CN111803541A - 远志属植物中总口山酮的提取纯化方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了远志属植物中总口山酮的提取纯化方法及应用，将远志风干粉碎过筛；置于平底烧瓶中，加入乙醇，水浴加热回流提取两次，提取液过滤后合并，减压浓缩回收乙醇，得浸膏；称取大孔吸附树脂，湿法装柱，取浸膏样品溶解上样，进行动态吸附2次，待吸附完全后，用水洗脱至洗脱液不浑浊，再用的30％体积浓度乙醇洗脱至洗脱液不浑浊，最后用90％乙醇洗脱，收集洗脱液，在60℃下回收乙醇后，减压浓缩、干燥；用水和乙酸乙酯充分溶解得到的样品，然后进行萃取2‑4次，取乙酸乙酯部分，浓缩旋干得纯化的总口山酮。该方法操作简单、省时、成本低、无污染。

Description

远志属植物中总口山酮的提取纯化方法及应用
技术领域
本发明属于药用植物提取及纯化技术领域，涉及一种远志属植物中总口山酮的提取纯化方法及应用。
背景技术
远志属植物有顺气化痰、活血止痛、补心安神，用于心悸、失眠多梦、咳嗽痰少、虚痨气弱等功效。到目前为止，已从远志属植物中分离得到数百个单体化合物，其中以口山酮类、皂苷类以及糖脂类化合物为主。远志属多数口山酮化合物具有酚性官能团，所以表现出广泛的生物和药理活性，主要表现在：止痛、抗真菌、MAO抑制以及抗突变、抗癌、兴奋中枢神经系统等方面，以往人们关注的重点是远志皂苷，但目前研究结果已表明，口山酮类成分也在一定程度上代表了远志的生理活性。
现有提取技术主要是利用超临界CO2萃取，硅胶柱层析、高压液相色谱进行纯化，使得设备要求较高，操作复杂，耗时长；此外，现有应用方面口山酮主要用于防治食管癌、抗抑郁与抗老年痴呆症、抗菌药物、防治宫颈癌、胰腺癌和肺癌、糖尿病及由糖尿病所引起的并发症、抗肝纤维化和肝硬化、抑制乙型肝炎病毒、抗肿瘤、抑制神经元细胞的凋亡等方面；并未发现口山酮具有治疗和预防痛风的作用。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供一种远志属植物中总口山酮的提取纯化方法，操作简单、省时、成本低、无污染。
本发明的另一目的在于口山酮在制备用于治疗和/或预防通风的药物中的应用。
本发明所采用的技术方案是，远志属植物中总口山酮的提取纯化方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
S1，将新鲜的远志风干，用粉碎机粉碎过筛，得到远志粉末；
S2，称取一定量S1中的远志粉末，置于平底烧瓶中，加入乙醇，水浴加热回流提取两次，提取液过滤后合并，减压浓缩回收乙醇，得浸膏；
S3，称取一定量的大孔吸附树脂，湿法装柱，取S2中浸膏样品溶解上样，进行动态吸附2次，待吸附完全后，用水洗脱至洗脱液不浑浊，弃去洗脱液，再用的30％体积浓度乙醇洗脱至洗脱液不浑浊，弃去洗脱液，最后用90％乙醇洗脱，收集洗脱液，在60℃下回收乙醇后，减压浓缩、干燥；
S4，用一定比例的水和乙酸乙酯充分溶解S3中得到的样品，然后进行萃取2-4次，取乙酸乙酯部分，浓缩旋干得纯化的总口山酮。
进一步的，所述S1中，用粉碎机粉碎过40-80目筛。
进一步的，所述S2中，称取2.0g的远志粉末，置于平底烧瓶中，加入料液比为1:(10-50)的60-80％体积浓度的乙醇，水浴加热40-80℃的条件下回流提取1-5h，提取两次，提取液过滤后合并，减压浓缩回收乙醇，得浸膏。
进一步的，所述S3中，称取5.0g的AB-8大孔吸附树脂，湿法装柱，取S2得到的浸膏，配置成5-25mg/ml的浸膏样品液40-60mL，以0.5-4ml/min的流速进行动态吸附2次，待吸附完全后，用5BV水洗脱至洗脱液不浑浊，弃去洗脱液，再用0.5-4ml/min流速的30％乙醇5BV洗脱，弃去洗脱液，0.5-4ml/min流速的90％乙醇15BV洗脱，收集洗脱液，在60℃下回收乙醇后，减压浓缩、干燥。
进一步的，所述S4中，用体积比1:3的水和乙酸乙酯配置50-200mL充分溶解S3得到经树脂纯化后的样品，然后进行萃取2-4次，取乙酸乙酯部分，浓缩旋干得纯化的总口山酮。
进一步的，加入料液比1:30的70％体积浓度的乙醇。
进一步的，水浴加热温度70℃条件下回流提取90min。
进一步的，所述浸膏样品液为50mL，浓度为20mg/ml。
进一步的，以1mL/min的流速进行洗脱。
本发明的有益效果：本发明通过回流提取的方法，利用正交实验优化提取工艺，从远志中提取总口山酮，并通过大孔吸附树脂和萃取相结合的方法对其进行纯化，使得操作简单，设备要求低，节省时间，成本低，对环境污染小。口山酮用于抑制黄嘌呤氧化酶的活性，减少嘌呤类和次黄嘌呤转化为尿酸，从而减低血尿酸的水平，从而达到治疗和预防痛风的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是芦丁标准曲线图。
