CN105671149A - 用于籼稻地方品种遗传完整性分析的引物组合及其应用 - Google Patents

用于籼稻地方品种遗传完整性分析的引物组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及遗传完整性分析引物，具体公开了用于籼稻地方品种遗传完整性分析的SSR分子标记核心引物及其应用。本发明以云南地方稻种为材料，通过大量实验研究，筛选出了一批可用于籼稻地方品种遗传完整性分析的SSR核心引物，建立了用于籼稻地方品种遗传完整性分析的引物组合，并基于此，建立了分析方法。本发明提供的分析方法适用于籼稻地方品种种质遗传完整性的分析。所筛选的引物组合和最少150个单株的群体量，为准确分析籼稻地方品种种质保存和繁殖更新过程中遗传完整性检测提供了标准方法。

Description

用于籼稻地方品种遗传完整性分析的引物组合及其应用
技术领域
本发明涉及遗传完整性分析引物，具体地说，涉及用于籼稻地方品种遗传完整性分析的SSR分子标记核心引物。
背景技术
种质是指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。种质库保存的种质材料一般可分为两类：遗传上同质种质(geneticallyhomogeneousaccessions)，指在一份种质内，其个体之间基本上具有相同的遗传结构，如自花授粉作物育成品种、异花授粉作物自交系等；遗传上异质种质(geneticallyheterogeneousaccession)，指在一份种质内，其个体之间不具有相同的遗传结构，如野生种、原始地方品种、异花授粉的栽培品种等。
遗传完整性是指群体的遗传结构得到完全的保持，包括基因型频率分布及等位基因频率分布和其原始群体一样，保持不变。维持种质的遗传完整性就是在繁殖过程中要有最大的遗传相似性，在保存过程中表现最低程度的遗传变异。
水稻地方品种蕴藏着丰富的抗逆、抗病虫等优异基因，在水稻育种中具有重要的作用。云南是公认的亚洲栽培稻的遗传多样性中心，部分云南地方品种稻种资源已经在育种和生产中得到应用，并取得一定成效。
准确评价地方品种稻种资源的遗传多样性和完整性，对于其在育种、生产中的应用具有重要的作用。传统方法是采用表型多样性鉴定法，即通过调查多项农艺性状，反映种质的遗传多样性和完整性。但是该方法容易受气候、人为等因素影响。近年来分子标记技术在种质遗传多样性和完整性研究中得到越来越广泛的应用。分子标记技术中有多项技术参数会影响评价结果的可靠性和准确性。以SSR分子标记为例，其关键的技术瓶颈包括引物的筛选、群体量的大小等。
因此，亟需获得可用于籼稻地方品种遗传完整性分析的SSR核心引物，并建立籼稻地方品种遗传完整性分析方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于籼稻地方品种遗传完整性分析的引物组合及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一套用于籼稻地方品种遗传完整性分析的SSR核心引物组合与方法，所述方法是基于SSR分子标记原理，采用经过前期大量筛选工作所获得的16对多态性核心引物，对150～200个单株的籼稻地方品种基因组DNA进行扩增，利用生物分析软件统计分析群体的遗传多样性指数，反映群体的遗传完整性保持情况。
第一方面，本发明提供用于籼稻地方品种遗传完整性分析的引物组合，其由如下16个引物对组成：
SSR01：正向引物如SEQIDNO.1所示；反向引物如SEQIDNO.2所示；
SSR02：正向引物如SEQIDNO.3所示；反向引物SEQIDNO.4所示；
SSR03：正向引物如SEQIDNO.5所示；反向引物如SEQIDNO.6所示；
SSR04：正向引物如SEQIDNO.7所示；反向引物如SEQIDNO.8所示；
SSR05：正向引物如SEQIDNO.9所示；反向引物如SEQIDNO.10所示；
SSR06：正向引物如SEQIDNO.11所示；反向引物如SEQIDNO.12所示；
SSR07：正向引物如SEQIDNO.13所示；反向引物如SEQIDNO.14所示；
SSR08：正向引物如SEQIDNO.15所示；反向引物如SEQIDNO.16所示；
SSR09：正向引物如SEQIDNO.17所示；反向引物如SEQIDNO.18所示；
SSR10：正向引物如SEQIDNO.19所示；反向引物如SEQIDNO.20所示；
SSR11：正向引物如SEQIDNO.21所示；反向引物如SEQIDNO.22所示；
SSR12：正向引物如SEQIDNO.23所示；反向引物如SEQIDNO.24所示；
SSR13：正向引物如SEQIDNO.25所示；反向引物如SEQIDNO.26所示；
SSR14：正向引物如SEQIDNO.27所示；反向引物如SEQIDNO.28所示；
