CN111778259A

CN111778259A - 一种与梨树叶片含铁量相关的基因及其应用

Info

Publication number: CN111778259A
Application number: CN202010530314.8A
Authority: CN
Inventors: 贾兵; 郭国凌; 魏鹏飞; 朱立武; 叶振风; 衡伟; 刘莉
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2020-06-11
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2040-06-11
Also published as: CN111778259B

Abstract

本发明公开了一种与梨树叶片含铁量相关的基因及其应用，涉及农业栽培技术领域，本发明发现了一种与梨树叶片铁含量相关的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，同时本发明提供了一种利用上述序列对梨树黄化病因进行检测的方法，该方法具体包括采集梨树的cDNA，设计引物扩增上述序列后，对扩增产物采用不同的引物对扩增获得两种不同扩增产物，并进行载体制作，最终制备两种重悬液分别注射入黄化梨树的黄化叶和正常叶内，根据注射后的结果，可迅速判断梨树黄化是否为缺铁所致，本发明提供的方法简单有效，为治疗梨树黄化提供了有效的判定依据。

Description

一种与梨树叶片含铁量相关的基因及其应用

技术领域

本发明涉及农业栽培技术领域，尤其涉及一种与梨树黄化病相关的基因及判断梨树叶黄化病原因的方法。

背景技术

我国是世界梨树种植大国，其栽培面积和产量稳居世界第一。黄河故道地区是我国重要的梨树栽培区之一，多为碱性土壤，梨园缺铁引起的黄叶病发生较为普遍。近年来，在南方酸性土壤的沙梨园，缺铁引起的黄叶病也有发生，成为产业发展中重要的生理病害之一。

梨树黄叶病的诊断过去主要采用土壤中Fe含量的测定和叶片中Fe含量的测定，与土壤中、叶片中Fe的丰缺指标做比较来判断是否缺铁。

然而土壤Fe含量的测定技术缺点是受土壤酸碱度的影响很大，往往是土壤中Fe含量很高，但植株仍然表现为黄叶病，主要是土壤呈碱性，Fe容易形成难溶的铁矿盐沉淀所造成，且五点取样法工作量大；叶片Fe含量的测定技术缺点是在测定过程中溶Fe试剂容易被氧化，误差大，且不同品种叶片中Fe含量差异也大，目前我们参考的叶分析适宜值还没有划分到各个品种。

因此，提供一种能够便捷的判断梨树叶黄化是否为缺铁导致的方法，是本领域技术人员急需的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种与梨树叶片含铁量相关的基因及其应用，以解决现有技术中梨树叶黄化原因无法迅速判断的技术问题。

为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现的：

本发明首先提供一种与梨树叶片含铁量相关的基因，所述基因的核苷酸序列具体为SEQ ID NO.1。

本发明还提供一种用于扩增上述基因的特异性引物对，所述引物对具体为：

LOC-F:ctgtgagtcagtctaggaacccag SEQ ID NO.2

LOC-R:agagaagtccctgtcaccataggt SEQ ID NO.3。

本发明还提供一种利用上述基因鉴定梨树叶黄化原因的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一、提取梨树cDNA

步骤二、利用LOC-F/R引物对对步骤1获取的cDNA进行PCR扩增，获得扩增产物A

步骤三、采用LOC-OF/OR、LOC-SF/SR两组引物对分别对扩增产物A进行PCR扩增，获得扩增产物B和扩增产物C

其中：

LOC-OF：gagaacacgggggactctagaatggctgcaccgccgcca SEQ ID NO.4

LOC-OR：gcccttgctcaccatggatccagagtcagattggggtataatttgatt SEQ ID NO.5

LOC-SF：ggcaaatctgtccccaac SEQ ID NO.6

LOC-SR：ctctgtggtgccaaattcta SEQ ID NO.7

步骤四、分别构建包含扩增产物B的超表达载体和包含扩增产物C的VIGS沉默载体

步骤五、分别配置包含扩增产物B的超表达载体的超表达重悬液和包含扩增产物C的VIGS沉默载体的VIGS重悬液

步骤六、采集有黄化迹象的梨树的树叶，并分为黄化叶片组与正常叶片组

步骤七、在黄化叶片组中注射超表达重悬液，在正常叶片组中注射VIGS重悬液，若注射超表达重悬液的黄化叶片复绿且注射VIGS重悬液的正常叶片黄化，则对应梨树黄化的原因为缺铁所致。

