CN111748637B - 一种用于亲缘关系分析鉴定的snp分子标记组合、多重复合扩增引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于亲缘关系分析鉴定的SNP分子标记组合、多重复合扩增引物组、试剂盒及方法,涉及亲缘关系分析技术领域。本发明自主筛选大量遗传标记,SNP分子标记组合包括1400个SNP位点,构建全新的、鉴定效力更强的多重复合扩增体系,用于三级亲缘关系鉴定,为降解检材的复杂亲缘关系鉴定提供新方法。
Description
技术领域
本发明涉及亲缘关系分析鉴定技术领域,尤其是涉及一种用于亲缘关系分析鉴定的SNP分子标记组合、多重复合扩增引物组、试剂盒及方法。
背景技术
复杂亲缘关系分析是法医物证学学科发展的重要研究方向,在司法实践、刑事侦查、灾害遇难者身份识别等领域具有重大社会需求。近年来,单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)成为备受关注的新型短片段遗传标记,在亲缘关系分析领域展现出了巨大潜力。比起传统的STR遗传标记,它们的扩增片段短,在降解检材分析中具有独特优势;突变率远低于STR,约为10-8;不受滑脱峰的干扰,更易于分型分析。虽然单个二等位遗传标记的鉴定效力较低,但在人类基因组中大约包括1500万个SNP,可用的SNP数量非常庞大,通过复合扩增和高通量测序技术,增加检测基因座的数量,同样可达到较高的亲缘鉴定效力。基于高通量测序平台,构建多重复合扩增系统,能够同时检测大量SNP短片段遗传标记,增强对亲缘关系的鉴定效力。
目前,联合检测STR和SNP可以满足一级亲缘关系鉴定及大部分二级亲缘关系鉴定需求,但对于三级亲缘关系鉴定,现有的基于高通量测序的商品化检测系统远远无法满足需求。
基于此,提出本发明以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于亲缘关系分析鉴定的SNP分子标记组合、多重复合扩增引物组、试剂盒以及用于亲缘关系分析鉴定的高通量检测方法。通过自主筛选大量遗传标记,构建全新的、鉴定效力更强的多重复合扩增体系,用于三级亲缘关系鉴定。
具体地,本发明通过以下方案实现:
在一方面,本发明提供了一种用于亲缘关系分析鉴定的SNP分子标记组合,所述SNP分子标记组合包括1400个SNP位点中的部分或全部,优选地包括全部1400个SNP位点。本发明提供的1400个SNP位点在美国国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information,NCBI)的SNP数据库中的rs号分别为:rs11240780、rs3795262、rs2236518、rs4520357、rs3011926、rs11121452、rs2781233、rs2294641、rs7414943、rs3000859、rs3013106、rs10928050、rs638770、rs485874、rs4704、rs12048810、rs1062663、rs1561624、rs2280437、rs4319261、rs2294520、rs7548438、rs4233205、rs2275229、rs7552070、rs2275188、rs1148945、rs2780952、rs12144160、rs12403036、rs803369、rs2298006、rs7551698、rs6671802、rs3737744、rs2070929、rs2758735、rs3088062、rs2065947、rs319953、rs12123698、rs475969、rs6672905、rs213500、rs4628、rs706466、rs2480413、rs12407003、rs835435、rs2236059、rs4915760、rs1056513、rs2229546、rs2295942、rs269350、rs11580409、rs1048575、rs57075265、rs11161539、rs12121540、rs12065422、rs7536101、rs2390057、rs1321694、rs1882753、rs535037、rs358693、rs12022530、rs1048866、rs11165338、rs6663164、rs3766603、rs10875295、rs2030048、rs8676、rs35147679、rs12049572、rs10458458、rs10732635、rs6537825、rs11084、rs34625170、rs347908、rs878471、rs752376、rs7532008、rs2496253、rs7552416、rs6668731、rs3806422、rs3795741、rs4971154、rs7521304、rs1063178、rs9405、rs2298258、rs6426937、rs6691258、rs1476074、rs3886553、rs7553、rs10913530、rs5877、rs520661、rs13306732、rs61310274、rs649437、rs2274064、rs1046934、rs4606、rs672167、rs1139949、rs2296383、rs1022361、rs2279681、rs1130193、rs2232842、rs1062715、rs7556372、rs2842707、rs2013162、rs10864004、rs12567728、rs11580603、rs11803705、rs14137、rs7518358、rs1136448、rs1134898、rs34606532、rs35116708、rs17596、rs1153968、rs1051740、rs6665115、rs7022、rs3736982、rs11122324、rs1294228、rs4649241、rs10927267、rs8025、rs3788961、rs1356316、rs7561274、rs2072465、rs11676272、rs2272386、rs408813、rs218226、rs6728094、rs4542826、rs11690966、rs2286700、rs7578654、rs13008919、rs1051061、rs4671636、rs3770655、rs1137930、rs735815、rs6757629、rs7608459、rs12151791、rs2303606、rs1026150、rs6715729、rs2286994、rs7609111、rs61291641、rs11445、rs12714113、rs1863059、rs867529、rs1158603、rs772175、rs749949、rs4851692、rs10200436、rs3796111、rs7419404、rs11675767、rs3761707、rs7558938、rs1143627、rs13005938、rs2278741、rs2677537、rs6431231、rs34242261、rs10191147、rs610624、rs10445686、rs1446586、rs2304366、rs11688302、rs10490735、rs10206850、rs13387241、rs16826652、rs34132424、rs2432955、rs12470533、rs2124971、rs11884495、rs9713、rs355897、rs1007722、rs777346、rs2241190、rs2229266、rs9631、rs4668246、rs58631773、rs746578、rs825660、rs4586658、rs1406122、rs3219153、rs736320、rs1057392、rs7586196、rs2539863、rs17552879、rs2229589、rs2287599、rs13002712、rs2229571、rs10169718、rs4674354、rs10933049、rs4641920、rs1882435、rs3811514、rs13029754、rs737027、rs2269352、rs6756597、rs4377288、rs12478298、rs7582275、rs57214830、rs3773380、rs163897、rs3749350、rs464392、rs4684782、rs73815733、rs3732666、rs842274、rs3815962、rs2686326、rs62234921、rs1393745、rs35258105、rs3821447、rs4789、rs9864910、rs6599266、rs2293312、rs3736573、rs7622622、rs2290133、rs9156、rs11129967、rs3204849、rs2037391、rs352166、rs2251219、rs17264436、rs3755806、rs4955865、rs7633179、rs6773315、rs1386829、rs6806444、rs6762914、rs1043045、rs2292677、rs40610、rs67920064、rs73124286、rs9816032、rs7626143、rs9861471、rs13324964、rs301949、rs6786354、rs7629487、rs571391、rs939443、rs13324427、rs1289754、rs1381837、rs2399373、rs4682130、rs12695307、rs2289271、rs56728675、rs3732401、rs12489170、rs8935、rs6809407、rs333289、rs2860440、rs2788462、rs13060596、rs72969707、rs3732534、rs6773789、rs12489348、rs4141499、rs13064196、rs2178384、rs2699880、rs2276737、rs3192149、rs1131598、rs10935090、rs13097893、rs9876490、rs1540506、rs3762799、rs7621642、rs9822605、rs62273364、rs9833875、rs1526786、rs12636725、rs954714、rs11708569、rs1132979、rs28690162、rs34533513、rs1048243、rs60512741、rs7625651、rs6792607、rs6773641、rs2431、rs16845891、rs71310518、rs9855544、rs7640306、rs9290650、rs13077058、rs1362650、rs13067678、rs2293031、rs9824、rs2272473、rs2228291、rs4686879、rs11555405、rs9868164、rs3821734、rs6789787、rs4677732、rs1061860、rs1814901、rs2280268、rs58948928、rs12495970、rs57723486、rs1048037、rs4235380、rs2245964、rs7690492、rs6823735、rs8192678、rs2946385、rs2855262、rs734644、rs10030708、rs3733359、rs6855349、rs11734944、rs11722735、rs344122、rs344140、rs4612、rs3733227、rs17010697、rs989902、rs236996、rs1914240、rs2870639、rs4602468、rs2306802、rs12642449、rs7690296、rs2162450、rs2289043、rs7697517、rs11726650、rs10516486、rs223390、rs17215211、rs2765、rs17037102、rs7689008、rs4698797、rs9995789、rs3775839、rs11098472、rs12498258、rs7658836、rs45574236、rs1567047、rs3749507、rs1058267、rs3796700、rs60653888、rs336312、rs1908968、rs10033601、rs6858157、rs6816526、rs1497949、rs13112390、rs7688467、rs6818170、rs6855305、rs3108229、rs367863、rs29680、rs17825532、rs7734564、rs16903264、rs11750538、rs1155443、rs2241337、rs1049524、rs178415、rs10039542、rs40211、rs7730048、rs829259、rs2278351、rs36303、rs10036291、rs2278600、rs636926、rs888789、rs961536、rs7702523、rs3828611、rs1052345、rs369998、rs2035990、rs11726、rs10069050、rs2247870、rs2636、rs2007、rs1230382、rs2617434、rs2303138、rs6876278、rs26821、rs8488、rs400570、rs1129496、rs2964701、rs3797339、rs9112、rs1047438、rs7715577、rs3533、rs248040、rs384556、rs248706、rs2015018、rs4996522、rs26006、rs40401、rs25882、rs162881、rs7404、rs4572、rs27988、rs1368298、rs592403、rs998754、rs61612167、rs3797716、rs2287727、rs827778、rs10155597、rs9043、rs11747030、rs2963670、rs17078347、rs2087210、rs365132、rs1700490、rs251848、rs28932178、rs17078991、rs6877011、rs6904200、rs40762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应当指出的是,以上SNP位点是根据NCBI的SNP数据库的命名方式来表示的。本领域技术人员知晓其他表示方式,如以HGVS命名法标注某位点在参考gDNA上的位置来表示。采用其他命名方式来标注指代与本发明一样的SNP位点或SNP位点组合也属于本发明的范围。
在另一方面,本发明提供了一种用于亲缘关系分析鉴定的多重复合扩增引物组,所述引物组包括用于扩增上述SNP分子标记组合中的全部SNP位点的PCR引物组;
优选地,所述PCR引物组为SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.1400序列所示引物。
在另一方面,本发明提供了一种用于亲缘关系分析鉴定的试剂盒,所述试剂盒包含上述用于亲缘关系分析鉴定的多重复合扩增引物组。
在另一方面,本发明提供了一种用于亲缘关系分析鉴定的高通量检测方法,所述方法包括:
a.获取待检测样本的DNA;
b.构建片段化的DNA文库并纯化;
c.以纯化后的DNA文库为模板,利用上述用于亲缘关系分析鉴定的多重复合扩增引物组进行靶向富集;
d.以步骤c所得产物为模板,进行通用聚合酶PCR反应;
e.高通量测序;
f.测序数据分析;
g.计算似然率,鉴定亲缘关系。
在一个实施方案中,所述靶向富集在同一个PCR扩增反应体系中同时扩增。
在一个实施方案中,所述方法在靶向富集后通用聚合酶PCR反应前,以及通用聚合酶PCR反应后高通量测序前还分别包括纯化步骤,优选磁珠纯化。
在一个实施方案中,所述步骤b包括DNA片段化、DNA片段末端修复、加A操作、添加接头和纯化连接接头的DNA。
在一个实施方案中,在数据分析过程中,对测序数据进行质控,优选采用Agilent2100生物分析仪和High Sensitivity DNA Chip进行质控。
在一个实施方案中,高通量测序可采用高通量测序仪,优选Illumina平台或ThermoFisher测序平台。
在一个具体的实施方案中,本发明的用于人类亲缘关系分析鉴定的高通量检测方法包括:准备样本DNA、对样本进行片段化、末端修复和加A操作、添加接头、纯化连接接头的DNA、靶向富集、富集后纯化、通用聚合酶PCR反应、纯化通用PCR产物、质控及高通量测序。
在一个具体的实施方案中,本发明的用于人类亲缘关系分析鉴定的高通量检测方法包括以下步骤:
准备样本DNA:本发明对DNA的输入量存在要求。扩增特定基因或区域所需新制DNA量要求为10-40纳克,石蜡包埋组织DNA要求量为10-250纳克。
对样本进行片段化、末端修复和加A操作:取片段化酶、末端修复和加A混合液于冰上解冻。短暂离心,吹打7-8次混匀,再次短暂离心收集液体。随后按照下表进行体系的配制。对于每个反应,DNA起始量为10-40纳克。
每个反应加5微升片段化酶(Fragmentation Enzyme Mix),短暂离心,上下吹打5-10次混匀后再次短暂离心,保持冰上操作。此时管内总体积为25微升。设置孵育条件如下:4℃,1min;32℃,24min;72℃,30min;4℃,保持,使用热盖模式。将样本加入PCR仪之前,开启程序,达到4℃时,暂停仪器,将PCR管放入预冷的PCR仪内,继续启动程序。结束后,保持在4℃,将样本置于冰上立即继续下一操作。
接头连接:按照下表准备接头连接混合液,短暂离心,吹打10-15次混匀,进行短暂离心。注意更换接头盖子防止交叉污染。
组分 | 体积(微升) |
上一步产物 | 25 |
连接缓冲液(ligation buffer) | 10 |
IL-N7接头 | 2.8 |
DNA连接酶(DNA ligase) | 5 |
连接溶液(ligation solution) | 7.2 |
无酶水 | 25 |
注意:连接溶液非常粘稠,不可与其他组分提前混入混合体系。
该步骤中每个反应体系总体积为50微升。孵育条件为20℃,15分钟,不用热盖。该步骤的产物可置于-20℃放置3天。
纯化连接接头的DNA:提前配制80%乙醇,准备干净无酶水,共需要3组干净离心管。至少提前半小时取出磁珠。在每个样本中加入50微升水,终体积为100微升。加入100微升磁珠,吹打混匀。室温孵育5分钟,将离心管置于磁力架上放置10分钟。待液体澄清后,小心移走上清丢弃,注意不要丢弃磁珠,此时DNA吸附于磁珠上。每个样本中加200微升80%乙醇,转动离心管2-3次洗涤磁珠。小心移走上清丢弃。重复上述乙醇洗涤步骤,进行二次洗涤。该步骤要彻底移除乙醇,使用10微升枪头吸取残存乙醇丢弃。保持磁力架上室温干燥10分钟,直到磁珠刚变干时为止。从磁力架上移走样本,加52微升水,吹打混匀。将离心管放回磁力架至液体澄清,转移50微升上清液至新的离心管中。在50微升上清液中加50微升磁珠,室温孵育5分钟。将离心管置于磁力架上5分钟,待液体澄清,立即将上清移走丢弃,不要丢掉磁珠,此时DNA吸附在磁珠上;加200微升80%乙醇,旋转离心管2-3次洗涤磁珠,小心移走上清。重复洗涤一次,此时用枪头去除所有的乙醇,使用10微升枪头移除残存乙醇。在磁力架上室温空气干燥15分钟,直至磁珠完全干燥。乙醇残留会影响后续PCR反应。将样本从磁力架上取下,加12微升水洗脱DNA,吹打混匀。将离心管放回磁力架直到液体澄清,转移9.4微升上清液至干净的PCR管内。可继续下一步反应,也可-20℃存放3天。
靶向富集:按照下表准备靶向富集混合液,短暂离心,吹打7-8次混匀液体,再次进行短暂离心。
组分 | 体积(微升) |
上一步产物 | 9.4 |
TEPCR缓冲液 | 4 |
多重复合扩增引物 | 5 |
IL-Forward引物 | 0.8 |
HotStar DNA聚合酶 | 0.8 |
总体积 | 20 |
随后进入扩增步骤。其中,扩增条件如下:
样本可置于-20℃放置3天。
富集后纯化:在上一步扩增产物中加80微升无酶水至100微升。加100微升磁珠至样本中,多次吹打直至混匀。室温孵育5分钟。将离心管置于磁力架上放置5分钟,待液体澄清时,移走上清。加200微升80%乙醇,旋转离心管2-3次洗涤磁珠,小心移走乙醇。重复洗涤一次,此时用枪头去除所有的乙醇,使用10微升枪头吸干净残存乙醇。在磁力架上室温空气干燥10分钟。看到磁珠完全变干时为止。乙醇对后续PCR反应有影响。将磁珠从磁力架上取下来,加16微升水洗脱,吹打直至混匀。放回磁力架至液体澄清,取13.4微升上清至干净管子中。
通用聚合酶PCR反应:若采用QIAseq 12-index I试剂,按照下表进行:
若采用QIAseq 96-index I试剂,按照下表进行:
准备反应混合液,短暂离心,吹打5-15次混匀液体,再次进行短暂离心。
组分 | 体积(微升) |
上一步产物 | 13.4 |