图2是S1标准曲线图。
图3是S2标准曲线图。
图4是乙醇体积分数对总口山酮、两个山口酮提取量的影响图。
图5是提取时间对总口山酮、两个山口酮提取量的影响图。
图6是提取温度对总口山酮、两个山口酮提取量的影响图。
图7是料液比对总口山酮、两个山口酮提取量的影响图。
图8是乙醇体积分数对总口山酮、两个山口酮的影响图。
图9是上样质量浓度对总口山酮、两个山口酮的影响图。
图10是上样体积流量对总口山酮、两个山口酮的影响图。
图11是最大上样量对总口山酮、两个山口酮的影响图。
图12是洗脱剂(乙醇)用量对总口山酮、两个山口酮的影响图。
图13是洗脱剂体积流量对总口山酮、两个山口酮的影响图。
图14是不同萃取因素对总口山酮纯化效果的影响图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
远志属植物中总口山酮的提取纯化方法，具体按照以下步骤进行：
S1，原料处理：将新鲜的远志风干，用粉碎机粉碎过筛，得到远志粉末；
优选地，步骤S1中经粉碎机粉碎的远志粉末为过40-80目的筛粉；过40-80目筛使远志和溶剂充分接触，加速提取速率。
S2，醇提：称取一定量S1中的远志粉末，置于平底烧瓶中，加入乙醇，水浴加热回流提取两次，提取液过滤后合并，减压浓缩回收乙醇，得浸膏；
优选地，步骤S2中称取2.0g的远志粉末，置于平底烧瓶中，加入料液比为1:(10-50)的60-80％体积浓度的乙醇，在水浴温度40-80℃的条件下回流提取1-5h，提取两次，提取液过滤后合并，减压浓缩回收乙醇，得浸膏。
最优选的，乙醇体积分数70％，料液比为1：30，回流提取时间90min，温度70℃。
经过多次实验验证，料液比的选择对总口山酮提取量有较大影响，如果不在该范围提取量会大幅度降低；当水浴反应在40-80℃时，受热均匀，加速分子间的作用，使得口山酮更容易溶出；而小于40℃提取速度慢，提取量太小，大于80℃会使化合物降解，影响提取量和生物活性。
S3，大孔吸附树脂纯化工艺参数的优选：准确称取一定量的大孔吸附树脂，湿法装柱，取S2中浸膏样品溶解上样，进行动态吸附2次，待吸附完全后，用水洗脱至洗脱液不浑浊，弃去洗脱液，再用的30％体积浓度乙醇洗脱至洗脱液不浑浊，弃去洗脱液，最后用90％乙醇洗脱，收集洗脱液，在60℃下回收乙醇后，减压浓缩、干燥；
优选地，步骤S3中称取5.0g的AB-8大孔吸附树脂，湿法装柱，取S2中浸膏，配置成5-25mg/ml的浸膏样品液40-60mL，最优50mL，以0.5-4ml/min的流速进行动态吸附2次，待吸附完全后，用5BV水洗脱至洗脱液不浑浊，弃去洗脱液，再用0.5-4ml/min流速的30％乙醇5BV洗脱，0.5-4ml/min流速的90％乙醇15BV洗脱，收集洗脱液，在60℃下回收乙醇后，减压浓缩、干燥；其中，BV表示柱体积。
浸膏样品液浓度过低流动就较快，不利于吸附，浓度过高，树脂吸附饱和，有多余口山酮泄露，影响总口山酮得率，最佳工艺下是5g树脂上样20mg/ml的样品50ml。
流速越慢吸附越完全，考虑到时间成本及效果，最佳选择1ml/min流速洗脱。
30％体积浓度乙醇洗脱为了除去远志中的皂苷类化合物，因为要的是小极性的口山酮，乙醇浓度大于30％可能洗去部分口山酮；最后用90％乙醇，是为了洗脱下来需要小极性的口山酮，乙醇浓度小于90％不能完全洗脱。
S4，萃取：用一定比例的水和乙酸乙酯充分溶解S3中的样品，然后进行萃取2-4次，取乙酸乙酯部分，浓缩旋干得纯化的总口山酮。
优选地，步骤S4中用体积比1:3的水和乙酸乙酯配置50-200mL充分溶解S3中经树脂纯化后的样品，然后进行萃取，取乙酸乙酯部分，浓缩旋干得纯化的总口山酮。
经测定，总口山酮达到65.67％以上。
本发明工艺的验证过程：
1.1研究方法
采用单因素、正交试验的方法，结合紫外分光光度法和HPLC法，测量西南远志中总口山酮酮的含量和两个指标性口山酮的含量，来确定口山酮的提取量，从而优化提取工艺参数；根据预实验结果，乙醇体积分数、提取时间、提取温度和料液比对提取率影响较大，因此选择此4因素做单因素试验；根据单因素试验结果做L9(34)的正交试验。
1.2试验材料、仪器、试剂及植物来源
1.2.1试验材料
表2-17种大孔吸附树脂的型号、极性、级别和粒径范围
Figure BDA0002550740180000051
1.2.2试验仪器
