CN111808936A - 基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法及应用 - Google Patents

基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法及应用，属于玉米叶部病原真菌检测技术领域。具体方法如下：(1)取玉米植株叶片，富集叶部微生物，提取微生物总DNA；(2)PCR扩增真菌ITS序列，高通量测序；(3)将高通量测序结果根据97％阈值划分OTU，进行物种鉴定，统计玉米叶部病原真菌的种类和序列数量；(4)以每一属病原真菌序列在总序列中的比例作为属水平上的丰度，将丰度大于0.5％的列为高丰度病原真菌，小于0.5％的列为低丰度病原真菌；(5)病原真菌丰度与病害病情指数呈正相关，根据病原真菌丰度预测后期病害发生种类和程度。本发明方法检测准确，效率高，在玉米叶部病害防治中具有重要价值。

Description

基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法及应用
技术领域
本发明涉及玉米叶部病原真菌检测技术领域，更具体的说是涉及基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法及应用。
背景技术
近年来，随着全球变暖，玉米栽培制度变革(如免耕和秸秆还田)，使得土壤中玉米病原菌数量增加，玉米病害发生逐年加重；其中，玉米叶部病害会影响光合作用，导致叶片枯死，特别是玉米灌浆期发病会导致籽粒不饱满，严重影响玉米产量和品质。
玉米叶部病害种类较多，如玉米大斑病(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病(Bipolaris maydis)、玉米锈病(Pucciniapolysora)、玉米弯孢叶斑病(Curvularialunata)、玉米灰斑病(Cercospora zeaemaydis)、玉米褐斑病(Physoderma maydis)等，均为真菌性病害。玉米大斑病是最为常见玉米叶部病害，严重时病斑融合，造成整个叶片枯死，可导致减产12-20％。玉米小斑病严重时多数病斑连在一起，造成叶片枯死，一般造成减产15-20％，严重时减产达50％以上。玉米锈病近年有危害加重的趋势，发病时间提前，叶片因病枯死，感病品种一般减产10％-20％。玉米弯孢叶斑病会造成叶片提早干枯，一般减产20％-30％，严重地块减产50％。玉米灰斑病是玉米产区普遍发生的叶部病害之一，引起的损失可导致减产5-10％。玉米褐斑病一般造成减产10％左右，严重时减产30％以上。在田间，多种玉米叶部病害可同时发生，如在一张叶片上发现玉米大、小斑、弯孢叶斑病、灰斑病、锈病和褐斑病，无疑会加大病害诊断和防治难度，因此，需要对玉米叶部病害进行早期诊断，以利于病害的有效防控。
培养法和显微镜检是常用的病原菌检测方法，然而培养法周期较长，不能及时有效获得检测结果；叶片表面存在大量微生物，而病原真菌数量较少，因此采用培养法很难有效分离出病原真菌。显微镜检必须依赖发病部位产生病原菌菌丝和孢子，需要病害发生到一定程度，显然不能满足病害早期诊断的要求。
随着分子生物学技术发展，半巢式多聚酶链反应(PCR)和环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplication,LAMP)应用于病原菌检测，通过设计病原菌的特异性引物，快速检测病原菌。然而，以特异性引物为基础的检测方法只能检测一种病原菌，不能做到同时检测多种病原菌。
因此，如何针对玉米叶部病原菌提供一种高效、快速、全面的早期检测方法成为本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明提供了基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法，其检测准确，效率高，在玉米叶部病害防治中具有重要价值。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法，包括如下步骤：
(1)取玉米植株叶片，富集叶部微生物，提取微生物总DNA；
(2)以步骤(1)提取的微生物总DNA为模板，PCR扩增真菌ITS序列，然后采用Illumina的PE300平台进行高通量测序；
(3)将高通量测序结果根据97％阈值划分操作分类单元OTU，进行物种鉴定，统计玉米叶部病原真菌的种类和序列数量；
(4)以每一属病原真菌序列在总序列中的比例作为属水平上的丰度，将丰度大于0.5％的列为高丰度病原真菌，小于0.5％的列为低丰度病原真菌；
(5)病原真菌丰度与病害病情指数呈正相关，根据病原真菌丰度预测后期病害发生种类和程度。
本发明检测方法基于高通量测序技术针对玉米叶部真菌的ITS进行测序，具有较强的深度和广度，结果准确性高；病原真菌丰度和病情指数显著正相关，因此，可以用丰度预测病害发生状况，且结果可靠。此外，本发明能够同时测定玉米叶部存在的多种病原真菌种类和数量，进行更为全面的分析，相比单纯PCR或LAMP只检测一种病原菌的方法，效率更高。