UPCR缓冲液(5×) | 4 |
HotStar DNA聚合酶 | 1 |
无酶水 | 1.6 |
总体积 | 20 |
随后进入扩增步骤。其中,孵育条件如下:
该步骤产物可置于-20℃放置3天。
纯化通用PCR产物:此时体系体积为20微升,加无酶水至100微升。加100微升磁珠至样本中,吹打多次直至混匀。室温孵育5分钟;将离心管置于磁力架上5分钟,至液体澄清,小心移走上清。加200微升80%乙醇,旋转离心管2-3次洗涤磁珠,小心移走乙醇。重复洗涤一次,此时用枪头去除所有的乙醇,使用10微升枪头移走残存乙醇。在磁力架上室温空气干燥10分钟。看到磁珠变干时为止。残存乙醇可能会抑制后续PCR反应。将样本从磁力架上取下,加30微升水洗脱,吹打直至混匀。放回磁力架至液体澄清,取28微升上清液至新的干净离心管内。至此,建库完成,文库在-20℃条件下可放置数月。
质控:采用Agilent 2100生物分析仪和High Sensitivity DNA chip,按照相关说明书进行操作。并对文库浓度进行定量和均一化混合。
高通量测序:混合文库采用MiSeq高通量测序仪和MiSeq V2测序试剂盒,按照定制方法进行测序,选择“Custom Read 1Sequencing Primer”模式,将QIAseq A Read1PrimerI加入测序试剂的18号孔内,选择双端测序方法,进行测序。
在另一方面,本发明提供了所述SNP分子标记组合、所述引物组或所述的试剂盒在鉴定人类亲缘关系中的应用。
本发明提供的一组SNP标记组合,包含大量的SNP位点,覆盖度广,适用对不同人群的分析与鉴定;通过对超过8000个基因型数据进行分析获得的1400个SNP位点和复合扩增引物组,对个体身份鉴定的结果较现有技术更加可靠。
本发明供的复合扩增引物组,相互之间不会相互干扰,利用纯化后的DNA作模板,能够实现对上述1400个SNP位点的同时扩增,通过一管反应即可获得包含1400个SNP位点的扩增产物,方便高效。
本发明针对中国人群的基因组特点,自主筛选大量遗传标记,构建全新的、鉴定效力更强的多重复合扩增系统,用于三级亲缘关系鉴定,为降解检材的复杂亲缘关系鉴定提供进一步保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中1400个SNP的平均测序深度;其中横坐标代表1400个SNP,纵坐标为基因座平均测序深度;
图2为本发明实施例中第一代堂表兄与无关样本之间的对数似然率频率分布直方图,其中:白色的直方图代表无关个体(unrelated)样本,黑色的直方图代表第一代堂表兄(First Cousin,FC)样本。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。除非另外定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
实施例
本实施例中用到的主要仪器与试剂
主要仪器及厂家
主要试剂及厂家
一.样本
89例家系样本,包括68对第一代堂表兄关系样本,无关个体进行两两组合,得到3309对无关样本。
二.实验方法
1.遗传标记筛选
(1)收集8088份中国人的全基因组和外显子组测序数据,得到约26万个SNP和Indel信息。该部分与北京卫吉尔生物科技有限公司(Virgilbio)的“中国万人基因组计划”合作完成;
(2)筛选等位基因频率在0.3-0.7的SNP,得到64576个SNP;
(3)远离常用STR,与常用STR的相互距离大于10,000bp,得到21252个SNP;
(4)筛选杂合度大于等于0.4的SNP,得到8656个;
(5)控制SNP来源的测序数据正反向平衡性大于0.3,得到8640个;
(6)满足Hardy-Weinberg平衡,剩余1404个;
(7)成功设计1400个SNP的引物,构建多重复合扩增系统。
根据SNP位点设计引物序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.1400所示。
2.DNA准备
根据DNA定量结果,取3μL样本DNA,将DNA浓度稀释至5ng/μL。
3.DNA建库
1)DNA片段化、末端修复和加A:反应体系如下所示:
随后,每管加5μL片段化酶(Fragmentation Enzyme Mix),总体积为25μL。孵育条件如下:4℃,1min;32℃,24min;72℃,30min;保持在4℃,使用热盖模式。
(2)接头连接:每种组分单独加入,PCR反应体系如下:
置于20℃PCR仪上孵育15min。
(3)纯化连接接头的DNA:提前将磁珠从4℃冰箱取出,充分振荡混匀后室温放置至少半小时。每个样本加50μL水稀释,随后加入100μL磁珠,吹打几次混匀。室温孵育5min;将离心管置于磁力架上静置10min。待液体澄清后,小心移走上清丢弃。加200μL 80%乙醇,转动离心管2-3次洗涤磁珠。小心移走上清丢弃。重复乙醇洗涤步骤,进行二次洗涤。这一步要移出全部的乙醇,分别用200μL和10μL枪头吸干净。在磁力架上室温干燥10min,待磁珠晾干时,从磁力架上移走离心管,加52μL水,上下吹打混匀。将离心管放回磁力架,静置至液体澄清,转移50μL上清液至新的离心管中。随后,进行第二次纯化。在装有上清液的离心管内再加50μL磁珠,室温孵育5min。将离心管置于磁力架上5min,待液体澄清,立即将上清移走丢弃。加200μL 80%乙醇,旋转离心管2-3次洗涤磁珠,小心移走上清。重复洗涤一次,用200μL和10μL枪头吸干净。置于磁力架上室温干燥15min,待磁珠晾干时,将离心管从磁力架上取下,加12μL水吹打混匀,洗脱DNA。最后将离心管放回磁力架直到液体澄清,转移9.4μL上清液至干净的PCR管内。
(4)靶向富集。体系配制如下:
PCR程序:95℃,13min;98℃,2min;8个循环:98℃,15s;68℃,10min;
1个循环:72℃,5min;4℃,5min;保持在4℃。
(5)富集后纯化:在扩增产物中加80μL水至PCR产物中,终体积变成100μL。加入提前置于室温的磁珠100μL,吹打混匀,室温静置孵育5min。将离心管置于磁力架上放置5min,待液体澄清时,移走上清丢弃。加200μL 80%乙醇,旋转离心管2-3次洗涤磁珠,小心移走乙醇。重复洗涤一次,用200μL和10μL枪头吸干。在磁力架上室温干燥10min。待磁珠晾干时,加16μL水洗脱,吹打混匀后,放回磁力架静置,至液体澄清,取13.4μL上清液至新的PCR管中。
(6)通用PCR。体系配制如下:
PCR程序设置如下:95℃,13min;98℃,2min;20个循环:98℃,15s;60℃,2min;1个循环:72℃,5min;4℃,5min;保持在4℃。
(7)纯化通用PCR产物:在上一步PCR扩增产物中加80μL水,每个样本总体积为100μL。加入100μL磁珠,吹打多次混匀后室温孵育5min,随后将离心管置于磁力架上静置5min,至液体澄清后,小心移走上清。加入200μL 80%乙醇,旋转离心管2-3次洗涤磁珠,小心移走乙醇。重复洗涤一次,用200μL和10μL枪头吸干剩余液体后,在磁力架上室温干燥10min,当观察到磁珠变干时,从磁力架上取下离心管,加30μL水洗脱,吹打混匀,室温孵育5min,放回磁力架,至液体澄清后,取28μL上清至干净离心管中,建库完成,文库可置于-20℃冰箱内放置数月。
4.文库质控
文库质控采用Agilent 2100生物分析仪和High Sensitivity DNA Chip。
5.文库定量
采用Qubit HS dsDNA assay kit试剂盒,操作步骤如下:
(1)配制定量体系。按照染料与缓冲液1:199的比例,计算并配制32.2个样本的体积,包含30个文库样本和两个标准品。
(2)取32个专用定量管,做好标记后,样本每管分装199μL混合液,标准品每管分装190μL混合液;
(3)每个样本取1μL,标准品取10μL,加入定量管内,终体积均为200μL。振荡混匀后离心,确保没有气泡;
(4)将样本避光孵育2min后,放入Qubit 2.0荧光定量仪内,读取定量结果。
6.文库均一化混合
根据上一步文库定量结果,取2μL文库将每个文库稀释至同一浓度1ng/μL,稀释完毕后,每个稀释样本取5μL等体积混合,得到混合文库。采用NEBNext Library Quant Kit对混合文库进行定量。
7.上机测序
采用MiSeq V2测序试剂盒,按照MiSeq操作流程,进行上机测序。
8.结果分析
(1)测序质量分析
目前已完成89例样本的测序,对1400个SNP的测序深度进行分析,所有SNP的平均测序深度处于67×-1423×范围内,平均测序深度为703×,86.93%的基因座测序深度处于400×-1000×区间内,测序结果可靠性高。各个SNP的测序深度如图1所示。
(2)三级亲缘关系鉴定效力分析
第一代堂表兄样本和无关个体样本的对数似然率频率分布直方图如图2所示,灵敏度、特异性及准确率如表1所示。当log10LR阈值取15时,1/68的全同胞被误判为无关个体,153/3309的无关个体被误判为第一代堂表兄,灵敏度和特异性分别为98.53%和95.38%。当log10LR阈值取16、17、18时,分别有2/68、3/68、4/68的第一代堂表兄被误判为无关个体,有101/3309、71/3309、48/3309的无关个体被误判为第一代堂表兄,此时对应的准确率大于96%,能满足大多数三级亲缘关系的鉴定需求;当阈值继续提高时,灵敏度明显下降,低于90%,但准确率的提升空间有限。
表1第一代堂表兄与无关样本之间的鉴定效力分析
本发明自主构建的多重复合扩增系统测序性能较好,数据质量可靠,在三级亲缘关系鉴定中表现出较强的鉴定效力。当log10LR阈值在15-17时,灵敏度、特异性、准确率均大于95%,可满足大多数三级亲缘关系鉴定需求。
根据SNP位点设计引物序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.1400(编号1-1400)所示:
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 军事医学科学院
军事科学院军事医学研究院
<120> 一种用于亲缘关系分析鉴定的SNP分子标记组合、引物组、试剂盒以及方法
<130> PA20011700
<160> 1400
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cttcgttatc tatgcagaag gtctcatcca ca 32
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
aagatggcag aagtcatgtt cgagaacttc 30
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ccccgtctct ctgaagtggg acattc 26
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gctctgaaat gcatttttct gaactctcgt ctg 33
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
atctccaact cggtggtgtt tgagtacaaa 30
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ctcagaatcc accgagacag ctgattcc 28
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
acgattactt tctgtgtcta ccttccaata ctaagtttg 39
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gggaggtgac catgtaactc tgaccaatc 29
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
tgtgaggagc caaataaaca ttttaggatt tgcaag 36
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
gccccatgat accggtgttc attcag 26
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
tcctcgtctt catcctccgc atctttg 27
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
ccctcaatga ccagatttcc cattttattg tcac 34
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
ctgaatccag tgccatccat ccattgg 27
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
tgggcagagg aagatgtcaa caattcca 28
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
ggcccaccca gtgaatgcta atttgg 26
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
cctctccccc tgtcttctac aataatggaa tca 33
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
atccctgctt tttctccatt atcgtccaac t 31
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
gccctgatga ctttgttgtt ttgtgttgtc tg 32
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
agcagaaggt aaagctgatt tatctcaagt gaag 34
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
accccggtgg acgtcctttt atgg 24
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
cgcaaggcta aaatccagac taaaacgaaa g 31
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
cccacttgac agatgaggta gcagatcaat t 31
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
acacagaatc ctgactgtcc ttgtatttgc tatc 34
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
gacacagatg cccttacctg agtgactac 29
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 25
ccaagtcctc tgcatctaga cagggattat tttc 34
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
aggaatactg aatacgtgtt ccttactcaa gttcagtaa 39
<210> 27
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 27
tctgagagga gaactgaaaa gaatgttcta gatttgg 37
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
aaaacaaggc caagcttgac gacattagg 29
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 29
tcatgctttg aggttccctt tatctagatt caaatg 36
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 30
ggcgtggttt cccgggtgat g 21
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 31
tgggaccatc agcaagaagg acattatcaa c 31
<210> 32
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
gggcttctct gacccttgaa cagcttatac tat 33
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 33
tgacccctgt acctgacatc tccagatag 29
<210> 34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 34
agcatgattt tgttcctgct tggctaaatt tctc 34
<210> 35
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
ggaaaaccaa taagcctgtc ctctctcttt tagg 34
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 36
caaacagcct tagatcctac agcaatgact ctatc 35
<210> 37
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 37
ttggtcccca cagattcaca gttagaacaa tt 32
<210> 38
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 38
agattcctat ctgacagatt tcttcactta tgtgagtagg 40
<210> 39
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 39
ccctctccca gtctaaatca taacaaaagc atcac 35
<210> 40
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 40
tgactgttta cttatacgtg gctctatgga atacac 36
<210> 41
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 41
gctttttctg ctttcactga attaggtgac tttgg 35
<210> 42
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 42
tgggaaaaac tgttcaaatt gggtcctttt aagc 34
<210> 43
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 43
aacaatacct acttaataca atgggtgaga gaagtaagc 39
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 44
aagtacagca ggtatgtgta gtgtaagaat ccattg 36
<210> 45
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 45
gaggtgataa ggccttagaa ctgggaatct agatt 35
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 46
gctgcttttc tcctttgtgt ttgttaccta tgagt 35
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 47
actctcctta cttgctaagt ggtgagaatt aaacac 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 48