SSR15：正向引物如SEQIDNO.29所示；反向引物如SEQIDNO.30所示；
SSR16：正向引物如SEQIDNO.31所示；反向引物如SEQIDNO.32所示。
上述16对核心引物是从550对SSR引物中，经筛选获得。引物筛选方法为，以200个单株的籼稻地方品种“香谷”DNA为模板，分别用550对SSR引物进行扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶银染、统计扩增结果。针对每对引物在200个单株中的扩增结果，剔除不具备多态性的引物，保留具有多态性的引物，最终筛选获得16对多态性核心引物。筛选得到的引物相对未被选择引物，在体现种质的遗传多样性方面具有明显优势。
第二方面，在上述引物组合存在的前提下，任何含有该引物组合的产品均在本发明的保护范围内，例如含有上述引物组合的试剂或试剂盒。原因在于，其在应用时利用的是本发明所述引物组合的特殊性，且得到的结果取决于本发明所述引物组合的特殊性。
第三方面，本发明提供前述引物组合在分析籼稻地方品种遗传完整性方面的应用。由于前述引物组合能够针对籼稻地方品种的遗传多样性进行鉴定，所得结果可用于判断种质遗传完整性的保持情况。因此，本发明提供前述引物组合可用于籼稻地方品种遗传完整性分析。
第四方面，本发明提供一种分析籼稻地方品种遗传完整性的方法，以待分析样本的基因组DNA为模板，利用前述引物组合进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，利用生物学软件对电泳结果进行遗传结构分析。
进一步地，所述待分析样本的样本量(群体量)为150～200。原因在于，经实验统计发现，群体量越小，特异性单株平均频率越低，其标准偏差和变异系数很大，表明采用过小的群体量，取样误差十分明显。群体量增加至150单株时，特异单株频率逐步稳定趋近10％，变异系数控制在15％以内，基本可以代表200单株的多样性。因此在进行籼稻地方品种遗传完整性分析时，需要保证150株以上的群体量。
作为优选，所述基因组DNA提取自籼稻叶片，因幼嫩叶片中次生代谢物质含量低，易于获得高质量DNA，优选幼嫩叶片。
优选地，所述种子来自云南籼稻地方品种。
作为优选，为了更好的观察扩增结果，可采用6％聚丙烯酰氨凝胶电泳分离扩增产物，电泳结束后采用银染法染色。
更进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.0μL，2.5mmol/LdNTP1.5μL，5U/μLTaq0.5μL，2μmol/LSSR引物2.0μL，20ng/μLDNA2.0μL，ddH2O12.0μL。
所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸10min。待温度降至10℃后，于4℃冰箱内保存备用。
基于上述优选方案，本发明提供一个完整具体的实施方式，包括如下步骤：
(1)采用CTAB法提取籼稻地方品种待分析样本叶片的基因组DNA，样本为150～200单株籼稻；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，用前述引物组合进行PCR扩增；
(3)采用6％聚丙烯酰氨凝胶电泳对扩增产物进行分离，电泳结束后采用银染法染色；
(4)利用生物学软件分析电泳结果。
其中，所述步骤(4)具体为：统计扩增谱带类型，参照DNAmarker(pBR322)估计片段大小。使用POPGENE等软件对不同籼稻地方品种种质群体进行遗传结构分析，比较不同种质等位基因数、有效等位基因数、基因多样性指数、香农指数等指标。采用SPSS或SAS等软件，分析群体间各指数差异，若无显著差异则认为群体遗传完整性得到有效保持，若差异达到显著水平，则认为群体遗传完整性发生了改变。
本发明的有益效果在于：
本发明以云南地方稻种为材料，通过大量实验研究，筛选出了一批可用于籼稻地方品种遗传完整性分析的SSR核心引物，建立了用于籼稻地方品种遗传完整性分析的引物组合，并基于此，建立了分析方法。
本发明提供的分析方法适用于籼稻地方品种种质遗传完整性的分析。所筛选的引物组合和最少150个单株的群体量，为准确分析籼稻地方品种种质保存和繁殖更新过程中遗传完整性检测提供了标准方法。
附图说明
图1为本发明实施例1中引物SSR02对部分单株“香谷”的扩增结果。左起第5泳道为Marker，其它泳道为“香谷”单株DNA扩增结果。
图2为本发明实施例1中不同大小群体量多态性单株差异。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1籼稻地方品种种质的遗传完整性分析
1.实验材料
以云南籼稻地方品种“香谷”为试材，种子育苗后移栽至大田进行常规管理。随机选取200个单株，取其幼嫩叶片，-20℃冻存备用。
2.基因组DNA提取：采用CTAB法分别提取200个单株叶片的基因组DNA。
3.引物合成及筛选