优选地，步骤(1)中于大喇叭口期取玉米植株叶片。
大喇叭口期为玉米营养生长转向生殖生长的时期，此时玉米叶片分泌物多，叶际微生物种类多，玉米消耗营养较大，抗病性较弱，一旦发病，会导致玉米产量严重受损。
优选地，步骤(1)中富集叶部微生物具体为：
使用洗脱溶液对玉米植株叶片表面微生物进行超声洗脱，获得洗脱液；
对洗脱液进行抽滤富集，使用洗脱溶液洗涤、离心，获得沉淀，用于微生物总DNA的提取。
优选地，洗脱溶液为添加有吐温20的磷酸盐缓冲液，吐温20质量分数为2％。
优选地，步骤(1)中提取获得的微生物总DNA浓度大于10ng/μL，总量大于1μg，OD260/280＝1.8-2.0，且DNA无降解、无污染。
上述基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法在玉米叶部病害防治中的应用。
上述基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法在抗病玉米选育中的应用。
综上所述，本发明方法适用于检测玉米叶部病原真菌，检测效率高、检测结果准确；通过早期检测预测玉米叶部病害发生状况，对于玉米叶部病害防治具有重要的实用价值，也为抗病玉米的选育提供了早期筛选的技术支持。
附图说明
图1所示为PCR电泳图；
图2所示为稀缺性曲线；
图3所示为属水平玉米叶部真菌群落多样性；
图4所示为不同品种玉米中6种病原菌的属水平丰度。
具体实施方式
实施例
试验用玉米品种：黄早四、B73，综合抗病性较差；郑单958和Mo17，综合抗病性较强。
玉米种植于中国农业科学院植物保护研究所新乡试验站实验田。该地处于黄淮海玉米主产区核心位置，玉米病害种类多，发病较重，具有较强代表性。
样品采集时间为8月中旬，玉米处于大喇叭口期。在田间，每个玉米品种随机选择10株，每株玉米剪取一张雌穗上部叶片，带回实验室。
将每个品种的10张叶片混合，置于洗脱溶液中，超声(47kHz)洗脱2min，涡旋30s，洗脱叶片表面微生物；洗脱溶液为添加有2％(质量分数)吐温20的PBS缓冲液(KH2PO40.24g/L，Na2HPO41.44g/L，NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，pH 7.4)。
洗脱后采用抽滤法将洗脱液中的微生物富集到滤膜上，然后将滤膜放入50mL无菌离心管中，加入洗脱溶液20mL，涡旋震荡5min，将滤膜上的微生物洗下；取出滤膜，悬浮液8000rpm离心5min，弃上清，加入2mL洗脱溶液，重悬离心管底部沉淀，然后将悬浮液转入2mL离心管，10000rpm离心2min，弃上清，保留底部沉淀，沉淀包含玉米叶部微生物。
采用土壤DNA提取试剂盒对富集得到的叶部微生物进行DNA提取(富集的叶部微生物沉淀中含有土壤灰尘颗粒，采用该试剂盒提取叶部微生物DNA，可去除土壤腐殖酸对DNA的影响)。提取得到的叶部微生物DNA浓度大于10ng/μL，总量大于1μg，OD260/280＝1.8～2.0，且DNA无降解、无污染。
将每个品种的玉米叶部微生物DNA分为三份，送北京美吉生物科技有限公司测序：
首先，采用PCR扩增叶部真菌ITS基因，引物为
ITS1F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'，
ITS2R：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'；
20μL反应体系：10×Buffer2μL，2.5mM dNTPs 2μL，上游引物(5μM)0.8μL，下游引物(5μM)0.8μL，rTaqPolymerase(TaKaRa)0.2μL，BSA 0.2μL，模板DNA 10ng，补ddH2O至20μL；
PCR仪：ABI
Figure BDA0002623825970000051
9700型；PCR反应参数：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，25个循环；72℃稳定10分钟，10℃保存；
2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，3μL上样检测电泳检测PCR产物质量，如图1所示，PCR产物目的条带大小正确，浓度合适，可进行后续高通量测序。
测序平台为Illumina的PE300，每个样品至少提供3万条测序数据，平均5万条测序数据。所得序列经生物信息学流程去除低质量序列(序列过短或过长，错配等)，保留高质量序列(长度约300bp)，然后以97％阈值划分OTU(操作分类单元)，在UNITE(https://unite.ut.ee)和NCBI数据库进行比对分析，对OTU进行物种鉴定，将每一属病原真菌序列在总序列中的比例作为属水平上的丰度。高通量测序采用部分ITS序列，长度较短，属水平上鉴定物种的准确度最高，对后续的病害预测也最准确。