cgtttccttc acatttcaac tccgacagat 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 49
attgaaagag gagatggtag aaaaaccccc taattg 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 51
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<400> 52
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<213> 人工合成
<400> 54
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<213> 人工合成
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ttcaaagctg aaatacccct ggtggaataa atc 33
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 57
ggctttattc tgggattatg ggcacttatt atcatg 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cacacttcat gctctcaaaa taaaaagtgc ccta 34
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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gcagacgccc tttgtacatc cacttct 27
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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ggactgctgt cataaggaat aggagttcca aaa 33
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<213> 人工合成
<400> 63
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 64
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 65
gaccttatca acagcctgaa tagcaatgaa aagatc 36
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<213> 人工合成
<400> 66
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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gaaataggcc tcttcttgat gagacccaaa ctat 34
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cggccaacaa tcagtgagtg tctaagaaca t 31
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atcctacaaa tttaaggaca gttgtgacag taatctgac 39
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<400> 82
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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aactgaagaa agtgtctata ttggaactag ggtcatttg 39
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<213> 人工合成
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ccagaacatc agggtcaagg gctaattaaa c 31
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
<400> 89
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<213> 人工合成
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ctctcctttt ctttttcctt taaacttgca ggttcc 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 92
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 93
cagttctcct ggccctagga cttacttatt aca 33
<210> 94
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 94
acactagcaa ttattactta cctggatact tctctgtaac c 41
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 95
ctttgcctct atccttagct gaagacaaac tagag 35
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
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tggtcacaga tccaatgctt aaagttgatg a 31
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 97
tttcttccct agacaggaga caatccatct tacata 36
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 98
atcaacaccc ctccttaaat cagttttcca tctc 34
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<211> 31
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<213> 人工合成
<400> 99
cctaggacta ggctaaagtt gaacccagaa t 31
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<213> 人工合成
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<400> 101
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 102
aagaaataca tgaagatctg tacctgattt gtcctgtag 39
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<213> 人工合成
<400> 103
accaccagca tcatctcctc caattcatc 29
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 104
aagcagataa ttacatagtg aaagtgagaa ctggtaacc 39
<210> 105
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 105
atggagtctt actctgcttt tattctcaag aatggtatg 39
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<211> 31
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<213> 人工合成
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atgcttgatg accacttgat gattggaaga a 31
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 110
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
<400> 112
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<213> 人工合成
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cccgatgatg gcatagatga tgaccataaa gag 33
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<213> 人工合成
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tgtgaaaaat agtaagagcc agctaggata tttggattc 39
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 115
ctttggcttt cagctcctcc tccctatatg 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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cctttcttcc ccaacttacc gtcttgtcta g 31
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<213> 人工合成
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gggttctaga ttcttctctg gatctttctc atagagatg 39
<210> 119
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<213> 人工合成
<400> 119
ccagaaaatc tcaccctttc ttcactaggt gta 33
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ctctgttagg taataaagtc cctgtgcatc tttaca 36
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
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gccaatgtat tgacagtccc aaggtcaaaa c 31
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<211> 32
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<213> 人工合成
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gtgcctcttt tgaactctca gtaagctgac tt 32
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<213> 人工合成
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catgtaaaag agcagactat tctaacagtg tgatgactc 39
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<213> 人工合成
<400> 124
ctcaccttat atgagctgag agaagtcaaa tcttatcca 39
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gtggatccac gaaaggtgct aatagtagc 29
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<213> 人工合成
<400> 126
tttttatgcc gaggagatgg agtagtcttt gtag 34
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<213> 人工合成
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tggattttac gtctcagaag ctcatatcta aagcaaaag 39
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<213> 人工合成
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cacttgatgg acttagagag cctgtattct cat 33
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
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catttccctg caagtgttga tgttgaatcc at 32
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 131
gcctactcat gtggtttgat tcatgactgg atc 33
<210> 132
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 132
gcgctgaccc ccagtttatc attgg 25
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cttgtgatcc tccctcatac atggactcaa c 31
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
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ctatggcttc aactccaact acctgaagaa agtc 34
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 135
ggcctcgccg aactttacac catc 24
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 136
ttttaaaact cagaattctt tcctaagagc ccttcg 36
<210> 137
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 137
cacctcacaa tcaagagtaa cagctaagta tccatt 36
<210> 138
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 138
gatgatcttc ttcccttgct tccagaatta ttgc 34
<210> 139
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 139
catggtaagt tttgccctaa ggaaaacgat cttg 34
<210> 140
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 140
ccatcctctt ctgtgttctg ccactaaatg at 32
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 141
ctggtcaaac atatttcctg tatgctttgg atgatg 36
<210> 142
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 142
tcctttctct ttaggctttt gatattatga gagtgacac 39
<210> 143
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 143
gggtgtttag agacttccaa gcaatcatga aac 33
<210> 144
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 144
tcctgggaat ctaagatcta gaagtcatag aaagagatg 39
<210> 145
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 145
gagaggaaag agaattgcat ttctgacgag atctt 35
<210> 146
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 146
ccagcttttc aaagacagac acaggattat tcc 33
<210> 147
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 147
caggaaccac agagataagc agtcatgagt c 31
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 148
gggacaagga gtctctctgt tgttctgtaa tagt 34
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
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cccaggtggt taaacttcat aaaatgccta gatattttc 39
<210> 150
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<213> 人工合成
<400> 150
ctccaagaag ccttacctcg ggtacaa 27
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 151
accctgtgaa gctgatcagt tttcttgtat ctac 34
<210> 152
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 152
aagtgctact agtattcaaa tcagaaactt accacatcc 39
<210> 153
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 153
aaactttgga acctacactt agccaaaggt caat 34
<210> 154
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 154
gcactgatct gatagactca ttggaattct aagtct 36
<210> 155
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 155
ttgagggacc aagactagag gtggaaatag g 31
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 156
