CN112037858A

CN112037858A - 一种确定植物主要病原菌的方法及应用

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Publication number: CN112037858A
Application number: CN202010844801.1A
Authority: CN
Inventors: 刘普; 梁宽; 董宏杰; 贾兵; 衡伟; 叶振风
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2020-08-20
Filing date: 2020-08-20
Publication date: 2020-12-04

Abstract

本发明涉及一种确定植物主要病原菌的方法及应用，所述方法包括：分别获取植物发病组织和植物正常组织中总微生物DNA构建DNA文库，通过物种多样性分析分别获取所述植物发病组织和所述植物正常组织中的所有类型微生物的丰度，根据所有类型微生物的丰度判断所述植物的主要病原菌。本发明通过对染病植物发病组织进行物种多样性分析，得到和植物发病密切相关的微生物种类，再进一步和植物正常组织上的微生物种类进行对比分析后得到植物的主要病原菌。相较于传统的直接对植物发病组织进行病菌分离和鉴定的操作，可以准确鉴定得到真实引起植物发病的病原菌。

Description

一种确定植物主要病原菌的方法及应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种确定植物主要病原菌的方法及应用。

背景技术

植物在生长发育过程中长期遭受各种生物和非生物的胁迫，如由病原菌引起的各种类型病害，病原菌是可以引起疾病的微生物，包括有多种细菌、真菌或病毒，这些病原菌引起植物的多种疾病，造成了严重的经济损失。目前，现有技术对于植物病原菌的鉴定一般是直接从植物的发病组织中将微生物分离出来，后通过形态观察或高通量测序技术对于分离出的微生物进行鉴定。但是该方法存在一定的缺陷，一方面是并非所有微生物都容易从发病组织中分离出来并培养成功；另一方面是并非分离出的微生物就一定是病害的主要病原菌。

例如，猕猴桃黑斑病(Kiwifruit Black Spot，KBS)是目前一种新型病害，该病害在田间主要表现为在果实生长发育后期在外果皮上形成不规则黑色病斑，后扩展至其他部位，影响果实外观和商品性。不同实验室对其病原进行分离纯化和鉴定后获得的病原不一致，现有技术分离的病原菌包括有枝孢霉(Cladosporium spp.),镰刀菌(Fusarium spp.)和链格孢菌(Alternaria spp.)等，这就使得仅依靠分离鉴定难以确定猕猴桃黑斑病的主要病原菌。除此之外，还有研究利用致病性实验认为黑斑病病原菌为座壳属真菌(Diaporthe eres)，然而Diaporthe属真菌在猕猴桃上分布极为广泛，已报到的猕猴桃病原菌有D.actinidiae,D.ambigua,D.novem,D.australafricana,D.lithocarpus,D.perniciosa,D.rudis和D.viticola等，造成的猕猴桃症状为软腐和茎果腐等，这与田间黑斑病症状不完全符合。同时，Diaporthe属真菌易在果实表面潜伏，容易在分离过程中偶然获得，由此可见，Diaporthe属真菌是黑斑病病原菌还有待商榷和确认。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种确定植物主要病原菌的方法及应用。

第一方面，本发明提供一种确定植物主要病原菌的方法，包括：

(1)分别获取患病植物的植物发病组织和植物正常组织中总微生物DNA构建DNA文库；

(2)通过对所述DNA文库进行物种多样性分析分别获取所述植物发病组织和所述植物正常组织中的所有类型微生物的丰度；

(3)根据所有类型微生物的丰度判断患病植物的主要病原菌。

所述DNA文库可以通过下述方式构建：

采用试剂盒对于植物发病组织和植物正常组织中的总DNA抽提，再进一步利用微生物通用ITS引物从总DNA中对其中的微生物DNA进行扩增，经过多轮扩增后对于结果进行测序后即可用于构建DNA文库。