进一步，步骤一具体为：用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，从梨叶中获取叶片RNA，并以普通反转录试剂盒合成叶片cDNA。

进一步，步骤二和步骤三的PCR扩增体系为：反应组分总体积50μL，含有25μL 2×KOD Neo buffer，1μL叶片cDNA，10μL 2mM dNTPs，1μL 0.50μM对应引物，1μL KOD Neo，加去离子无菌水至终体积；C1000梯度热循环基因扩增仪进行扩增，反应条件为：95℃初始变性3分钟；95℃持续30秒，连续变性40个循环，60℃下退火30秒，并在72℃持续30秒；最后72℃延伸10分钟。

进一步，步骤4具体为针对扩增产物B用1300载体进行超表达载体构建，针对扩增产物C用TRV2载体进行VIGS沉默载体构建。

进一步，步骤五中VIGS重悬液组分为1mL 1M MgCl₂，1mL 1M MES，200μL 200mM乙酰丁香酮，加去离子灭菌水至终体积100mL；超表达重悬液组分为1/2MS、20g/L蔗糖、2mL200mM乙酰丁香酮/L、10mL 1M MES/L。

进一步，步骤七具体为用无菌注射器从黄化的梨树叶背将对应重悬液注入叶片局部至其呈现水渍状。

本发明还提供一种上述序列用于判断梨树叶黄化是否为缺铁导致的应用。

本发明相比现有技术具有以下优点：

本发明提供一种与梨树叶片含铁量相关的基因及其应用，通过分子手段，发现了与梨树叶铁含量相关的基因，为研究梨树叶黄化原因提供了新的研究方法；其次，通过针对上述基因开发出了两对特异性引物对后，通过将对应的扩增产物导入相应的载体，并构建包含载体的重悬液后，注入黄化的梨树叶，并通过注入后梨树叶的表现，可以准确的判断梨树叶黄化是否因缺铁导致，避免了传统判断方法的繁琐，提高了判断的准确率。

附图说明

图1为实施例步骤3的电泳结果示意图，其中M：Marker；1：LOC-S沉默载体片段；2：LOC-O超表达载体片段。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书中的术语“包括”，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤的方法不必限于清楚地列出的那些步骤，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些方法固有的其它步骤。在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考实施例来详细说明本申请。

实施例

(1)cDNA提取

用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441-RNA prep pure，天根)，从梨叶中获取叶片RNA，并以普通反转录试剂盒(AH311-02，全式金)合成叶片cDNA。使用Beckman CoulterDU800紫外可见分光光度计(Beckman,Pasadena,CA,USA)检查各叶样的cDNA浓度。以RNase-Free H₂O将cDNA浓度调节至2000ng/μL，-80℃保存备用。

(2)PCR反应

反应组分总体积50μL，含有25μL2×KOD Neo buffer(TOYOBO)，1μL上述样本cDNA，10μL 2mM dNTPs，1μL 0.50μM LOC-F/R特异引物，1μL KOD Neo，加去离子无菌水至终体积。C1000梯度热循环基因扩增仪(Bio-Rad Laboratories srl)进行扩增，反应条件为：95℃初始变性3分钟；95℃持续30秒，连续变性40个循环，60℃下退火30秒，并在72℃持续30秒；最后72℃延伸10分钟；并再次以该反应产物为模板，加入上述组分，分别以LOC-OF/OR、LOC-SF/SR，分别扩增出目的片段，具体的，采用LOC-OF/OR、LOC-SF/SR两组引物对扩增获得的产物分别为扩增产物B和扩增产物C。

(3)扩增产物检测

在1×Tris-乙酸-EDTA缓冲液中，加2％琼脂糖进行凝胶电泳，扩增产物进样量50μL；用GelRed(Biotium Inc.)进行凝胶染色；根据PCR扩增产物电泳结果(其电泳结果如图1)，回收目的片段，并按照全式金Blunt-Simple连接转化方法将其转化至DH5α大肠杆菌感受态中，送至华大基因测序。

(4)针对扩增产物C进行VIGS沉默载体构建

提取质粒，以QuickCutTMXbaI、QuickCutTMBamHI限制性快切酶将载有目的基因或载体的质粒线性化，其组分为快切酶各2ul，2000ng质粒，加水至终体积40μL，37℃反应1h。

在1×Tris-乙酸-EDTA缓冲液中，加2％琼脂糖进行凝胶电泳，以GelRed(BiotiumInc.)进行凝胶染色，回收目的片段，使用Beckman Coulter DU800紫外可见分光光度计(Beckman,Pasadena,CA,USA)测定酶切产物浓度。