cagtcttgca gagcctttat cattgtctga ttttc 35
<210> 157
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 157
atcctcgggc cagcacaata ttcctc 26
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 158
agcactacag tcaatttcgc cattgttgaa g 31
<210> 159
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 159
aaattagagc caggttacgt gtccaataag catt 34
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 160
aagatctccc cacaagcaag tgtatccttg 30
<210> 161
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 161
ggactaggag ttatgataca ctctattcat gtccttctg 39
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 162
actcaagtca aactcaggag caagactgtt tac 33
<210> 163
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 163
agggtctgca tcttcagcat aaactgttgt 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 164
tctttgccca cctccttctt tttaagataa gtatgc 36
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 165
gctttttgtc taagtgaatt cttatgcctt ggtcag 36
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 166
atgacttgca tcacattata caggtgttgt gag 33
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cttggcactg atggttttat gaagcttaaa gtcag 35
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
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agcctacagg tcacatttac ggttacttat cct 33
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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caggtacgac atgtataggt tacctagatg ttatgagaa 39
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cctacttttc tgaattgcta tgactactcc ttgttg 36
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<211> 28
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<213> 人工合成
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gtgtttctgg atcctcaaca aaatggcatt cc 32
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<211> 39
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<213> 人工合成
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tctgcataat gggatttggg ctttggtaca 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 274
cgccgtcgct ccgtcataga gttc 24
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 275
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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atgcggaaag ggaaaatcac ctataaccca att 33
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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taacaggctg ttctcttctc tctgtagaca ca 32
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<213> 人工合成
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ctgatgctat ggactccata ctgttggata tattgt 36
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<213> 人工合成
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cacagatggt gtcatgttgt tcagtgagaa 30
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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gactgtataa acttccaaac cactagaggg aaatagttg 39
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<213> 人工合成
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acctcatttt aatttgtgga taggagggca taattagac 39
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<213> 人工合成
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caacaactct gtttaggttt gagatgactg tgaac 35
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<213> 人工合成
<400> 377
cttataatga ggaagagtta tgggtcctga gtgtaa 36
<210> 378
<211> 39
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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gagcctatca tgcaatttgg agtctgtcaa tg 32
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<213> 人工合成
<400> 389
gaataaaaca ttctgagaga tcccaaaacc agca 34
<210> 390
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 390
attccctgta ctcttcagtt cttacatgac taatgc 36
<210> 391
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 391
ccagctaagc catttccata cctggtacaa t 31
<210> 392
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 392
gtcctcatct caagtcatct gtaacattta atgtgactg 39
<210> 393
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 393
gactgaagcc tcaaatccca tgtcttctat agc 33
<210> 394
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 394
catgtagagg ttgtatgaca ttgagctaag agataaacc 39
<210> 395
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 395
tctcccatct tctttgtgtc atttcctctg ataaac 36
<210> 396
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 396
caccaaattg tgagtgcttg taatttaggt ctctct 36
<210> 397
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 397
gcattactta gtctgagacc aaactcaaca tacaag 36
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 398
agggagaagt tcctacccta gaaacttgta aacat 35
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 399
atcgacatca aggaacacag tgcttatgac att 33
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 400
atgtcctatt agcattcaga gctaatagat actattaagg gaaa 44
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 401
ccagtaatgt aaacacagag acagaacatt gagatg 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 402
ggtcagagtg tggataatcg tggtatagca aa 32
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 403
ttggtgcctt tctgaatcag ctagaaggaa g 31
<210> 404
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 404
acctttagtt ataaggtgat ggtgagtaat agcctttgt 39
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 405
acagacagaa gcaagcggat gttgtttg 28
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
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caacatgacc aatgagaaga tgcaccacta tatca 35
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 407
aagtctgtta aaggtaaaaa gagatattca tccccttcc 39
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
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gccttatgtc ttttgggttc ccatatctta tcattactg 39
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 409
cagggcctac tgtaatcttt tctccactaa tttgaa 36
<210> 410
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 410
ctcctaaata aacactaggc tctctcacct ttacattct 39
<210> 411
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 411
gaataggtgt tcaaggaaag aatagaatgg agtatcttag c 41
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 412
cttcactacc caatgactcc ttagaatagt ctggaa 36
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
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aggctgagtg gtataatcat gcaaggttat gg 32
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 414
cagcagcaat agtaacagga ggacaattag c 31
<210> 415
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 415
ggtgcaacta ctcatcgtct gtttcagtgt atc 33
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 416
cctagctgct cagtaaggtc cgagatttc 29
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
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ctggtcacag gtaagtagct cttgatagcc aag 33
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 418
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 420
gttctacagg atgaaaagct aatgcccgta ct 32
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
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ttcctcctcc catcatgatg caaagaatca g 31
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ccaactggta gtccattaaa ttctcctgtc taga 34
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
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cttctgtctc aatagggtca gatattttgc actgt 35
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 424
ggcaaggtag cacgcataac ttgaagatat tattga 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 425
ccctgcttct tggctcacag ctatgtat 28
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 426
gagcagatcg cacatttgtt ctttccatat gt 32
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 427
gagagatgat agaatggttg tcactttaag ctccta 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 428
agctggagat aactgcttat gccagataat ttaagtaag 39
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 429
aggtacagtt acttcttccc taagctcatc ttctaa 36
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 430
gagctggagg atgagcaaga ttattctgac t 31
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 431
aggtggctct gtcttgacca attttgaagt 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 432
atttctcttg ttctttctgt cggttgaatc tgag 34
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cccctctctg gacaatttgc ttttcagagt a 31
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 436
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 437
gacttttgtc gccacccttg atttgaaca 29
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 439
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 440
ggctttctac ctacctacca tattatcttt ctcctgatc 39
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 442
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 443
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<210> 445
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 446
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 447
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 448
gtcactgatt tctcttctct ctgttggttg tagg 34
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 449