进一步地，所述通过对所述DNA文库进行物种多样性分析分别获取所述植物发病组织和所述植物正常组织中的所有类型微生物的丰度包括：

对所述DNA文库中的序列信息进行预处理得到优质序列；

根据所述优质序列的序列相似性，将所述优质序列划分为多个操作分类单元；

通过对所述多个操作分类单元进行物种多样性分析，得到每个操作分类单元的丰度。

再进一步，对所述DNA文库中的序列信息进行预处理得到优质序列可以通过如下方式进行：

(1)采用滑动窗口法对序列扫描，当质量低于20时，切掉碱基质量平均值低于阈值的滑窗，并去除长度小于50bp的序列；

(2)将合格的双端raw data拼接，序列拼接时最大overlap为200bp，得到完整paired end序列；

(3)去除paired end序列中含有N碱基的序列，去除单碱基重复大于8的序列，去除长度小于200bp的序列，得到clean tags序列；

(4)去除clean tags中的嵌合体，得到用于后续操作分类单元划分的优质序列。

优选地，可以通过Flash软件进行双端raw data拼接；

优选地，可以通过QIIME中的split libraries软件去除paired end序列中含有N碱基的序列，去除单碱基重复大于8的序列，去除长度小于200bp的序列，得到clean tags序列；

优选地，可以通过UCHIME软件去除clean tags中的嵌合体。

进一步地，对于进行预处理得到的优质序列(valid tags)可以采用Vsearch软件，根据序列的相似性，将序列归为多个操作分类单元(Operational Taxonomic Unit，OTU)。例如将序列相似度大于或等于97％归为一个OTU单元。

再进一步，对于归类结果可以和数据库比对，后对各OTU进行物种比对和注释，例如使用QIIME软件包的挑选出各个OTU的代表序列，使用Unite数据库比对，使用blast软件进行物种比对注释。

再进一步，对于各OTU的代表序列可以进行分类学分析，并在各个水平(界、门、纲、目、科、属、种)统计每个样品的群落组成。

所述各OTU的代表序列为分别对各个样本中分类到该OTU的tags数进行统计，可以获得各个OTU在每个样本中的丰度情况。

再进一步，在进行生物信息学统计和分析前可以通过多个植物发病组织的重复排除杂菌的影响，例如经过3～5次重复，对这几次重复中OTU聚类分析结果进行统计分析，挑选出在所有重复中共有的OTU进行后续的生物信息学统计和分析。此方法可以有效减少每次重复中杂菌的影响，同时也不会遗漏真正的病原菌。

更进一步，所述对这几次重复中OTU聚类分析结果进行统计分析可以通过Mothurversion V.1.30软件进行alpha多样性指数分析，包括稀释性曲线(RarefactionCurve)，alpha多样性boxplot分析(有分组且组内有生物学重复时提供)，Rank Abundance分析，Specaccum分析。alpha多样性指数包含：Observed Species、Shannon Wiener指数、Chao指数、Goods Coverage、Simpson指数(Simpson1949)。

再进一步，可以进行Beta多样性分析包括基于Binary jaccard、Bray curtis距离矩阵分析、PCA、PCoA、NMDS、UPGMA和RDA/CCA分析。

再进一步，可以通过Adonis(即PERMANOVA分析)和Anosim检验，分析植物发病组织的OTU聚类与植物正常组织的OTU聚类之间是否有显著性差异。

进一步地，所述根据所有类型微生物的丰度判断患病植物的主要病原菌为：

分析得到在所述植物发病组织中相对丰度较高，且不存在于所述的植物正常组织中的微生物为所述植物的主要病原菌。其中相对丰度较高的微生物可以为：相对丰度在植物发病组织中前30的微生物。

优选地，可以通过生物信息学统计和分析的方式进行分析，例如可以通过T test算法、Wilcoxon算法和LEfSe分析方法统计植物发病组织和植物正常组织差异显著性的物种，确定在所述植物发病组织中相对丰度较高，且不存在于所述的植物正常组织中的微生物为主要病原菌。

本发明提供一种确定植物主要病原菌的方法及应用，具有如下有益效果：

本发明以物种分析为基础，对患病植物的发病组织和正常组织进行微生物种类统计和分析，进一步比对得到患病植物的真正病原菌，这一方面可以分析得到无法分离纯化的病源菌，弥补了传统分离鉴定方法的不足；另一方面可以排除一些分布较广泛的病源菌的影响，不会出现现有技术中对于一种病害，分离得到多种不同病原菌的问题。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的猕猴桃黑斑病的症状图；