Evolution300紫外分光光度计(美国ThermoFisher公司)；GZX-9070MBE型数显鼓风干燥箱(上海博迅技术公司)；德国HeidolphDigital旋转蒸发仪(德国HeidolphGroup公司)；BK-300GDE超声波清洗器(陕西凯德力环保科技有限公司)；恒温水浴锅(国华电器有限公司)；玻璃干燥器(北京天连和谐仪器仪表有限公司)；Milli-Q超纯水系统(德国Millipore公司)；十万分之一电子天平(德国赛多利斯集团)；高效液相色谱仪(HPLC)1200为Agilent产品；HPLC分析柱(AgilentAnalyticalEclipseXDB-C18，4.6×150mm，5μm)。
1.2.3实验试剂
工业纯乙醇、色谱纯甲醇、色谱纯乙腈、分析纯磷酸、芦丁、NaN02、NaOH均为分析纯，Al(N03)3化学纯，以上试剂均购于美国Sigma公司；1，2，3-三甲氧基-6，8-二羟基口山酮(S1)、1，3，6-三羟基-2，7，8-三甲氧基口山酮(S2)，实验室自制，经HPLC-DAD分析，纯度均大于98％。
1.2.4植物来源
西南远志采自云南省云县，由西南林业大学林学院杜凡教授鉴定为远志科(Polygalaceae)植物西南远志(PolygalacrotalarioidesBuch.-Ham.exDC)，标本保存在西南林业大学林学院植物资源利用系药用植物教研室。
1.3标准曲线的测定
1.3.1芦丁标准曲线
精密称取120℃条件下干燥至恒重的芦丁4.0mg，置于10mL容量瓶中，加入适量80％的乙醇，超声处理使之溶解，用80％的乙醇定容至10mL，摇匀，配制成浓度为0.4mg/mL的芦丁标准溶液，精确量取0.4mg/mL芦丁标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分置10mL容量瓶中，加入5％NaNO2溶液0.3mL，摇匀，放置6min，加入10％Al(NO3)3溶液0.3mL，摇匀显色，定容，放置6min后，以零管为空白。在最大波长510nm处测定吸光度，结果进行直线回归，根据标准曲线，计算样品中总口山酮的含量。
1.3.2化合物S1、S2标准曲线
以西南远志中两个活性指标性成分(1,3,6-三羟基-2,7,8-三甲基口山酮(S1)、1,2,3-三甲基-6,8-二羟基口山酮(S2))为标准品，准确称取经干燥锅干燥至恒重的化合物S1、S2对照品1mg，置于10mL容量瓶中，加适量甲醇使其溶解并稀释至刻度线，将其摇匀，得到0.10mg/mL标准溶液，将标准溶液分别稀释为0.00125、0.0025、0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，得滤液。进HPLC检测，设置进样量为10μL，在230nm紫外光下测定。以口山酮浓度为X轴，以HPLC法测得的峰面积为Y轴，绘制两个口山酮标准曲线。
HPLC检测条件：色谱柱：AgligentZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-0.5％磷酸水；流速：0.8mL/min；检测波长：230nm；柱温：25±1℃；进样量：20μL。
1.4提取单因素试验
准确称取2.0g干燥的西南远志粉末(60目)，置于250mL平底烧瓶中，采用不同的实验方法进行提取。改变提取条件料液比、乙醇浓度、提取温度和提取时间以确定提取因素变化范围以及各因素的较佳值，具体的因素及水平见表2-2。提取两次，两次提取液过滤合并后置于100mL容量瓶，定容，然后取1mL溶液置于10mL容量瓶中，加入显色剂，定容，按芦丁标准曲线测定方法，利用紫外分光光度法测量西南远志中总口山酮的含量，总口山酮含量的计算方法如公式(2-1)。
准确称取2.0g干燥的西南远志粉末(60目)，置于250mL平底烧瓶中，改变提取条件料液比、乙醇浓度、提取温度和提取时间，提取两次，两次提取液过滤合并，用旋转蒸发仪蒸干得浸膏，取一定量浸膏置于10mL容量瓶中，加适量色谱甲醇使其溶解并稀释至刻度线，超声混匀，过0.45μm微孔滤膜，得样品液。进HPLC检测，设置进样量为10μL，在230nm紫外光下测定两个指标性口山酮化合物的提取量，计算公式如公式(2-2)。
总口山酮的计算公式：总口山酮提取量(％)＝(C×V/V0)/M×100(2-1)
其中C表示测量溶液的浓度；V表示样液定容后的体积；V0表示测定吸光度所用V中样液的体积；M表示称取西南远志样品重量。
两个指标性口山酮计算公式：口山酮含量(％)＝[Ci×V×(M1/M2)]/M3×100(2-2)
其中Ci表示测量溶液中S1、S2的浓度；V表示测定HPLC用样液的体积；M1表示总浸膏质量；M2表示测定HPLC称取的浸膏质量；M3表示称取西南远志样品质量。
表2-2回流提取总口山酮的影响因素及水平
Figure BDA0002550740180000071
1.5正交试验设计