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 450
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<210> 451
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 452
ctgcataatc agtggcagag ctagtattac ga 32
<210> 453
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 453
gtccatggac aattttatcc tgcgagagac a 31
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 454
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 455
tccacctttt ctttctgctg gatcaatcta aagtc 35
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<210> 458
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gatggtgata aaatggctcc ttcagttgaa aagaag 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 460
cattaatcct cctcatgtaa atattcccaa tactctttca gtc 43
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 461
gcagcagagg gaagaacacc tttctctac 29
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 462
ctccaatgtg ggtgatagag taagaccgta tct 33
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ccattcaggg ctgatttatg ttctgtactg aa 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
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ggcctaaacc aaaaacagag taggtgataa gc 32
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<213> 人工合成
<400> 465
ctgaatcctc caggtaagca atactgtatg tatactttg 39
<210> 466
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 466
gagttacact cgtctcttaa tagctgccta ct 32
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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ctgagaatag attagacacc aaggaagaaa agagtgtag 39
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<213> 人工合成
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cctgtggttt acattgtgca atttcatgtg acatag 36
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<211> 36
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<213> 人工合成
<400> 470
acaaggttca ccactcagac ataacttttc acttac 36
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<211> 36
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<213> 人工合成
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aggtgaagtt tcaaatagcc atcatattga gaacac 36
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<213> 人工合成
<400> 472
gattctctgt catattcttc tccgatccat atgtatgac 39
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 475
gtgtaatcta acctgctaaa aatggacccc ctaag 35
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<213> 人工合成
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tgccttagct tacagtctaa actaacaggg ttaaac 36
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
<400> 480
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<213> 人工合成
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gcgtgaatcc ctaccactac cagagagtag 30
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<213> 人工合成
<400> 482
ggcaactcct ctggactaag ttctaccaat t 31
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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ggtgtccatg ttgaaggtgt ccgtgaa 27
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 485
gaatcatcta caagtccata tgttacctca tacaagtcac 40
<210> 486
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 486
ggttgctttt cttgtttctc ttccattgta catgtg 36
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<213> 人工合成
<400> 487
ctgaaggaga aataccacca agagaacgaa ctt 33
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gacagtaaat cgggcttcag ttctatagcc aag 33
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 490
gggttgttct agcttgtttc tcactgtacc taa 33
<210> 491
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 491
gtctcttcaa gacgaatcta gttttcacct tcaca 35
<210> 492
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 492
tctctggaga cttcatacaa ctaagggtca tatgg 35
<210> 493
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 493
gccctcaggt ggtgacgaaa ggta 24
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 495
cgagtctcct tgctcaggtt ttatctcttg tta 33
<210> 496
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
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gcacaagcca ttcacgtgct ggaat 25
<210> 497
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 497
tatccatcct tacagcagct gttacagagt atatgg 36
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
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cacttgacac aaataactgg agacccacgt at 32
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ctggatcttg gaaaaccacg cttgtttaag t 31
<210> 500
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 500
cagtacttca catcgacaca gtcagacgaa a 31
<210> 501
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 501
gacacaatag ccgaaataat tgcatcgcgt ag 32
<210> 502
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 502
ccgtccaaaa gagatcactt ccttcatgat tgaaa 35
<210> 503
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
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agaatctcca ctgtagtccc cctaacaaac a 31
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ggcctcatct acttctttta aattctccac cttatctct 39
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catctttcca ctccactgta tgctccataa gg 32
<210> 506
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 506
acaagaaaca cagcagaaca cagaggttac aa 32
<210> 507
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 507
ctcctgcaca tgactgctcg tgtttc 26
<210> 508
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 508
gatcttctcc tctgctgtcc ttttgtacag tac 33
<210> 509
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 509
taaagaatgt ctcagtctgc cttaaaggaa ctgtg 35
<210> 510
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 510
atcctgtgta ttcttaagta tatacgcttc ccttcc 36
<210> 511
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 511
ccagtgtgta gattttcaca tctaagttct gaagacatg 39
<210> 512
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 512
agagaccagg gacttgttca cttcagtaac t 31
<210> 513
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 513
ataactcact gagccacact taacgtgagt g 31
<210> 514
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 514
gtccagatcc tttattcctt tcttctagag acaaaagtg 39
<210> 515
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 515
tcacagttgt cacgttttaa tttgttttgg gtgag 35
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 516
ggcatgtcat gtgtcttttc cttcaccaa 29
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 517
ctgaacccac ttatctacag cctcagaaat act 33
<210> 518
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 518
ctctcattgt gcagccagat atttttgatg aatgtg 36
<210> 519
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 519
catctgcagg tgaatctgaa atttgggtct g 31
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 520
ctgtgtacta tcagtatctg tctcctaaac caattatgc 39
<210> 521
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 521
tgatggagct atttcttcct agtatcagga gcaatt 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 522
aaaaagcaga ctcctttcat gcattgggat 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 523
ctccccagcc tcagttacct gtgaaag 27
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 524
cactttcacc tacgagacag agaaaacata agct 34
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 525
atattccggg attcccaatt ctcatcaact ttaagg 36
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 526
cagtttctcg taggaacaga agaatcgcac at 32
<210> 527
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 527
agccttttcc agatgaggat ttctttaagt tctcag 36
<210> 528
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 528
cagggttctg ggaattttgc aagttatcct 30
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
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cttaccttgc tttccatttt aacctgtaag ctgtg 35
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 530
cagcatctgg acctcttagt tcgtgactc 29
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 531
ttactgctgg tggttcctga actgaagatg 30
<210> 532
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 532
ccagtccctg cttagccaaa tggactc 27
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 533
gcatcttggg aatttacctt cattactaat tctcccttg 39
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<212> DNA
<213> 人工合成
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caggtagatg aattaccaca ccatttccat tgaatg 36
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 535
gtctttcctc ctcctcttgt cttcagttaa tttagt 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 536
cagttgtctt tcatccccaa caaaacttac atca 34
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 537
gggtatccct gatatgcaca atgaatacaa acc 33
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
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caagctcttt ctcagaagct cacaaaactt aagac 35
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 540
ccttgttgac tgtttgaaca tggaaaccct tg 32
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 542
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 543
acttttcagg aacggcccaa gattgttcta a 31
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 544
ccacaggcac attctgttta aggttctttt cat 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 545
