘部下方进行穿孔。
(5)使用汉密尔顿注射器和32G注射针，将2μL以成为15μM的方式添加了NMDA(Sigma-aldrich)的PBS给予至小鼠的玻璃体内。
(6)对小鼠的结膜进行修整，滴入抗菌剂眼软膏。对单眼进行处置，另一只眼未进行处置。进行保温处置，等待清醒。
(7)在第二天，对于实验组的小鼠，将以成为20％(w/v)的方式添加了酶处理橙皮苷的PBS200μL使用经口探针进行1天3次经口给予；对于对照组的小鼠，将PBS200μL使用经口探针进行1天3次经口给予。
(8)在NMDA玻璃体内给予3天后，为了标记视网膜神经节细胞，而在麻醉下将1％荧光金(Fluorochrome,LLC)注入小鼠脑的上丘中。
(9)在荧光金标记7天后使小鼠颈椎脱臼，摘出眼球，用4％多聚甲醛·磷酸缓冲液(和光纯药工业株式会社)固定视网膜2小时后，用DPBS(Gibco、产品编号14190-144)清洗，用作为荧光用封入剂的VECTASHIELD Mounting Medium(Vector Laboratories、商品代码H-1000)进行封入。
(10)用荧光显微镜在1个视网膜上拍摄12处500像素的正方形。
(11)对经荧光金标记的细胞数进行计数并求出12处的平均数，将其作为每1平方毫米的存活视网膜神经节细胞数，求出每组的平均值。
作为结果，将对照组中的每1平方毫米的平均存活视网膜神经节细胞数作为1时的、实验组中的每1平方毫米的平均存活视网膜神经节细胞数之比示于图3。实验组(图3中“病变+酶处理橙皮苷”)中的每1平方毫米的平均存活视网膜神经节细胞数多于对象组的每1平方毫米的平均存活视网膜神经节细胞数。即，通过该试验可知，经口给予酶处理橙皮苷抑制了通过NMDA诱导的视网膜神经节细胞死亡。
试验4.通过酶处理橙皮苷眼内给予的视网膜神经节细胞保护效果的研究
利用通过NMDA给予而进行神经節细胞死亡诱导的模型，研究了酶处理橙皮苷的细胞保护作用。
〔材料和方法〕
＜材料＞
试验物质：酶处理橙皮苷(商品名“αG-Hesperidin PA-T”(αG-橙皮苷PA-T)、GlicoNutrition Co.,Ltd.)
使用动物：C57BL/6小鼠雄8-12周龄约25g
实验将各组的样品数设为4-6，利用以下方法进行。
＜方法＞
(1)将10％戊巴比妥钠0.3mL筋中给予至小鼠的大腿部来进行全身麻醉。
(2)利用30G注射针对小鼠的角膜缘部下方进行穿孔。
(3)对于实验组的小鼠，将2μL以成为15mM的方式添加了NMDA(Sigma-aldrich)和以成为17％(w/v)的方式添加了酶处理橙皮苷的PBS给予至玻璃体内。另一方面，对于对照组的小鼠，将2μL以成为15mM的方式添加了NMDA(Sigma-aldrich)的PBS给予至玻璃体内。仅对小鼠单眼进行处理，另一只眼未进行处置。给予使用汉密尔顿注射器和32G注射针。
(4)对小鼠的结膜修整，滴入抗菌剂眼软膏。进行保温处置，等待清醒。
(5)给予至NMDA玻璃体内3天后，为了标记存活视网膜神经节细胞，而在麻醉下将2％荧光金(Fluorochrome,LLC)2μL注入小鼠脑的上丘中。
(6)在通过荧光金的标记7天后使小鼠颈椎脱臼，摘出眼球，用4％多聚甲醛·磷酸缓冲液(和光纯药工业株式会社、销售点代码163-20145)固定视网膜2小时后，用DPBS(Gibco、产品编号14190-144)进行清洗，用作为荧光用封入剂的VECTASHIELD MountingMedium(Vector Laboratories、商品代码H-1000)进行封入。