在提取单因素试验的基础上，采用正交实验优化工艺条件。以乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比作为考察对象，选取各单因素较优的3个水平，选用L9(34)表，并安排试验，每组试验平行重复3次，取平均值，优化工艺条件，以确定总口山酮的最佳提取条件。
2总口山酮的纯化工艺研究
2.1研究方法
以吸附率和解吸率为指标，利用静态吸附试验对7种大孔吸附树脂进行筛选，确定了吸附分离西南远志中总口山酮的最佳树脂，并以西南远志中总口山酮和两个指标性口山酮含量为指标，通过与动态吸附相结合的方法，考察确定了该树脂纯化西南远志中总口山酮的最佳工艺条件。
2.2大孔吸附树脂的选择
2.2.1树脂的预处理
大孔吸附树脂用95％乙醇浸泡24h，充分溶胀后，用95％乙醇淋洗至流出液与水(1:3)混合不呈白色浑浊为止，然后以大量蒸馏水洗尽乙醇，以吸水纸吸去树脂表面水分，备用。
2.2.2大孔吸附树脂静态吸附率和解吸率的测定
准确称取7种大孔吸附树脂(S-8、NKA-9、HZ806、AB-8、D-101、X-5、HP-20)各5.0g至150mL锥形瓶中，在每个锥形瓶中加入70mL的20mg/mL的样品溶液，根据“1.4”项下方法测定原样液中总口山酮含量和两个指标性口山酮含量，用保鲜膜将锥形瓶口适当包扎，以防在震荡时溶液溅出，设置恒温恒速振荡器的温度为27℃，时间为24h，待震荡时间到，将溶液过滤，瓶中树脂保留，将所得滤液按“1.4”项下方法进行检测，按公式(2-1)计算总口山酮含量，公式(2-2)计算两个指标性口山酮含量，从而根据公式(2-3)计算每个型号树脂的静态吸附率。将吸附饱和的树脂放在滤纸上晾干，再置于锥形瓶中，加入95％的乙醇70mL，设置恒温恒速振荡器的时间为6h，温度为27℃，待充分洗脱后，过滤，得滤液，将所得滤液按“1.4”项下方法进行检测，按公式(2-1)计算总口山酮含量，公式(2-2)计算两个指标性口山酮含量，根据公式(2-4)计算每个型号树脂的静态解吸率。
吸附率＝(吸附前口山酮质量-吸附后口山酮质量)/吸附前口山酮质量×100％(2-3)
解吸率＝解吸附后总口山酮质量/(吸附前总口山酮质量-吸附后总口山酮质量)×100％ (2-4)
富集口山酮回收率＝吸附率×解吸率×100％ (2-5)
以吸附率为主要影响因素，结合回收率，选出较优的几种大孔吸附树脂进行下一步的动态吸附实验。
2.2.3动态吸附-洗脱性能试验
取处理好的大孔吸附树脂各5.0g，进行湿法装柱，装于450mm×15mm玻璃柱内，将10mg/mL的上样液50mL加于柱顶(树脂吸附饱和)，动态吸附的体积流量以1.0mL/min进行，为保证吸附充分，过柱液重吸附1次。加5BV水以1.0mL/min的体积流量洗脱，收集过柱液和水洗液，定容。用30％乙醇以1.0mL/min的体积流量洗脱至不再有样品流出，除去皂苷等大极性成分，再用90％乙醇以1.0mL/min的体积流量洗脱至不再有总口山酮流出，按“2.2.2”项下方法测定并计算吸附率及解吸率。根据实验结果选出效果最好的树脂进行下一步的纯化实验。
2.3大孔吸附树脂纯化工艺的优选
2.3.1洗脱剂体积分数的考察
精密称取处理好的大孔吸附树脂5.0g，湿法装柱，冲洗多次，备用。取10mg/mL的样品液50mL进行动态吸附两次，吸附完全后，接液。先用100mL蒸馏水进行洗脱，再依次以30％、60％、90％乙醇各100mL进行梯度洗脱，各洗脱液分两次50mL收集，取1mL溶液置于10mL容量瓶中，按“1.4”项下方法测定各部分中总口山酮的含量和两个指标性口山酮的含量。
2.3.2上样质量浓度的确定
精密称取处理好的大孔吸附树脂5.0g，5份，湿法装柱。分别制备5种浓度的上柱液，浓度分别为5、10、15、20、25mg/mL，将5种不同浓度的上柱液分别通过树脂柱(柱体积为5mL)进行动态吸附两次，保证吸附完全，接液。先用5BV水洗脱，去除远志中含有的糖酯类物质，再用5BV乙醇(30％)洗脱，去除远志中含有的皂苷类物质，最后用乙醇(90％)洗脱至洗脱液无色，收集乙醇(90％)洗脱液，同上步骤测定90％乙醇洗脱部分口山酮含量。
2.3.3吸附流速的考察
精密称取处理好的大孔吸附树脂5.0g，装柱。将“2.3.2”的上样浓度的上柱液通过树脂柱分别以滴0.5、1、2、3、4mL/min的流速进行动态吸附，进行2次吸附，接液。先用5BV水洗脱，再用5BV乙醇(30％)洗脱，最后用乙醇(90％)洗脱至洗脱液无色。收集乙醇(90％)洗脱液，同上步骤测量90％乙醇洗脱部分口山酮含量。
2.3.4最大上样量的考察