连接反应组分体积为10μL，200ng(XμL)线性化载体，50ng(Y ul)线性化基因，X+YμL Solution I，于45℃反应45分钟连接线性化载体与目的基因，按照全式金Blunt-Simple连接转化方法将其转化至DH5α大肠杆菌感受态中，检测，送至华大基因测序。

(5)针对扩增产物B进行超表达载体构建

以诺唯赞同源重组酶(

II One Step Cloning Kit)连接线性化片段和扩增产物B构建重组质粒并转化，挑单送至华大基因测序。

提取质粒，并取10μL质粒于100μL农杆菌GV3101(pJIC SA_Rep，上海唯地)感受态中，于冰浴、液氮、42℃水浴、冰浴各5分钟后涂板，检测阳性单克隆，加入50％灭菌甘油保存于-80℃，待用。

(6)侵染液配置

VIGS重悬液组分为1mL 1M MgCl₂，1mL 1M MES，200μL 200mM乙酰丁香酮，加去离子灭菌水至终体积100mL；

超表达重悬液组分为1/2MS+2mL 200mM乙酰丁香酮/L+10mL 1M MES/L+20g/L蔗糖。

将农杆菌于28℃摇菌2d，并于4℃，5000rpm离心菌体，以上述重悬液重悬菌体，并于721紫外分光光度计波长为600nm处调节其吸光值至0.5～0.6，于28℃摇菌3h。

(7)瞬时处理及有效性测定

采集针对不同品种的梨树进行测定。

本发明中选用的叶片发生黄化的梨树品及测定结果具体如下：

用无菌注射器从梨叶背将两种重悬液利用压力注入叶片，使叶片局部至其呈现水渍状，同一棵梨树采集的叶片中，对黄化叶片中注射超表达重悬液，对正常叶片中注射VIGS重悬液。注射处理7d后，其瞬时载体表达结果显示，注射LOC-O(超表达)的黄化叶复绿、而注射LOC-S(VIGS沉默)正常叶黄化，而根据对应叶片有效铁含量的检测可得黄化梨树的正常叶片铁含量正常而黄化叶片铁含量缺失严重；

结合注射重悬液结果可得，注射LOC-O(超表达)后黄化叶复绿、注射LOC-S(VIGS沉默)正常叶黄化，即可诊断该黄化症是由于缺铁所致。

2、具体操作

用注射器从梨叶背部将重悬液注入梨片。

本发明提供的方法简单，操作便捷，能够迅速准确的判断梨树叶发生黄化的原因，为后期治理提供有效的指导方向。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种与梨树叶片含铁量相关的基因及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2130

<212> DNA

<213> 梨树(Pyrus, i, f)