图2为本发明实施例2提供的猕猴桃黑斑病不同病样Specaccum物种积累和韦恩图分析；其中A为Specaccum物种积累检测结果，B为韦恩图分析结果；

图3为本发明实施例3提供的猕猴桃黑斑病组间多样性的分析结果；其中A为3D-PCA分析结果，B为威尔科克森秩和检验，标记**为极显著，C为杰卡德距离矩阵分析；

图4为本发明实施例2提供的猕猴桃黑斑病组间LEfSe分析结果；

图5为本发明实施例2提供的猕猴桃黑斑病样本的物种circos分析结果；

图6为本发明实施例2提供的猕猴桃黑斑病组间差异显著性分析结果；其中A为相对丰度聚类热图，B为OTU多样性指数组件比较箱型图，C为相对丰度直方图；

图7为本发明实施例3提供的猕猴桃黑斑病微生物菌落互作网络分析图；其中，A为相关性corrplot分析，B为物种样本间互作网络。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1.1果实采集

黑斑病，又称黑头病，在‘翠香’猕猴桃的症状特征为果实发病时，鲜绿的果实最后会变得色泽暗淡而表面皮革般坚韧。果实靠近萼端出现果皮组织黑色小斑点，随着病害发展病斑直径可扩大至2～3mm，形成不规则黑色或深褐色病斑，形成革质化大黑斑(图1)。

本实施例于2019年9月，重庆市黔江区美味猕猴桃(Actinidia chinensisvar.deliciosa)品种‘翠香’进行猕猴桃黑斑病的田间调查，并收集发生和未发生的果实病样作后续分析。

为避免果实表面杂菌的干扰，‘翠香’猕猴桃黑斑病病果全果无菌水冲洗3次，再用无菌滤纸吸干水分备用。无菌刀片削取黑斑病病部果实的果皮组织(KBS)，液氮浸泡后超低温保存，以正常的猕猴桃果实为对照(CON)。为有效扣除果实之间的杂菌干扰，每个病果作为一个独立样本，每个处理设5次重复。

1.2样品总DNA的提取、文库构建和测序

本实施例采用DNeasy Power Soil Kit(QIAGEN)DNA抽提试剂盒对样本总DNA进行抽提，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，使用Nano Drop 2000UV-Vis光谱仪测定DNA浓度，总量满足3次及以上建库要求。使用无菌水将样品DNA浓度调整至1ng/μL作为模板，利用Takara Ex Taq高保真酶(Takara)进行PCR扩增。所用引物为真菌ITS1区域引物：

ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′

ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，25个循环；72℃延伸7min。PCR产物使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后作为二轮PCR模板，并进行二轮PCR扩增，并再次使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后对PCR产物进行Qubit定量。根据PCR产物浓度进行等量混样，并上机测序，具体利用Illumina MiSeq平台对KBS/CON各五个重复共10个样本进行总DNA提取后ITS扩增子测序分析。

本实施例进一步对测序结果进行质控：

使用Trimmomatic软件对原始双端序列进行去杂。采用滑动窗口法，对序列扫描，当质量低于20时，切掉碱基质量平均值低于阈值的滑窗，并去除长度小于50bp的序列。使用Flash(version 1.2.11)软件，将合格的双端raw data拼接，序列拼接时最大overlap为200bp，得到完整paired end序列。使用QIIME中的split libraries(version 1.8.0)软件去除paired end序列中含有N碱基的序列，去除单碱基重复大于8的序列，去除长度小于200bp的序列，得到clean tags序列。使用UCHIME(version 2.4.2)软件去除clean tags中的嵌合体，最终得到用于后面OTU划分的valid tags。进一步统计，这些valid tags分布在47313～58592之间，平均长度分布在243.93～326.73bp。