精密称取处理好的大孔吸附树脂5.0g，装柱。将“2.3.2”上样浓度的上柱液通过树脂柱，以“2.3.3”的吸附流速进行动态吸附，分段收集残留液。以5mL每次接收残留液，相同方法测定每段残留液的紫外吸光值，测定各分段残留液中总口山酮的量。以“2.3.2”上样浓度的样品溶液40、45、50、55、60mL通过树脂柱，以“2.3.3”的吸附流速进行动态吸附。先用5BV水洗脱，再用5BV乙醇(30％)洗脱，最后用乙醇(90％)洗脱至洗脱液无色。收集各部分的洗脱液，测定两个指标性口山酮的含量。
2.3.5洗脱剂用量的考察
精密称取处理好的大孔吸附树脂5.0g，装柱。将“2.3.2”上样浓度的“2.3.4”中量的上柱液通过树脂柱，以“2.3.3”的吸附流速进行2次动态吸附，吸附完全后，先用5BV水洗脱，再用5BV乙醇(30％)洗脱，最后用乙醇(90％)进行解吸，每5mL接收一次流出液，测量紫外吸光值，测定各份流出液中总口山酮含量，当口山酮含量为0，口山酮基本洗脱完全。以“2.2.3.2”上样浓度，“2.3.4”中量的上柱液通过树脂柱，以“2.3.3”中的吸附流速进行动态吸附两次。先用5BV水洗脱，再用5BV乙醇(30％)洗脱，最后用5、10、15、20、25BV的90％乙醇进行解吸，收集各部分的洗脱液，测定两个指标性口山酮的含量。
2.3.6洗脱流速的考察
精密称取处理好的大孔吸附树脂5.0g，装柱。将“2.3.2”的上样浓度“2.3.4”中量的上柱液通过树脂柱，分别以“2.3.3”中的流速进行动态吸附，进行2次吸附，接液。先用5BV水洗脱，去除远志中含有的糖酯类物质，再用5BV乙醇(30％)洗脱，去除远志中含有的皂苷类物质，最后用“2.3.5”中量的乙醇(90％)以0.5、1、2、3、4mL/min的流速进行洗脱，收集乙醇(90％)洗脱液，同上步骤测量90％乙醇洗脱部分总口山酮的含量和两个指标性口山酮的含量。
2.4萃取纯化工艺的优选
2.4.1萃取溶剂的选择
准确称取树脂纯化后的浸膏1.0g于烧杯中，加入20mL蒸馏水制成50mg/mL提取物水溶液，分别取3mL水溶液5份，以等体积的不同比例混合溶剂萃取2次，收集两相溶液，按“2.1.4”项下方法检测吸光值，按公式2-1计算总口山酮含量。
2.4.2萃取工艺优化
准确吸取50mg/mL提取物水溶液3mL，以筛选的较优纯化口山酮的溶剂为萃取剂，分别对萃取次数(1、2、3、4、5次)、水相-有机相体积比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)和萃取剂的用量(20、50、100、200、300mL)进行研究，以总口山酮萃取率为评价指标，选择最佳口山酮萃取工艺。
3结果与分析
3.1标准曲线的制作
3.1.1芦丁的标准曲线
以浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制芦丁的标准曲线，见图1，得回归方程：y＝0.407x+0.007，R2＝0.9991。结果表明在0.2-1mg/mL范围内呈良好的线性关系。
3.1.2化合物S1、S2的标准曲线
以浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制两个口山酮的标准曲线，如图2和图3，经线性回归，对照品S1、S2的回归方程分别为y＝21517x+27.886，R2＝0.9996；y＝32487x-18.572，R2＝0.9999。对照品S1、S2定量测定的线性范围分别为0.002525-0.101mg/mL和0.0015-0.12mg/mL，两个标准品在此范围内有良好的线性关系。
(1)精密度试验
吸取制备的对照品储备液，重复进样5次，结果芦丁吸光值和两个口山酮对照品峰面积的RSD分别为1.23％，1.45％，1.09％。
(2)重复性实验
取西南远志粉末5份，精确称取各约2.0g，制备成供试品溶液，按样品含量测定方法操作，测定并计算含量，芦丁、S1和S25次测定值的RSD分别为1.36％，0.89％，1.14％，重复性良好。
(3)稳定性实验
将上述供试品溶液连续2d进样共6次，依本实验方法测定，芦丁吸光度和S1、S2峰面积6次测定值的RSD分别为1.42％，1.13％，1.25％，说明供试品溶液在2d内保持稳定。
(4)加样回收实验
取已知含量的西南远志样品溶液6份，每份10mL，分别加入对照品溶液母液1mL，按上述标曲条件测定吸光度和峰面积，计算芦丁和2个口山酮化合物的回收率，测定结果，平均加样回收率均在95％～105％置信区间，符合要求。
3.2西南远志中口山酮类化合物提取工艺的优选
3.2.1乙醇体积分数对口山酮提取量的影响
由图4可知，总口山酮含量在乙醇体积分数60-80％范围内随乙醇体积分数的升高而增加(左图)，当乙醇体积分数高于80％以后，总口山酮含量反而逐渐减少；两个指标性口山酮的含量在60-75％范围内随乙醇体积分数的升高而增加(右图)，当乙醇体积分数高于75％以后，两个指标性口山酮含量反而逐渐减少；综上，选择70％、75％、80％进行下一步的正交试验。