(7)通过荧光显微镜在1个视网膜上拍摄12处500像素的正方形。
(8)对用荧光金标记的细胞数进行计数而求出12处的平均数，将其作为每1平方毫米的存活视网膜神经节细胞数，求出了每组的平均值。
作为结果，将对照组的每1平方毫米的平均存活视网膜神经节细胞数作为1时的、实验组的每1平方毫米的平均存活视网膜神经节细胞数之比示于图4。实验组(图4中“酶处理橙皮苷”)中的每1平方毫米的平均存活视网膜神经节细胞数多于对照组(图4中“对照”)的每1平方毫米的平均存活视网膜神经节细胞数。由该试验可知，眼内给予酶处理橙皮苷抑制了由于NMDA给予所诱导的视网膜神经节细胞死亡。
将存活视网膜神经节细胞的照片示于图5。
试验5.通过眼内给予酶处理橙皮苷的视网膜神经节细胞保护效果的研究
对于试验物质，确认了由于NMDA给予所诱导的视网膜神经节细胞死亡的抑制作用。利用RT-PCR研究了视网膜神经节细胞特异性基因Rbpms、Brn3b和Brn3c的表达。
〔材料和方法〕
＜材料＞
试验物质：酶处理橙皮苷(商品名“αG-Hesperidin PA-T”(αG-橙皮苷PA-T)、GlicoNutrition Co.,Ltd.)
试验动物：C57BL/6小鼠雄8-12周龄约25g
实验将各组的样品数设为5-6，利用以下方法进行。
＜方法＞
(1)对于实验组的小鼠，使用汉密尔顿注射器和32G注射针将2μL以成为17％(w/v)的方式添加了酶处理橙皮苷和以成为15mM的方式添加了NMDA(Sigma-aldrich)的PBS给予至右眼玻璃体内。对于对照组的小鼠，使用汉密尔顿注射器和32G注射针将2μL以成为15mM的方式添加了NMDA(Sigma-aldrich)的PBS给予至右眼玻璃体内。对于无处置组的小鼠，对右眼玻璃体内未进行任何给予。
(2)在24小时后使小鼠颈椎脱臼，摘出眼球，用4％多聚甲醛·磷酸缓冲液(和光纯药工业株式会社)固定视网膜。
(3)使用miRNeasy Mini Kit(Qiagen)、进行总RNA提取。
(4)使用SuperScriptIII(Invitrogen)，进行cDNA合成。实时PCR使用Taqmanprobe法，使用热循环仪FAST7500(ABI)和Master Mix(ABI)。探针均购买ABI公司预先设计的探针来使用。以下示出使用的引物。Rbpms(Mm00803908_m1)、Brn3b(Mm00454754_S1)、Brn3c(Mm04213795_s1)、Gapdh(Mm99999915_g1)。
(5)对于各自的靶基因表达量，利用ΔΔCt法(比较Ct法)将Gapdh作为内源性对照进行校正来进行相对定量。对于各组，求出基因表达量的平均值和标准偏差。
作为结果，如图6所示，与对照组(图6中“PBS”)相比，实验组(图6中“Hes”)中作为视网膜神经节细胞特异性基因的Rbpms、Brn3b和Brn3c的表达量多。可认为其原因在于，实验组中酶处理橙皮苷抑制了由于NMDA给予所诱导的视网膜神经节细胞死亡，因此与对照组相比，抑制了视网膜神经节细胞特异性基因的表达量的减少。由该试验启示出通过眼内给予的酶处理橙皮苷的神经保护作用。
试验6.通过眼内给予酶处理橙皮苷的视网膜神经节细胞保护效果的研究
对于试验物质，确认了由于NMDA给予所诱导的视网膜神经节细胞死亡的抑制作用。使用抗RBPMS抗体评价了视网膜神经节细胞数。RBPMS是视网膜神经节细胞的标记蛋白。
〔材料和方法〕
＜材料＞
试验物质：酶处理橙皮苷(商品名“αG-Hesperidin PA-T”(αG-橙皮苷PA-T)、GlicoNutrition Co.,Ltd.)