(1)合成引物：参考水稻SSR引物序列，随机选择550对引物，经生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。
(2)引物筛选：采用200个单株DNA模板，利用全部550对引物进行扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶银染，根据扩增结果，剔除不具多态性的引物，共筛选出16对特异多态性引物，其中引物SSR02的扩增结果见图1，引物的序列信息见表1：
表1籼稻地方品种SSR特异多态性引物序列
(3)适宜样本量：以引物SSR02的扩增结果为例，统计发现，200单株中有180单株的扩增结果完全一样(主带型)，另外20单株DNA扩增结果与主带型不同，将这些单株称为特异单株，如图1中左起第18、19、27和29等泳道。200单株群体量中，特异单株频率为10％。将200株群体随机分成10株、20株、......190株不同大小群体，统计每个群体量特异性单株频率，统计20次计算平均值、标准偏差和变异系数。结果发现随着群体量增加特异性单株频率逐渐增加(图2)。群体量越小，特异性单株平均频率越低，其标准偏差和变异系数很大，表明采用过小的群体量，取样误差十分明显。群体量增加至150单株时，特异单株频率逐步稳定趋近10％，变异系数控制在15％以内，基本可以代表200单株的多样性。因此认为进行籼稻地方品种遗传完整性分析时，需要保证150株以上的群体量。
实施例2不同生活力群体籼稻地方品种种质的遗传完整性分析
1.实验材料
以云南籼稻地方品种“香谷”为试材。采集籼稻地方品种种子，采用高温高湿方法老化种子获得5个发芽率群体(具体见表2)，每个群体取一定量种子育苗后移栽至大田进行常规管理。每个群体随机选取200个单株，取其幼嫩叶片，-20℃冻存备用。
2.基因组DNA提取：采用CTAB法分别提取200个单株叶片的基因组DNA。
3.不同生活力群体遗传完整性比较：采用上述16对核心引物，对籼稻地方品种5个不同生活力群体的基因组DNA进行扩增，根据扩增结果分别计算各项遗传参数，结果发现对照群体(发芽率>90％)的各个群体的等位基因数、有效等位基因数、基因多样性指数、香农指数各项指数均最高；发芽率80-85％和60-70％的群体的各项指标与对照群体均无明显差别；而发芽率50％及以下群体的所有指标均与高发芽率群体出现显著差异(表2)。分析结果表明，较高生活力的群体(发芽率60％以上)的遗传完整性与对照群体一致，而较低生活力群体(发芽率≤50％)的遗传完整性明显改变。
表2应用SSR标记对香谷5个不同发芽率水平的POPGENE分析
*代表5％水平上显著差异；**代表1％水平显著差异。
实施例3用于籼稻地方品种遗传完整性分析的引物组合
SSR01：正向引物SEQIDNO.1gaagtgtgatcactgtaacc
反向引物SEQIDNO.2tacagtggacggcgaagtcg
SSR02：正向引物SEQIDNO.3tcgaagccatccaccaacgaag
反向引物SEQIDNO.4tccgtacgccgacgaggtcgag
SSR03：正向引物SEQIDNO.5gagggagaaaggtggacatg
反向引物SEQIDNO.6tgtgctccttgggaagaaag
SSR04：正向引物SEQIDNO.7gtcccctccacccaattc
反向引物SEQIDNO.8tcgtctactgttggctgcac
SSR05：正向引物SEQIDNO.9accctctccgcctcgcctcctc
反向引物SEQIDNO.10ctcctcctcctgcgaccgctcc
SSR06：正向引物SEQIDNO.11agtaacgagcatagcaggcg
反向引物SEQIDNO.12gcaaagccttcaggaatcag
SSR07：正向引物SEQIDNO.13cactccagaacccagtagtagc
反向引物SEQIDNO.14acccaacaactggtagacgg
SSR08：正向引物SEQIDNO.15ctgtgtcgaaaggctgcac
反向引物SEQIDNO.16cagtcctgtgttgcagcaag
SSR09：正向引物SEQIDNO.17cttcggcgccgtcatcaaggtg
反向引物SEQIDNO.18cgttgagcagcgcgacgttgac
SSR10：正向引物SEQIDNO.19acgcacaagcagatgatgag
反向引物SEQIDNO.20gggagaagacgaatgtttgc
SSR11：正向引物SEQIDNO.21ccatcctccaccgcctctcg
反向引物SEQIDNO.22tggaggaaggaaaggggacg
SSR12：正向引物SEQIDNO.23ccaatcggagccaccggagagc
反向引物SEQIDNO.24cacatcctccagcgacgccgag