对于得到的优质序列，本实施例进一步采用Vsearch软件，根据序列的相似性，将序列归为多个操作分类单元(Operational Taxonomic Unit，OTU)。参数为序列相似度大于或等于97％被归为一个OTU单元。使用QIIME软件包的挑选出各个OTU的代表序列，并将所有代表序列与数据库进行比对注释。ITS使用Unite数据库比对，使用blast软件进行物种比对注释。对OTU代表序列进行分类学分析，并在各个水平(界、门、纲、目、科、属、种)统计每个样品的群落组成。基于上述原则，本实施例共得到了1508个OTUs，划分为9个门，30个纲，67个目，114个科和159个属。KBS样品真菌的OTU个数分布在330～737之间，显著高于CON样品(124～218)。

实施例2黑斑病猕猴桃中菌落多样性

本实施例对实施例1的OTUs进行物种多样性分析，具体包括：

利用Mothurversion V.1.30软件进行alpha多样性指数分析，包括稀释性曲线(Rarefaction Curve)，alpha多样性boxplot分析(有分组且组内有生物学重复时提供)，Rank Abundance分析，Specaccum分析。alpha多样性指数包含：Observed Species、ShannonWiener指数、Chao指数、Goods Coverage、Simpson指数(Simpson 1949)。Beta多样性分析包括基于Binary jaccard、Bray curtis距离矩阵分析、PCA、PCoA、NMDS、UPGMA和RDA/CCA分析。多元变量统计，包括Adonis(即PERMANOVA分析)和Anosim检验，分析黑斑病病样KBS与对照CON之间是否有显著性差异；Ttest算法、Wilcoxon算法和LEfSe分析方法统计组间差异显著性的物种。

其中，稀释曲线结果显示随着重复数增加，样品的多样性饱和度明显提升，五个重复后曲线趋于平缓，说明测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种，物种信息被充分提取(图2中的A)。随后，根据OTUs聚类分析结果，对五个KBS样品间共有和特有OTUs进行分析，结果显示有126个OTUs在KBS间共有(图2中的B)，也就是说这126个菌落类型可能参与了黑斑病发生过程。

3D-PCA主成分、威尔科克森秩和检验(Wilcoxon rank-sum test)和杰卡德距离(Jaccard Distance)分析的结果显示样品重复内部虽然有部分样品有离群趋势，但是KBS/CON之间差异显著(图3)。F检验结果表明，KBS样品真菌的Chao1指数和Shannon指数都明显高于CON，分别相差2.34和1.21倍，而Simpson指数在两个组间差异不显著(表1)。

表1猕猴桃黑斑病菌落α多样性指数

群落组成方面，在门水平上，KBS果实中Ascomycota(15.1％)和Basidiomycota(12.5％)的丰度占绝对优势，其次是含有少量的Zygomycota，但是这3个门在KBS与CON之间的丰度差异较小。在属水平上，共有94个属在KBS中被鉴定，其中Cutaneotrichosporon、Colletotrichum和Tilletiopsis丰度最高，且其丰度均显著高于CON。此外，Suillus、Tricholoma和Oidiodendron在KBS中的丰度低于CON。

T test算法发现KBS/CON组间差异共有74个种，19个属，1个门；Wilcoxon算法显示组间有149个差异种，31个差异属，2个差异门。组间差异显著性分析发现，当设定LDA值>10时，样品之间具有差异显著性的标记被有效富集。猕猴桃黑斑病样品中富集的显著差异标记为58个，包括：Colletotrichum、Alternaria、Dipodascus和Archaeorhizomyces等，而对照样品中显著差异标记仅5个，分别为Trichocomaceae、Eurotiales和Helotiales等，表明猕猴桃黑斑病发生的果实真菌组成发生了极大程度的改变(图4)。

猕猴桃黑斑病样本-物种circos分析结果显示，各优势物种在不同样本之间分布差异较大，且每个样本的优势物种组成比例也有不同，其中Colletotrichum集中分布在KBS样本中，且分布相对均匀稳定。随后本实施例对上述显著差异标记的每个重复中的相对丰度通过直方图进行分析，重点关注KBS中核心组分在各CON样品种的相对丰度，结果显示显著差异标记Colletotrichum在所有KBS中丰度较高，而在所有CON样品未发现(图5)。