3.2.2提取时间对口山酮提取量的影响
由图5可知，口山酮提取量(左图)、两个口山酮含量(右图)随时间的增加而升高，在120min以后含量增加不显著，表明在120min左右口山酮大致提取完全，故此选择90、120、150min做下一步的正交试验。
3.2.3提取温度对口山酮提取量的影响
如图6所示，总口山酮(左图)提取量在提取初期，随着温度的增加而增加，在提取过程中，高温有助于加剧分子扩散运动，加速溶液原料间的相互作用，使细胞结构能更好的被破坏，口山酮能够更有效的溶出，提取量在70℃达到最大，但是当提取温度高于70℃时，随后总口山酮提取量不再上升，反呈现出下降的趋势，两个指标性口山酮(右图)的含量在提取温度高于60℃时就开始下降，温度过高可使口山酮分子遭到破坏，从而降低口山酮提取量，因此选择50、60、70℃做正交试验。
3.2.4料液比对口山酮提取量的影响
图7反映了不同的料液比提取对口山酮提取量的影响，由结果可知，随着料液比的增加口山酮提取量(左图)有了明显的上升趋势，当料液比为1:30时，口山酮提取量达到最大，持续增大料液比后，总口山酮含量大致趋于稳定；当料液比大于1:30后，两个指标性口山酮提取量(右图)呈下降的趋势，料液比的增加有助于原料的浸提，从而加速口山酮的溶出，但溶剂量持续加大可使固液两相混合不彻底，传质不均匀，从而造成提取量下降。故选1:20、1:30、1：40做下一步正交试验。
3.2.5正交试验结果与分析
根据单因素试验，选择因素中提取量较优3水平做下一步的正交试验，正交实验的因素及水平见表2-3。由表2-4可知，各因素对总口山酮提取量的影响程度依次为C(提取温度)＞A(乙醇体积分数)＞B(提取时间)＞D(料液比)；较优组合为A1B1C3D1；对表2-4中的数据进行SPSS分析，不同因素水平间总口山酮的含量进行方差分析见表2-5，方差分析可知，A(乙醇体积分数)的P<0.05，影响显著；B(提取时间)的P<0.05，影响显著；C(提取温度)P<0.01，影响极显著；D(料液比)P>0.05，影响不显著。表2-6方差分析结果表明，不同处理组合间西南远志中总口山酮的含量有极显著差异(P＜0.01)。
表2-3正交实验的因素水平表
Figure BDA0002550740180000121
Figure BDA0002550740180000131
表2-4正交试验结果及极差分析
Figure BDA0002550740180000132
表2-5总口山酮含量不同因素水平间的方差分析
Figure BDA0002550740180000133
Figure BDA0002550740180000141
注:F0.05(2，2)＝19.00，F0.01(2，2)＝99.00
表2-6总口山酮含量不同组合间的方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F 显著性
处理间 2.875 8 0.359 104.845 **
误差 1.335 18 0.074
总变异 4.211 26
由表2-4可知，各因素对总口山酮提取量的影响程度依次为A(乙醇体积分数)＞C(提取温度)＞D(料液比)＞B(提取时间)；较优组合为A2B1C3D2。对表2-4中的数据进行SPSS分析，不同因素水平间两个指标性口山酮的含量进行方差分析见表2-7，方差分析可知，A(乙醇体积分数)的P<0.01，影响极显著；B(提取时间)的P<0.05，影响显著；C(提取温度)P<0.01，影响极显著；D(料液比)P<0.05，影响显著。表2-8方差分析结果表明，不同处理组合间西南远志中总口山酮的含量有极显著差异(P＜0.01)。
表2-7两个指标性口山酮含量不同因素水平间的方差分析
来源 离均差平方和 自由度 均方 F比 F临界值 显著性
A 0.003 2 0.002 105.891 99 **
B 0.001 2 0 21.638 19 *
C 0.007 2 0.004 230.07 99 **
D 0.002 2 0.001 68.488 19 *
注:F0.05(2，2)＝19.00，F0.01(2，2)＝99.00
表2-8两个指标性口山酮含量不同组合间的方差分析
平方和 自由度 均方 F 显著性
处理间 0.001 8 0.007 106.521 **
误差 0 18 0
总变异 0.001 26
3.2.6最佳提取工艺验证试验
按照正交试验结果，考虑节约时间、成本以及最大化提升口山酮的提取量，最终确定最优工艺为乙醇体积分数70％、提取时间90min、提取温度70℃、料液比1：20，在最佳条件下，提取得浸膏中总口山酮含量为4.45％，两个指标性口山酮含量为0.0627％，RSD＝1.61％(n＝3)，结果表明该工艺稳定。