tggtacgtca ttattccaag agagtgggtg tat 33
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 546
aaggcgtctt caaggtaatg aatggactt 29
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 547
cagtttacac ctcgggcgca taaagtttt 29
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 548
cttgcctccc cacttatcag caaattccat a 31
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 550
ctgactctgt acttattaaa ctacacagga agaggtaac 39
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 551
ctggaggaaa caaagaaatt gagctgagca at 32
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 552
acgcccctta aagtgtagct tgtaagtcaa 30
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 553
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 554
gagtgatgcc agctcctcta gaagattatt atgc 34
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 556
tgataaattg gctctatctg ggaagtggga taaatg 36
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<213> 人工合成
<400> 557
cttgatgggc tgatgagatg agtttcactg tag 33
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 558
ccatctggga acatggccct aacaa 25
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<213> 人工合成
<400> 559
cagagatctg gaaccacggg tagtgagtc 29
<210> 560
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 560
ggattgactc cctcagaagt tgaattccaa gaa 33
<210> 561
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 561
ccctttaacc acacctgagt ttatgttaat gggatt 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 562
cagacgcaga aacgccgttc acaa 24
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 563
aggttctaag agaggggcta gcagctttta 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 564
gaggccaagg catcccattc aaaaag 26
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 565
agtttccttc cagaacatcc tgcctttagt c 31
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 566
ccaactctgt agaggatgac tatattaggg actatgaag 39
<210> 567
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 567
tgagtggaat tactaggtaa gtcaaatcct aaagagtga 39
<210> 568
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 568
cttttggctg gatcattcag agctctcttc tag 33
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 569
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 570
gcgtaaaact cacacacagt tacacaacaa ttcaag 36
<210> 571
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 571
tgttgatctg gaatcctgac ttgagataac atctagatc 39
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 572
cttttcagtt gatccctttg acatcacctc tcat 34
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 573
gttctcttcc taacagacac gagacgactt 30
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 574
aattgagaag tgatccccag cattgagatt gaat 34
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 575
cttctcctta aaactttgtt tcatttgtga ccagct 36
<210> 576
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 576
cactcatcac ttggctcaca acaagatctt t 31
<210> 577
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 577
ctttcctctc ccagcttcat tcagatatgg a 31
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 578
agcccaacct cttacttgtt ttatgacatt ctctac 36
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
<400> 580
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 581
ctcctgtgtg cccttctcct gtagaatt 28
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 582
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cctctgcttc tcggcgtcat agatcatg 28
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<211> 28
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<213> 人工合成
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cttcctcctg aagtatccag aaggctac 28
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 585
ctgaaattaa tacactcgtg agtattgcat ccaagg 36
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<211> 24
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<213> 人工合成
<400> 586
cccccgccag tgccttggat attt 24
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cccgttggcg tctgaggtaa gtttttg 27
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<213> 人工合成
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ctctctgggt agtaacactc agctgaatta agg 33
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 589
cttctcccac ttccattcgc gaatcac 27
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<213> 人工合成
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catgcctcca tgcacataaa ataactcaca ctg 33
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ctgttgggag atctctaaca gctgcataca a 31
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<211> 33
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<213> 人工合成
<400> 592
cgtacatccg cattttctgg acagtcttta aga 33
<210> 593
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 593
ggtttccatt tggtctgtgc tagagtctaa gt 32
<210> 594
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 594
ctgcatctgt gatctcaagt ctctactgga att 33
<210> 595
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 595
gaggatgatc tggcctcaaa tgtttgtcat ac 32
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<213> 人工合成
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gcattctcgt ccctctggaa gtatcgt 27
<210> 597
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<213> 人工合成
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cggccgccta gctacagttc ac 22
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
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gctcctagac atttctgcgg gaagatattg g 31
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 599
ttatccaaga gctagcaaat aaggacaaat gatcca 36
<210> 600
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 600
ggccatttgt gttttctttt gtgcagaata gatacc 36
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
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ggtaaccaag tgcctctaag tcatgcttat ttgt 34
<210> 602
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 602
tggatgacag ctgagtttca atgtcctctt c 31
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
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ggagaggaaa gcactgggac aaatattggg 30
<210> 604
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
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ttctccgagg taaagtaaga gattcatgag ttttgtaac 39
<210> 605
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 605
ggaaggttcc gcgatctttc tattaaccct a 31
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
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gacatctcgt gttcctacta aattcttgat aacataggg 39
<210> 607
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<213> 人工合成
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 608
cccctttata tgaaattgtc atctttacgt cagagactg 39
<210> 609
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
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tgtgaacttt cagatgaact tgaagatatg atctctgac 39
<210> 610
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 610
tcattagtga tggctccaat cagaaattac ccttag 36
<210> 611
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 611
tcttcattaa agaggagtgt attcttaccc caagag 36
<210> 612
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 612
agctgggaat gtcttcagtg gcattagtt 29
<210> 613
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
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gggatcggga tttatttcta ttggtccaaa tgttc 35
<210> 614
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 614
cagggcaatt aggaagtatg tgtagccata ttga 34
<210> 615
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 615
catggtggag tccgtgtcct gatttc 26
<210> 616
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
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ggaatcggga cagggtcaca gattacc 27
<210> 617
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ctgaggtaac aggaattcca ctcgagtc 28
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<211> 27
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<213> 人工合成
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caatgagggc gatcaggaag acacttc 27
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<211> 28
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<213> 人工合成
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ggatcccatc ctatacactg gaggaaag 28
<210> 620
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
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tgatgtacaa tcagccgact cttcaagg 28
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<213> 人工合成
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ttcgtcctcc aaaatattaa ggtcaacttc aaagatacg 39
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<211> 31
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<213> 人工合成
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gggaacgaag gtgtaaatct actgtgtcga t 31
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<213> 人工合成
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catcaccatc actactcaag ttggagaaat agagg 35
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gaagagaacc cagggaagtt cctttttgaa gtag 34
<210> 972
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 972
gttgtggatg aggaagccca gaatctttta aac 33