<400> 1

atggctgcac cgccgccaag cagcagccgc ctccgcggta tgttgcaggc ctcagttcaa 60

tatgtccaat ggacttacag tctcttctgg caaatctgtc cccaacaagg gatcttagta 120

tggtcagatg ggtactataa tggagctatc aagacgagga agacagtgca accaatggaa 180

gtgagtgccg atgaggcatc tctccagagg agccagcaac tcagagaact ctacgactct 240

ttgtccgctg gagagacaaa ccagccccca gcacgccgcc cttgcgcttc cttgtccccg 300

gaggacttaa ccgaatccga atggttctac ttgatgtgtg tctcattctc ctttcccccc 360

ggcgtcgggt tgccagggaa agcatacgca aggaggcagc atgtatggct cacaggtgca 420

aacgaggtcg atagcaaaac cttttccaga gctattttgg caaagagtgc tcgtatacag 480

accgtggtgt gcattcctct tctagatggc gtcgtagaat ttggcaccac agagagggtt 540

ccagaagacc acgccttcgt cgaacacgcc aaaaccttct tcgttgacca ccaccaccct 600

ccaccaccaa agcccgccct ctccgagcac tccacatcca accccgccgc ctcatccgat 660

cacccacatt tccactctcc gcaccttctc caggccatgt gcaccaaccc tcctctcaac 720

gccgcccaag aagacgaaga ggacgaagaa gaagatgata atcaggagga ggacgacgga 780

ggagccgagt ccgactccga agccgaaacg ggccgcaatg gtggagccgt tgttcccgcc 840

gcaaaccctc ctcaggtttt ggccgcggta gccgagccaa gcgagctcat gcaactcgag 900

atgtccgaag acatccggct gggctccccg gacgatgcct caaataactt ggactctgat 960

ttccacttgt tagctgtgag tcagtctagg aacccagcgg atcagcagag acaagctgac 1020

tcgtatcgag ccgagtcgac caggcggcga ccgttagtac aagagccgct gagcagtggc 1080

cttcaaccgc cgcacacagg acctctagct ttagaggagt tgacacatga tgacgacaca 1140

cattactcgg agacagtctc caccatactg cagggtcagg cgactcggtt tacggattca 1200

tcgtccaccg actacacagc ttgcttgact caatcagctt tcgccaagtg gtcgagccgg 1260

gttgatcacc acttcctcat gccggttgag ggcacgtccc aatggctctt gaaatatatt 1320

ttgtttagtg taccgttcct ccactcaaaa tatcgcgacg agaactcgcc aaaatttcag 1380

gagggcgaag gctcgacgcg gttgaggaaa gggaccccgc aagacgagct cagtgctaat 1440

catgtgttag cggaacgacg tcgtagagag aagcttaatg agaggtttat tatactaagg 1500

tcccttgtgc cttttgtgac aaaaatggac aaggcttcga tattaggaga cacaatcgag 1560

tatgtgaagc aactgcgtaa caaaattcag gatctcgagg cacgtaacat gctggtggag 1620

gaagatcaac ggtcaagatc atccggggaa atgcaaaggt ccaatagttg taaagagttg 1680

cggagtgggc tcacggtagt ggagcggacc caaggaggtc cacccgggtc cgataaaagg 1740

aagttgagga ttgtggaggg aagtggcggt gtcgccattg gtaaggctaa agtaatggag 1800

gactcaccgc ctccaccacc cccgccacca cctcagccag aaccttcacc gacacctatg 1860

gtgacaggga cttctctaga ggtgtcgata atcgagagtg gtgggttgtt ggagctccag 1920

tgtccgtata gagaagggtt attgcttgat gtgatgcgaa cactaaggga gctaagaatt 1980

gagaccacgg tggtccagtc ctcattgaat aacggattct tcgtagctga actaagagcc 2040

aaggtgaagg ataacgtgag tggcaagaaa gtaagtataa cggaagtgaa gagggtgata 2100

aatcaaatta taccccaatc tgactcttaa 2130

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 2

ctgtgagtca gtctaggaac ccag 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 3

agagaagtcc ctgtcaccat aggt 24

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 4

gagaacacgg gggactctag aatggctgca ccgccgcca 39

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 5

gcccttgctc accatggatc cagagtcaga ttggggtata atttgatt 48

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 6

ggcaaatctg tccccaac 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 7

ctctgtggtg ccaaattcta 20

Claims

1.一种与梨树叶片含铁量相关的基因，所述基因的核苷酸序列具体为SEQ ID NO.1。

2.一种用于扩增权利要求1所述基因的特异性引物对，其特征在于，所述引物对具体为：

LOC-F:ctgtgagtcagtctaggaacccag SEQ ID NO.2

LOC-R:agagaagtccctgtcaccataggt SEQ ID NO.3。

3.一种利用权利要求1所述基因鉴定梨树叶黄化原因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、提取梨树cDNA

其中：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤一具体为：用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，从梨叶中获取叶片RNA，并以普通反转录试剂盒合成叶片cDNA。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤二和步骤三的PCR扩增体系为：反应组分总体积50μL，含有25μL 2×KOD Neo buffer，1μL叶片cDNA，10μL 2mM dNTPs，1μL 0.50μM对应引物，1μL KOD Neo，加去离子无菌水至终体积；C1000梯度热循环基因扩增仪进行扩增，反应条件为：95℃初始变性3分钟；95℃持续30秒，连续变性40个循环，60℃下退火30秒，并在72℃持续30秒；最后72℃延伸10分钟。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4具体为针对扩增产物B用1300载体进行超表达载体构建，针对扩增产物C用TRV2载体进行VIGS沉默载体构建。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤五中VIGS重悬液组分为1mL 1M MgCl₂，1mL 1M MES，200μL 200mM乙酰丁香酮，加去离子灭菌水至终体积100mL；超表达重悬液组分为1/2MS、20g/L蔗糖、2mL 200mM乙酰丁香酮/L、10mL 1M MES/L。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤七具体为用无菌注射器从黄化的梨树叶背将对应重悬液注入叶片局部至其呈现水渍状。

9.一种权利要求1所述序列用于判断梨树叶黄化是否为缺铁导致的应用。