2.3.3大孔吸附树脂的纯化工艺优选
2.3.3.1静态吸附与解吸附性能测定
由表2-9可知，NKA-9、HZ806、AB-8树脂的静态吸附率和解吸率均较高，故选择此三种树脂做下一步的动态吸附与解吸附性能试验。
表2-9不同型号树脂对口山酮的静态吸附与解吸附性能
Figure BDA0002550740180000151
3.3.2动态吸附与解吸附性能测定
根据表2-10实验结果，AB-8(弱极性)树脂的吸附率和解吸率均为最高，故选择AB-8树脂做下一步的纯化工艺参数研究。
表2-10 3种大孔吸附树脂对口山酮的动态吸附与解吸附性能
树脂 吸附率(％) 解吸率(％) 回收率(％)
NKA-9 93.28 95.99 89.54
HZ806 91.36 93.47 85.39
AB-8 98.60 97.19 95.83
3.3.3乙醇体积分数的考察
由图8可知，当洗脱剂体积分数小于30％时，两个指标性口山酮(右图)不能被解吸下来，总口山酮(左图)被洗脱下少量，同时30％乙醇能除去很大一部分大极性的杂质，用90％乙醇洗脱回收率达到最大，因此先用水除去其中糖酯类物质，再用30％乙醇除去其中的皂苷类大极性的物质，最后用90％乙醇洗脱树脂得到所需的口山酮类物质。
3.3.4上样质量浓度考察
由图9可知，在上样质量浓度为20mg/mL时，两个指标性口山酮(右图)和总口山酮(左图)回收率均达到最高，上样质量浓度过高或过低都会降低回收率，因此选择20mg/mL的西南远志样品进行树脂的吸附。
3.3.5上样体积流量考察
图10所示结果可知，上样体积流量越大，回收率越低，当上样体积流量为0.5mL/min时，回收率最高，但上样体积流量过低，所耗费时间过多，因此选择1mL/min的上样体积流量。
3.3.6最大上样量考察
由图11可知，当上样达50mL(右图)时，两个口山酮回收率最高，继续增加样品溶液，树脂吸附饱和开始有多余的口山酮泄露，从而降低回收率。当收集到第8管(40mL)左右时，口山酮(左图)开始大量泄露，收集到第10管(50mL)时，流出液中的口山酮基本达到峰值且不在改变，因此当质量浓度为20mg/mL的样品液为50mL时，树脂吸附能力基本饱和，所以最大上样量为50mL。
3.3.7洗脱剂(乙醇)用量考察
由图12可知，当洗脱剂收集到20管(100mL)以后，口山酮洗脱基本完全(左图)；两个口山酮的回收率在洗脱剂用量达到20BV(100mL)以后，回收率无明显增加(右图)，表明已基本解吸完全。综上，洗脱剂的用量选择100mL为宜。
3.3.8洗脱体积流量考察
图13所示结果可知，以相同体积的洗脱剂进行洗脱，当洗脱体积流量为1mL/min时，总口山酮(左图)回收率最高，洗脱体积流量继续增大时，回收率逐渐降低；洗脱体积流量越大，两个口山酮(右图)的回收率越低，当洗脱体积流量为0.5mL/min时，回收率最高；综上，由于洗脱体积流量过低，生产周期更长，故选择1mL/min的洗脱体积流量。
3.3.9最佳树脂纯化工艺验证试验
按照试验结果，最优纯化工艺为乙醇体积分数90％、上样浓度20mg/mL、吸附流速1mL/min、最大上样量为40mL、洗脱剂用量为20BV、洗脱流速1mL/min，在最佳条件下，纯化后浸膏中总口山酮含量为30.22％，两个指标性口山酮含量为0.556％，RSD＝2.43％(n＝3)，结果表明该工艺稳定。
3.4萃取纯化的工艺优选
3.4.1萃取溶剂的选择
通过萃取层中总口山酮含量评价不同萃取剂萃取效果，结果见表2-11。三氯甲烷-水相混合溶剂对总口山酮的萃取效果较差，不适于杂质的去除；正丁醇-水相、环己烷-水相和丙酮-水相混合溶剂皆不如乙酸乙酯-水相混合溶剂的萃取能力，因此选择乙酸乙酯-水相混合溶剂为萃取剂，进行萃取工艺优化试验。
表2-11不同萃取剂对总口山酮的萃取效果
萃取剂 总口山酮含量(％) 萃取率(％)
正丁醇-水相 50.23 77.35
乙酸乙酯-水相 65.21 86.98
环己烷-水相 57.34 81.36
丙酮-水相 53.26 79.34
三氯甲烷-水相 45.39 69.58
3.4.2萃取工艺优化
不同萃取因素对总口山酮纯化效果的影响如图14所示。随着萃取次数的增加，总口山酮含量不断增加，萃取3次后，总口山酮含量变化趋于平缓(图14中左图)；随着有机相和水相体积比的增加，总口山酮含量不断增加，在水相和有机相体积比到达1:3后，含量逐渐降低(图14中间图)；随着萃取剂的增加，总口山酮含量不断增加，当萃取剂大于100mL后，含量逐渐降低(图14右图)；本着经济效率原则，选择水相和有机相体积比为1:3，萃取剂用量100mL，萃取3次。
3.4.3最佳萃取纯化工艺验证试验