SSR13正向引物SEQIDNO.25gtaatcgatgctgtgggaag
反向引物SEQIDNO.26gagtcatgtgatagccgatatg
SSR14正向引物SEQIDNO.27cacatggcaccaacctcc
反向引物SEQIDNO.28gccaagtcattcactactctgg
SSR15：正向引物SEQIDNO.29cgcagttgtggatttcagtg
反向引物SEQIDNO.30tgctcaacgtttgactgtcc
SSR16：正向引物SEQIDNO.31agaggagggttcagactatgg
反向引物SEQIDNO.32accttgaactcaggtgtctcc。
实施例4用于籼稻地方品种遗传完整性分析的试剂或试剂盒
所述试剂和试剂盒含有实施例3所述的引物组合。
所述试剂盒还可包括其他本领域其他常规组分。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于籼稻地方品种遗传完整性分析的引物组合，其特征在于，其由如下16个引物对组成：
SSR01：正向引物如SEQIDNO.1所示；反向引物如SEQIDNO.2所示；
SSR02：正向引物如SEQIDNO.3所示；反向引物SEQIDNO.4所示；
SSR03：正向引物如SEQIDNO.5所示；反向引物如SEQIDNO.6所示；
SSR04：正向引物如SEQIDNO.7所示；反向引物如SEQIDNO.8所示；
SSR05：正向引物如SEQIDNO.9所示；反向引物如SEQIDNO.10所示；
SSR06：正向引物如SEQIDNO.11所示；反向引物如SEQIDNO.12所示；
SSR07：正向引物如SEQIDNO.13所示；反向引物如SEQIDNO.14所示；
SSR08：正向引物如SEQIDNO.15所示；反向引物如SEQIDNO.16所示；
SSR09：正向引物如SEQIDNO.17所示；反向引物如SEQIDNO.18所示；
SSR10：正向引物如SEQIDNO.19所示；反向引物如SEQIDNO.20所示；
SSR11：正向引物如SEQIDNO.21所示；反向引物如SEQIDNO.22所示；
SSR12：正向引物如SEQIDNO.23所示；反向引物如SEQIDNO.24所示；
SSR13：正向引物如SEQIDNO.25所示；反向引物如SEQIDNO.26所示；
SSR14：正向引物如SEQIDNO.27所示；反向引物如SEQIDNO.28所示；
SSR15：正向引物如SEQIDNO.29所示；反向引物如SEQIDNO.30所示；
SSR16：正向引物如SEQIDNO.31所示；反向引物如SEQIDNO.32所示。
2.含有权利要求1所述引物组合的试剂或试剂盒。
3.权利要求1所述的引物组合在分析籼稻地方品种遗传完整性方面的应用。
4.一种分析籼稻地方品种遗传完整性的方法，其特征在于，以待分析样本的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组合进行PCR扩增，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，利用生物学软件对电泳结果进行遗传结构分析。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待分析样本的样本量为150～200。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因组DNA提取自籼稻叶片，优选幼嫩叶片。
7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，采用6％聚丙烯酰氨凝胶电泳分离扩增产物，电泳结束后采用银染法染色。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.0μL，2.5mmol/LdNTP1.5μL，5U/μLTaq0.5μL，2μmol/LSSR引物2.0μL，20ng/μLDNA2.0μL，ddH2O12.0μL。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸10min。
10.根据权利要求4～6或权利要求8～9任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用CTAB法提取籼稻地方品种待分析样本叶片的基因组DNA，样本为150～200单株籼稻；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增；
(3)采用6％聚丙烯酰氨凝胶电泳对扩增产物进行分离，电泳结束后采用银染法染色；
(4)利用生物学软件分析电泳结果。
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