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 973
gcccaggctt caaatgtaaa gttcttaata cttagc 36
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 974
tgggcattct ttcagtgaat tgctttcttt gtac 34
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 975
accttaacca gaatgaggag atcttacaga ctgag 35
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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ctggcctctg agttctaaga ggcagtag 28
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<213> 人工合成
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ggctccctcc tgtctctaag tcaattcca 29
<210> 1067
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<213> 人工合成
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tgattacaat cacacagaca cttccaagc 29
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gtggaagtca cactgtccta caaatctaag c 31
<210> 1071
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<212> DNA
<213> 人工合成
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agccttactt tgccagtctc ctaagaatat aatcag 36
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<211> 36
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<213> 人工合成
<400> 1072
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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ccgctagctg tgaggttcat tgctacc 27
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1086
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1087
cttcctctgg aaactattct cggttttcta ataagc 36
<210> 1088
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1088
gcaagtcttt ttcaacagaa cttcacagac tgttag 36
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1089
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<211> 39
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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caagttccaa cctctgaaga cttttccgta ct 32
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1110
ctggcagttg agtcagattg taggaaaatt aacc 34
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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gagtcttgct tgacatacag cagaagtcca tag 33
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
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<213> 人工合成
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agcccctcag agtttttcct tacttgttta gg 32
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
<400> 1137
gctaccacaa ggattcctga gctagatttt ca 32
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
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ctccaattag agtgattatg gaaaacaacc tgactc 36
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1140
tgtgataact ggtattttag ttgactgtag acgagtctt 39
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1142
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1144
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1145
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1146
ggacaaactg tggctatgaa tctggagatc at 32
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1147
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
<400> 1149
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<213> 人工合成
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gcagagattg atcatgccta caatgacaac tg 32
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ggacaatctg aagactcaag aatcaatctg agtgaa 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ttgatctttc cctatcttga ttagatccaa agtcaaagc 39
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cacttgcacc tcagatactg cttcaagaac t 31
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<213> 人工合成
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
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<211> 31
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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cttctcattt aaggacatga gttcactgga gtattactc 39
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ccacaacggg ccgtctgcaa ac 22
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<213> 人工合成
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ccagtggcat gggtctctga gagaatc 27
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<213> 人工合成
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catggataac aggaggaatg acgattgcaa atg 33
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<211> 34
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<213> 人工合成
<400> 1172
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1173
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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taactgtggt tgtggtttat tacagatggt catctc 36
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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ccatacatgc agactccctt tgactctgaa g 31
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<213> 人工合成
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ggctcccttc ctcatttatt taatggcatt ataagc 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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gtggaaatgg agaagaaaac tgggcattag c 31
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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gggaaaaaga aaagaactaa ggcaggacac ttattagag 39
<210> 1184
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1184
cgtgttatta attaactcca tgtccctgag gtagaaaag 39
<210> 1185
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1185
caagaattat tgtcctcatt tactgtggag agacctaag 39
<210> 1186
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1186
acttctccta cttaggtcac tttccaaaag tagtaactc 39
<210> 1187
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1187
gcaagcaaag tactggatcc cattgttatg tcta 34
<210> 1188
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1188
ccctagatgt gttgtgtcca tctcatcaaa gt 32
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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gatctggctc taagatggta agatttacag aattgc 36
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tctgctcgtt actatgcatg aggtaggcta t 31
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<213> 人工合成
<400> 1198
caggctaaat tgtgacttta gagccatctt gaac 34
<210> 1199
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1199
ctgctgatca gtcaaccatc atttgttgtg tc 32
<210> 1200
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1200
tgaggccagt taaaagattt actatacctg tatctgtgt 39
<210> 1201
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1201
acacattctt agagcatagt aagcagtagg gagtaa 36
<210> 1202
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1202
ctcctgaact ttctaccctg cctaaaattt tgg 33
<210> 1203
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1203
atttctcccc acttgagaat cacttgttag ttcttg 36
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1204
cctccagcaa ctacagaaat cagtgcagat t 31
<210> 1205
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1205
tggaagtttt actgccaaat agtactctat ctgacagat 39
<210> 1206
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1206
aacgcaactg ttttgaacaa cttacaagga ttcc 34
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1207
acatgcaagt tgttacgatt gagctgtatt acca 34
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gacaggtgga aggaatggag gattggaag 29
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1209
catctggcac tctagtccct ctctttcag 29
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1210
gttctgaggc tagcaccact tcaacaattc 30
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1211
gcactcaagg gcaaggatat gataaatatt taggtacac 39
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1212
gttcagctcc agagattgat ccttcatctg at 32
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
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aagtctgtct aatcacagca accgtaataa ttatcatgg 39
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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cccatttctg tgtcagatgt tcatagctga gtaa 34
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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tgccatgtac atacctgggt atcatcattg acta 34
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cttgcaaccg tctgttatgc tgtgacac 28
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<212> DNA
<213> 人工合成
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agtgattctt ctaagaatta gatacttgtc actgcctata cc 42
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1220
ttgtgacagt tacgcaaatc agcttgaatt cc 32
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<213> 人工合成
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ccatattcac ccaatagtta cagaatattg ccagac 36
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<211> 36
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<213> 人工合成
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gcagcacgtc agggtcataa aaatatagtt ttgaag 36
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1223
gcaagtgaat cctgagcgtg atttgataat ga 32
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1224
acaatggtgg catgaaactg tactgtctta ttgt 34
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ttctgtacat ggaaagagct aataattatc cctctgtca 39