根据试验结果，最佳萃取纯化条件选择水相和乙酸乙酯相体积比为1:3，萃取剂用量100mL，萃取3次，在最佳条件下，萃取后总口山酮含量为65.67％，两个指标性口山酮含量为1.206％。RSD＝2.01％(n＝3)，结果表明该工艺稳定。
综上所述，本发明采用正交试验方法优化乙醇回流提取西南远志口山酮类化合物的提取工艺，利用AB-8大孔吸附树脂纯化西南远志中的口山酮类化合物，并采用溶剂萃取法进一步纯化。结果表明，最佳提取条件为乙醇体积分数70％，料液比1:30，提取时间90min，提取温度70℃，最佳条件下提取得浸膏中总口山酮含量为4.45％，两个指标性口山酮含量为0.0627％。最佳树脂纯化条件为洗脱剂体积分数为90％、上样浓度20mg/mL、吸附流速1mL/min、最大上样量为50mL、洗脱剂用量为20BV、洗脱流速1mL/min，纯化后总口山酮的含量为30.22％，两个指标性口山酮含量为0.556％。最佳萃取纯化条件选择水相和乙酸乙酯相体积比为1:3，萃取剂用量100mL，萃取3次，萃取后总口山酮含量为65.67％，两个指标性口山酮含量为1.206％。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.远志属植物中总口山酮的提取纯化方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
S1，将新鲜的远志风干，用粉碎机粉碎过筛，得到远志粉末；
S2，称取一定量S1中的远志粉末，置于平底烧瓶中，加入乙醇，水浴加热回流提取两次，提取液过滤后合并，减压浓缩回收乙醇，得浸膏；
S3，称取一定量的大孔吸附树脂，湿法装柱，取S2中浸膏样品溶解上样，进行动态吸附2次，待吸附完全后，用水洗脱至洗脱液不浑浊，弃去洗脱液，再用的30％体积浓度乙醇洗脱至洗脱液不浑浊，弃去洗脱液，最后用90％乙醇洗脱，收集洗脱液，在60℃下回收乙醇后，减压浓缩、干燥；
S4，用一定比例的水和乙酸乙酯充分溶解S3中得到的样品，然后进行萃取2-4次，取乙酸乙酯部分，浓缩旋干得纯化的总口山酮。
2.根据权利要求1所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方法，其特征在于，所述S1中，用粉碎机粉碎过40-80目筛。
3.根据权利要求1所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方法，其特征在于，所述S2中，称取2.0g的远志粉末，置于平底烧瓶中，加入料液比为1:(10-50)的60-80％体积浓度的乙醇，水浴加热40-80℃的条件下回流提取1-5h，提取两次，提取液过滤后合并，减压浓缩回收乙醇，得浸膏。
4.根据权利要求1所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方法，其特征在于，所述S3中，称取5.0g的AB-8大孔吸附树脂，湿法装柱，取S2得到的浸膏，配置成5-25mg/ml的浸膏样品液40-60mL，以0.5-4ml/min的流速进行动态吸附2次，待吸附完全后，用5BV水洗脱至洗脱液不浑浊，弃去洗脱液，再用0.5-4ml/min流速的30％乙醇5BV洗脱，弃去洗脱液，0.5-4ml/min流速的90％乙醇15BV洗脱，收集洗脱液，在60℃下回收乙醇后，减压浓缩、干燥。
5.根据权利要求1所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方法，其特征在于，所述S4中，用体积比1:3的水和乙酸乙酯配置50-200mL充分溶解S3得到经树脂纯化后的样品，然后进行萃取2-4次，取乙酸乙酯部分，浓缩旋干得纯化的总口山酮。
6.根据权利要求3所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方法，其特征在于，加入料液比1:30的70％体积浓度的乙醇。
7.根据权利要求3所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方法，其特征在于，水浴加热温度70℃条件下回流提取90min。
8.根据权利要求4所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方法，其特征在于，所述浸膏样品液为50mL，浓度为20mg/ml。
9.根据权利要求4所述的远志属植物中总口山酮的提取纯化方法，其特征在于，以1mL/min的流速进行洗脱。
10.一种采用如权利要求1-9任一项所述远志属植物中总口山酮的提取纯化方法得到的总口山酮在制备用于治疗和/或预防通风的药物中的应用。
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