试验动物：C57BL/6小鼠雄8-12周龄约25g
实验将各组的样品数设为5-6，利用以下方法进行。
＜方法＞
(1)向实验组的小鼠的右眼玻璃体内给予2μL以成为15mM的方式添加了NMDA(Sigma-aldrich)和以成为17％(w/v)的方式添加了酶处理橙皮苷的PBS。向对照组的小鼠的右眼玻璃体内给予2μL以成为15mM的方式添加了NMDA(Sigma-aldrich)的PBS。无处置组的小鼠的右眼玻璃体内未进行任何给予。使用汉密尔顿注射器和32G针进行给予。
(2)在24小时后，使小鼠颈椎脱臼，摘出右眼球，用4％多聚甲醛·磷酸缓冲液(和光纯药工业株式会社)固定视网膜。
(3)利用蔗糖置换和OCT包埋来制作视网膜的冷冻切片，将切片用以成为0.04％(v/v)的方式添加了Tween-20的PBS(以下称为“Tw-PBS”。)清洗5分钟×3次。
(4)在以成为0.5％(v/v)的方式添加了聚氧乙烯(10)辛基苯基醚(和光纯药工业株式会社、销售点代码168-11805)的Tw-PBS中使切片反应10分钟，然后用Tw-PBS清洗5分钟×3次。
(5)将在Tw-PBS中以成为10％(v/v)的方式添加了Donkey Serum(biowest、#S2170-100)而制得的封闭液以每1切片50μL的方式添加，在室温下静置1小时。
(6)在以上述封闭液：Anti-RBPMS抗体(Abcam ab194213)＝1：200的方式制得的溶液中、室温下将切片静置1小时(一次抗体反应)，然后用Tw-PBS清洗5分钟×3次。
(7)将切片在以上述封闭液：Donkey anti-Rabbit IgG(H+L)SecondaryAntibody,Alexa Fluor(注册商标)488conjugate(Molecular Probe、#A21206)＝1：500的方式制得的溶液中、在室温下静置1小时(二次抗体反应)，然后用Tw-PBS清洗5分钟×3次。
(8)用含DAPI封入剂(Vector Laboratories、产品名：VECTASHIELD MountingMedium with DAPI)对切片进行封入，以面涂的方式固定载玻片的周围。
(9)用荧光显微镜进行拍摄。测量视网膜整体的RBPMS表达细胞数，求出每组的平均值，将其作为每1只眼的存活视网膜神经节细胞数。
作为结果，将无处置组(图7中“无处置”)中每1只眼的存活视网膜神经节细胞数作为1时的、对照组(图7中“对照”)和实验组(图7中“酶处理橙皮苷”)中每1只眼的存活视网膜神经节细胞数之比示于图7。实验组中的每1只眼的存活视网膜神经节细胞数多于对照组的每1只眼的存活视网膜神经节细胞数。由此可知，眼内给予酶处理橙皮苷的抑制了由于NMDA给予所诱导的视网膜神经节细胞死亡。另外，图8是RBPMS表达细胞(免疫染色)的照片。
试验7.通过眼内给予酶处理橙皮苷的视网膜神经节细胞保护效果的研究
利用通过NMDA给予而诱导视网膜神经节细胞死亡的模型，研究了酶处理橙皮苷的电生理性功能评价。
〔材料和方法〕
＜材料＞
试验物质：酶处理橙皮苷(商品名“αG-Hesperidin PA-T”(αG-橙皮苷PA-T)、GlicoNutrition Co.,Ltd.)