每个品种的每个样本随机抽取若干序列绘制稀缺型曲线，如图2所示，随着序列数量的增加，OTU数量逐渐上升，然后呈平滑趋势，表明测序深度足够，所得结果具有代表性。
综合每个品种的三份测序数据，在属水平上，筛选玉米叶部病害病原真菌的物种信息，分析其丰度特征。如图3所示，在属水平上4个玉米品种叶部真菌以链格孢属为优势真菌类群，其次是未分类真菌和青霉属真菌，表明这几类真菌在玉米叶部真菌群落中起着重要作用。
从高通量测序数据中筛选到玉米的病原真菌包括：弯孢属(玉米弯孢叶斑病菌)、突脐蠕孢属(玉米大斑病菌)、尾孢属(玉米灰斑病菌)、平脐蠕孢属(玉米小斑病菌)、黑粉菌属(玉米瘤黑粉菌)，未发现玉米锈病菌和玉米褐斑病菌。玉米锈病菌未检测到可能由于试验地玉米锈病发病较轻有关。玉米褐斑病主要发生在下部叶片，而本研究采用玉米上部叶片，可能导致未发现玉米褐斑病的主要原因。总体来看，玉米病原真菌在玉米叶部真菌群落中比例较低，表明玉米病害早期病原菌数量少。
后期田间调查各病原真菌引起的病害病情指数(调查方法同“王晓鸣，戴法超，廖琴.玉米病虫害田间手册[M].北京：中国农业科技出版社，2002”)，并与高通量测序结果中病原真菌丰度进行相关性分析，评价高通量测序结果与实际病情指数的相关性，从而判定是否通过高通量测序病原菌的丰度预测病害发生程度。
如图4所示，黄早四和B73的弯孢属(玉米弯孢叶斑病菌)、突脐蠕孢属(玉米大斑病菌)、尾孢属(玉米灰斑病菌)病原真菌丰度较高，比例分别为0.860％、0.812％、0.539％和0.632％、0.536％、0.629％，表明玉米叶片上这3个属病原真菌数量多；后期田间调查也发现，玉米弯孢叶斑病、玉米灰斑病菌和玉米大斑病发生较重，黄早四和B73病情指数分别为28.8、30.6、29.3和23.7、21.8、22.5；这两个品种也是较为感病品种。
而抗病品种郑单958和Mo17叶片上这三种病原真菌属水平丰度明显低于感病品种，比例分别为0.307％、0.260％、0.082％和0.295％、0.082％、0.148％；玉米小斑病菌、玉米炭疽病菌和玉米瘤黑粉菌属水平丰度均小于0.5％。后期田间调查发现，郑单958和Mo17的玉米弯孢叶斑病、玉米大斑病、玉米灰斑病病情指数也较低，分别为6.8、8.1、6.8和8.8、9.8、8.1。因此，将丰度大于0.5％的病原真菌列为高丰度病原真菌，需要重点防控，而丰度小于0.5％为低丰度的病原真菌。
综合四个玉米品种的病情指数与序列数量，采用SPSS软件进行相关性分析，发现玉米弯孢叶斑病、玉米大斑病、玉米灰斑病3种病害的病情指数与序列数量的相关系数为0.858，可见，病原菌丰度与病情指数之间存在正相关，可以在一定程度上预测病害发生。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取玉米植株叶片，富集叶部微生物，提取微生物总DNA；
(2)以步骤(1)提取的微生物总DNA为模板，PCR扩增真菌ITS序列，然后采用Illumina的PE300平台进行高通量测序；
(3)将高通量测序结果根据97％阈值划分操作分类单元OTU，进行物种鉴定，统计玉米叶部病原真菌的种类和序列数量；
(4)以每一属病原真菌序列在总序列中的比例作为属水平上的丰度，将丰度大于0.5％的列为高丰度病原真菌，小于0.5％的列为低丰度病原真菌；
(5)病原真菌丰度与病害病情指数呈正相关，根据病原真菌丰度预测后期病害发生种类和程度。
2.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法，其特征在于，
步骤(1)中于大喇叭口期取玉米植株叶片。
3.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法，其特征在于，
步骤(1)中富集叶部微生物具体为：
使用洗脱溶液对玉米植株叶片表面微生物进行超声洗脱，获得洗脱液；
对洗脱液进行抽滤富集，使用洗脱溶液洗涤、离心，获得沉淀，用于微生物总DNA的提取。
4.根据权利要求3所述的基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法，其特征在于，
所述洗脱溶液为添加有吐温20的磷酸盐缓冲液，吐温20质量分数为2％。
5.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法，其特征在于，
步骤(1)中提取获得的微生物总DNA浓度大于10ng/μL，总量大于1μg，OD260/280＝1.8-2.0，且DNA无降解、无污染。
6.权利要求1-5任意一项所述的基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法在玉米叶部病害防治中的应用。
7.权利要求1-5任意一项所述的基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法在抗病玉米选育中的应用。
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