本实施进一步在种水平上对样品和OTU类型进行聚类，结果显示有三个种Cutaneotrichosporon cutaneum、Colletotrichum scovillei和Tilletiopsispallescens在KBS与CON之间的丰度差异显著(图6中的A)。再利用KBS与CON之间样本微生物群落分布进行统计，基于相对丰度的热图，本实施例发现有三种真菌在对照中完全没获取，而在五个病样中同时存在，显示这三种真菌与黑斑病极为相关。为验证这个结果，我们挑选差异丰度前10的物种做丰度箱型分析，结果显示C.scovilleiz在样本间丰度差异显著，且在KBS组内样本中未出现分散(图6中的B和C)，被有效富集，因此可以确认为猕猴桃黑斑病的主要病原菌。而C.cutaneum和T.pallescens虽然在KBS和CON之间的丰度差异显著，但是这两种微生物为酵母菌，未见造成类似果实黑斑病的报道。

针对前期报道于猕猴桃黑斑病的病原菌，本实施例对Diaporthe、Cladosporium、Fusarium和Alternaria在KBS和CON的相对丰度进行提取，发现这五种病原菌在KBS与CON中都有发现，但其相对丰度都很低，其中Diaporthe在KBS中丰度甚至比CON低32.7％，分别为0.00094和0.00132。Cladosporium在KBS与CON之间则表现为丰度类似，且在五个KBS样品中只有一个样品中被检测到。Fusarium和Alternaria虽然在KBS中丰度高于CON，但Fusarium在KBS和CON的所有样品中共有，Alternaria在KBS样品中的丰度极低。由此可见，上述病原虽然都具有危害猕猴桃潜力，但是非猕猴桃黑斑病的病原菌。

实施例3黑斑病猕猴桃多元变量统计结果

本实施例基于物种样本间的相对丰度进行spearman相关系数计算，获得样本内或样本组内的物种之间的相互关系，然后用展示物种间相互关系的可视化软件进行相关性corrplot分析和物种相互作用网络构建。由图7可见，结果表明多达26个菌落类型与Colletotrichum呈相关(图7中的A)，其中12个真菌类型与之负相关。Phoma，Setophaeosphaeria和Hydrum与C.scovillei显著正相关，而Phomopsis和Candida与之显著负相关(图7中的B)，也就是说以上5类真菌对Colletotrichum的致病做出了重要贡献。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种确定植物主要病原菌的方法及应用

<130> KHP191115379.7

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttggtcatt tagaggaagt aa 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctgcgttct tcatcgatgc 20

Claims

1.一种确定植物主要病原菌的方法，其特征在于，包括：

(3)根据所有类型微生物的丰度判断患病植物的主要病原菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通过对所述DNA文库进行物种多样性分析分别获取所述植物发病组织和所述植物正常组织中的所有类型微生物的丰度包括：

对所述DNA文库中的序列信息进行预处理得到优质序列；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述预处理包括如下流程：

(2)将合格的双端raw data拼接，序列拼接时最大overlap为200bp，得到完整pairedend序列；

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述根据所述优质序列的序列相似性，将所述优质序列划分为多个操作分类单元为：按照将序列相似度大于或等于97％的优质序列划归为一个操作分类单元的标准，将所述优质序列划分为多个操作分类单元。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在将所述优质序列划分为多个操作分类单元后，还包括：

重复步骤(1)的流程3～5次，选取多次重复中均得到的操作分类单元进行后续的物种多样性分析流程。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述物种多样性分析包括：alpha多样性指数分析、Beta多样性分析或多元变量统计中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述alpha多样性指数分析包括稀释性曲线、alpha多样性boxplot分析、Rank Abundance和Specaccum分析中的一种或多种；和/或，

所述Beta多样性分析包括基于Binary jaccard、Bray curtis距离矩阵分析、PCA、PCoA、NMDS UPGMA和RDA/CCA分析中的一种或多种；和/或，

所述多元变量统计包括PERMANOVA分析和Anosim检验中的一种多两种。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述根据所有类型微生物的丰度判断患病植物的主要病原菌为：

分析得到在所述植物发病组织中相对丰度较高，且不存在于所述的植物正常组织中的微生物为所述植物的主要病原菌。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述植物为猕猴桃。

10.权利要求1-9任一项所述方法在确定猕猴桃黑斑病的主要病原菌中的应用。