使用动物：C57BL/6小鼠雄8-12周龄约25g
实验将各组的样品数设为8-10，利用以下方法进行。
＜方法＞
(1)以美托咪定(明治株式会社)0.6mg/kg的用量和氯胺酮(第一三共株式会社)36mg/kg的用量对小鼠进行腹腔内注射，从而进行麻醉。
(2)切开小鼠的头皮并使头盖骨露出，然后埋入微型电极(不锈钢盘头螺丝长度是M0.6×3.0mm)。对于电极，在以前囱为基准的2mm前方以1mm的深度埋入阴电极，在以前囱为基准的3.6mm后方距离正中2.3mm的位置的左右分别以1mm的深度埋入阳电极。
(3)接着，固定用的聚碳酸酯螺丝钉固定头顶部，最后用牙科用水泥(GC dentalproducts、产品名：GC Unifast III)覆盖露出的头盖骨和螺丝钉的根部进行固定。对于小鼠，手术时在热垫上一直进行保温，结束后以0.35mg/kg的用量腹腔内注射美托咪定拮抗药的阿替美唑(Meiji Seika Pharma Corporation)，使其从麻醉中恢复。
(4)在埋入微电极埋7天后，对于对照组，向小鼠的右眼玻璃体内给予2μL以成为15mM的方式添加了NMDA(Sigma-aldrich)的PBS，对于实验组，向小鼠的右眼玻璃体内给予2μL以成为15mM的方式添加了NMDA(Sigma-aldrich)和以成为17％(v/v)的方式添加了酶处理橙皮苷的PBS。左眼未进行处置。
(5)NMDA给予10天后，将2.5％苯肾上腺素和1.0％托吡卡胺对小鼠进行滴眼并使其散瞳，然后置于固定装置上，用头顶部的螺丝钉进行固定并使其成为能够自由移动的状态。
(6)将阳电极安装于小鼠的左右视皮层，将阴电极安装于小鼠的前头部，将接地电极(earth安装于小鼠的尾部，与记录系统(Mayo Corporation、产品名：诱发反应记录装置PuREC)连接。
(7)以两眼位于Ganzfeld圆顶(Mayo Corporation、产品名：MINIGUN)的球面的方式放置小鼠，通过LED刺激装置(Mayo Corporation、产品名：LED发光装置LS-100)照射刺激光，记录视觉诱发电位。最初在暗适应下以-7.0、-6.0、-5.0、-4.0、-3.0、-2.0、-1.0logcd.s/m2的强度的光刺激进行测定，然后以光适应下(白色光30cd/m2)以0、0.5、1.0、1.5、2.0log cd-s/m2进行测定。信号通过0.3Hz和50Hz的带通滤波器。
作为结果，如图9所示，对照组(图8中“对照”)的右眼(图8中“NMDA”)与无处置的左眼(图8中“无处置”)相比，由NMDA给予所诱导的视网膜神经节细胞死亡而使脑的电生理性功能消失；与此相对，实验组(图8中“酶处理橙皮苷”)的右眼(图8中“NMDA”)，与无处置的左眼(图8中“无处置”)保持了几乎同样的电生理性功能。由此启示出酶处理橙皮苷抑制了由于NMDA给予所诱导的视网膜神经节细胞死亡。
试验8.通过眼内给予酶处理橙皮苷的视网膜神经节细胞保护效果的研究
利用通过NMDA给予而诱导视网膜神经节细胞死亡的模型，研究了视力。
〔材料和方法〕
＜材料＞
试验物质：酶处理橙皮苷(商品名“αG-Hesperidin PA-T”(αG-橙皮苷PA-T)、GlicoNutrition Co.,Ltd.)
使用动物：C57BL/6小鼠雄8-12周龄约25g
实验将各组的样品数设为3-4，利用以下方法进行。
＜方法＞
(1)对于实验组，向小鼠的右眼玻璃体内给予2μL以成为15mM的方式添加了NMDA(Sigma-aldrich)和以成为17％(w/v)的方式添加了酶处理橙皮苷的PBS，对于对照组，向小鼠的右眼玻璃体内给予2μL以成为15mM的方式添加了NMDA(Sigma-aldrich)的PBS。无处置组的小鼠的右眼玻璃体内未进行任何给予。使用汉密尔顿注射器和32G针进行给予。
(2)在操作(1)的第11天后、第12天后和第13天后，对小鼠的视力进行1天1次、连续3天的测定，求出各组的平均视力。使用OptoMotry(CerebralMechanics Inc.)来测定视力。
作为结果，如图10所示，由视力的结果启示出，酶处理橙皮苷抑制了由于NMDA给予所诱导的视网膜神经节细胞死亡。
试验9.内质网应激抑制效果的研究
用衣霉素来刺激导入了利用衣霉素刺激来检测内质网应激的基因Trb3的视网膜细胞，研究了能够期待抑制内质网应激的成分。
〔材料和方法〕
＜材料＞
试验物质：将小麦蒸后干燥而成的物质(商品名“Kojimugi(注册商标)ST”、FreshFood Service co.,Ltd.制(以下示为“小麦”))、野葡萄(商品名“Nobudou Kansou EkisuF”、丸善制药株式会社制)、蓝锭果(商品名“Haskap PowderS”、日本新药株式会社制)、石榴籽(商品名“Zakuro shusi Kansou Ekisu”、Ask Chemicals Co.,Ltd.制)、甘草粉(商品名“Shokuhin Genryou yo Kanzoumatsu”、日本粉末株式会社制)、罗望子(商品名“Indiandate extract powder MF”、丸善制药株式会社制)、肉桂粉(商品名“Shokuhin Genryou yoKeihimatsu”、日本粉末株式会社制)
试验细胞：RGC-Trb3稳定细胞(stable cells)
试验培养基：向以成为10％的方式添加了胎牛血清的DMEM(Gibco、产品编号11995-073)中以成为2μg/mL的方式添加衣霉素(和光纯药工业株式会社)来制备。
＜方法＞
(1)将用以成为2.83×104cell/300μL方式的试验培养基制得的RGC-Trb3稳定细胞以每1个孔300μL的方式播种至24孔板中，在37℃、-CO2的条件下培养一夜。
(2)对于实验组，将试验物质5mg添加至500μL的试验培养基中制成1％后，在每1个孔中添加75μL用试验培养基稀释至最终浓度为0.25％的溶液，在37℃、-CO2的条件下培养24小时。对于对照组，在每1个孔中添加75μL以成为0.5％的方式在DMEM中添加了二甲基亚砜的溶液，在37℃、-CO2的条件下培养24小时。
(3)用DPBS(Gibco、产品编号14190-144)500μL清洗每1个孔后，去除DPBS，添加QIAzol Lysis Reagent(QIAGEN)700μL，用细胞刮棒刮取孔内的细胞并回收至艾本德(eppendorf)管。
(4)使用miRNeasy Mini Kit(QIAGEN)提取RNA后，使用SuperScriptIII(Invitrogen)进行cDNA合成。
(5)使用SuperScriptIII First-Strand Synthesis SuperMix用于qRT-PCR、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2×),No AmpErase UNG、引物mouse Trb3(LifeTechnologies、Mm00454879_m1)、Gapdh用引物(Life Technologies、Mm99999915_g1)实施实时PCR。
(6)对于Trb3表达量，利用ΔΔCt法(比较Ct法)以Gapdh作为内源性对照进行校正，进行了相对定量(各组n＝4)。对于对照组和实验组7种，分别求出Trb3表达量的平均值。
作为结果，将对照组中的平均Trb3表达量作为1时的、实验组7种中各自的平均Trb3表达量的相对值示于图11。与对照组相比，实验组全部7种的平均Trb3表达量为低值。由此可知，Trb3是通过内质网应激诱导表达的基因，因此，在实验组中具有内质网应激抑制效果。因此，启示出所有的试验物质具有视神经保护作用。
[基于规则26的补充04.11.2016]
Figure BDA0002644174670000261
Figure BDA0002644174670000262
受理官厅记入栏
Figure BDA0002644174670000263
国际事务局记入栏
Figure BDA0002644174670000264

Claims (9)

1.罗望子作为有效成分在制造用于抑制视神经细胞死亡、或抑制视网膜神经节细胞死亡、或延缓人视力丧失加剧的组合物中的应用。
2.罗望子作为有效成分在制造用于保护视神经细胞的组合物中的应用。
3.罗望子作为有效成分在制造青光眼的预防用或治疗用组合物中的应用。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，其中，进一步含有橙皮苷作为有效成分。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的应用，其中，所述组合物包含：在体重60kg的成人摄取的情况下，每1次的摄取量为0.0001～3.3g的量的有效成分。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的应用，其中，所述组合物包含：在体重60kg的成人摄取的情况下，每1天的摄取量为0.0003～10g的量的有效成分。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的应用，其中，使对象每天摄取所述组合物。
8.根据权利要求1～4中任一项所述的应用，其中，所述组合物为经口给予用或眼内给予用药物。
9.根据权利要求1～4中任一项所述的应用，其中，所述组合物为食品的形态。
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