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<213> 人工合成
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tcgaaatgcc agtacacctc tcgacc 26
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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catataaaga aggcatccac gaagcagtag aaatgt 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ggacttctca tagaaaattc agttactagg cattgttgg 39
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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ttgcttctcc tccagctcaa agttgacg 28
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1243
tccaaagaac tcagtaccta catctttgaa ctgaac 36
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1244
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1245
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1246
gtgataggaa acagtgagcc atttcagagt ctag 34
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1247
gacacaaaat ggtatgtgct gtactttggt gac 33
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1248
aggtcagcat taatattctc ctataaacct agacttctcc 40
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1249
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1250
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1251
gaacaaccat ttacccctcc ttttcaaact agagaa 36
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
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ccaccaattc cagcacattc aatctacaca ac 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1253
agagacgctg accaataaag cccatattct ac 32
<210> 1254
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gcctgtctca gtgtgaataa ggagacctat tga 33
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gccagaggtt gcaaacatcc ggattg 26
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1256
gggcttcatc tgtgtatttc ttctttccaa atagg 35
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<213> 人工合成
<400> 1257
ggcaagcaca cctattagct tagtgcaaa 29
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1258
ggcactctcc ctagtgtcca tgggttag 28
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
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tgtacctggc tgttcacttt aagatatttt ccagtc 36
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1260
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<210> 1261
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1261
tccatctcct ttaccctcat atggaatata tctctctgt 39
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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gctttgtaga tgcttcagta ctgatgtgtt tctactatg 39
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<213> 人工合成
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ggagttgggc ttagaggcta tttttgatca ca 32
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<212> DNA
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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ttagagatct cacccttcag cttccattct acatag 36
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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ctcggctctg tcatgctcat atacatgttc t 31
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<213> 人工合成
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acgagtattc ttgactagtg tttactatct ataccccca 39
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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cacagctatt tctgcaccat cctaataggt attgt 35
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1294
agcatgctcc gctctactga actaaatgat 30
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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agtgtcatca ttcactcttt tgtgttctag tgatca 36
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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cctgccttag tgtgcaatct catttgacta tacg 34
<210> 1306
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<213> 人工合成
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catctcccat gtggttgaca ttcaagttgt tc 32
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<211> 32
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工合成
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caccaaagca aaggacagat ctcaagacaa c 31
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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cctaaaggcg tccatgtaaa cttttgctca atc 33
Claims (11)
1.一种用于人类三级亲缘关系分析鉴定的SNP分子标记组合,其特征在于,所述SNP分子标记组合包括以下1400个SNP位点的全部,分别为:rs11240780、rs3795262、rs2236518、rs4520357、rs3011926、rs11121452、rs2781233、rs2294641、rs7414943、rs3000859、rs3013106、rs10928050、rs638770、rs485874、rs4704、rs12048810、rs1062663、rs1561624、rs2280437、rs4319261、rs2294520、rs7548438、rs4233205、rs2275229、rs7552070、rs2275188、rs1148945、rs2780952、rs12144160、rs12403036、rs803369、rs2298006、rs7551698、rs6671802、rs3737744、rs2070929、rs2758735、rs3088062、rs2065947、rs319953、rs12123698、rs475969、rs6672905、rs213500、rs4628、rs706466、rs2480413、rs12407003、rs835435、rs2236059、rs4915760、rs1056513、rs2229546、rs2295942、rs269350、rs11580409、rs1048575、rs57075265、rs11161539、rs12121540、rs12065422、rs7536101、rs2390057、rs1321694、rs1882753、rs535037、rs358693、rs12022530、rs1048866、rs11165338、rs6663164、rs3766603、rs10875295、rs2030048、rs8676、rs35147679、rs12049572、rs10458458、rs10732635、rs6537825、rs11084、rs34625170、rs347908、rs878471、rs752376、rs7532008、rs2496253、rs7552416、rs6668731、rs3806422、rs3795741、rs4971154、rs7521304、rs1063178、rs9405、rs2298258、rs6426937、rs6691258、rs1476074、rs3886553、rs7553、rs10913530、rs5877、rs520661、rs13306732、rs61310274、rs649437、rs2274064、rs1046934、rs4606、rs672167、rs1139949、rs2296383、rs1022361、rs2279681、rs1130193、rs2232842、rs1062715、rs7556372、rs2842707、rs2013162、rs10864004、rs12567728、rs11580603、rs11803705、rs14137、rs7518358、rs1136448、rs1134898、rs34606532、rs35116708、rs17596、rs1153968、rs1051740、rs6665115、rs7022、rs3736982、rs11122324、rs1294228、rs4649241、rs10927267、rs8025、rs3788961、rs1356316、rs7561274、rs2072465、rs11676272、rs2272386、rs408813、rs218226、rs6728094、rs4542826、rs11690966、rs2286700、rs7578654、rs13008919、rs1051061、rs4671636、rs3770655、rs1137930、rs735815、rs6757629、rs7608459、rs12151791、rs2303606、rs1026150、rs6715729、rs2286994、rs7609111、rs61291641、rs11445、rs12714113、rs1863059、rs867529、rs1158603、rs772175、rs749949、rs4851692、rs10200436、rs3796111、rs7419404、rs11675767、rs3761707、rs7558938、rs1143627、rs13005938、rs2278741、rs2677537、rs6431231、rs34242261、rs10191147、rs610624、rs10445686、rs1446586、rs2304366、rs11688302、rs10490735、rs10206850、rs13387241、rs16826652、rs34132424、rs2432955、rs12470533、rs2124971、rs11884495、rs9713、rs355897、rs1007722、rs777346、rs2241190、rs2229266、rs9631、rs4668246、rs58631773、rs746578、rs825660、rs4586658、rs1406122、rs3219153、rs736320、rs1057392、rs7586196、rs2539863、rs17552879、rs2229589、rs2287599、rs13002712、rs2229571、rs10169718、rs4674354、rs10933049、rs4641920、rs1882435、rs3811514、rs13029754、rs737027、rs2269352、rs6756597、rs4377288、rs12478298、rs7582275、rs57214830、rs3773380、rs163897、rs3749350、rs464392、rs4684782、rs73815733、rs3732666、rs842274、rs3815962、rs2686326、rs62234921、rs1393745、rs35258105、rs3821447、rs4789、rs9864910、rs6599266、rs2293312、rs3736573、rs7622622、rs2290133、rs9156、rs11129967、rs3204849、rs2037391、rs352166、rs2251219、rs17264436、rs3755806、rs4955865、rs7633179、rs6773315、rs1386829、rs6806444、rs6762914、rs1043045、rs2292677、rs40610、rs67920064、rs73124286、rs9816032、rs7626143、rs9861471、rs13324964、rs301949、rs6786354、rs7629487、rs571391、rs939443、rs13324427、rs1289754、rs1381837、rs2399373、rs4682130、rs12695307、rs2289271、rs56728675、rs3732401、rs12489170、rs8935、rs6809407、rs333289、rs2860440、rs2788462、rs13060596、rs72969707、rs3732534、rs6773789、rs12489348、rs4141499、rs13064196、rs2178384、rs2699880、rs2276737、rs3192149、rs1131598、rs10935090、rs13097893、rs9876490、rs1540506、rs3762799、rs7621642、rs9822605、rs62273364、rs9833875、rs1526786、rs12636725、rs954714、rs11708569、rs1132979、rs28690162、rs34533513、rs1048243、rs60512741、rs7625651、rs6792607、rs6773641、rs2431、rs16845891、rs71310518、rs9855544、rs7640306、rs9290650、rs13077058、rs1362650、rs13067678、rs2293031、rs9824、rs2272473、rs2228291、rs4686879、rs11555405、rs9868164、rs3821734、rs6789787、rs4677732、rs1061860、rs1814901、rs2280268、rs58948928、rs12495970、rs57723486、rs1048037、rs4235380、rs2245964、rs7690492、rs6823735、rs8192678、rs2946385、rs2855262、rs734644、rs10030708、rs3733359、rs6855349、rs11734944、rs11722735、rs344122、rs344140、rs4612、rs3733227、rs17010697、rs989902、rs236996、rs1914240、rs2870639、rs4602468、rs2306802、rs12642449、rs7690296、rs2162450、rs2289043、rs7697517、rs11726650、rs10516486、rs223390、rs17215211、rs2765、rs17037102、rs7689008、rs4698797、rs9995789、rs3775839、rs11098472、rs12498258、rs7658836、rs45574236、rs1567047、rs3749507、rs1058267、rs3796700、rs60653888、rs336312、rs1908968、rs10033601、rs6858157、rs6816526、rs1497949、rs13112390、rs7688467、rs6818170、rs6855305、rs3108229、rs367863、rs29680、rs17825532、rs7734564、rs16903264、rs11750538、rs1155443、rs2241337、rs1049524、rs178415、rs10039542、rs40211、rs7730048、rs829259、rs2278351、rs36303、rs10036291、rs2278600、rs636926、rs888789、rs961536、rs7702523、rs3828611、rs1052345、rs369998、rs2035990、rs11726、rs10069050、rs2247870、rs2636、rs2007、rs1230382、rs2617434、rs2303138、rs6876278、rs26821、rs8488、rs400570、rs1129496、rs2964701、rs3797339、rs9112、rs1047438、rs7715577、rs3533、rs248040、rs384556、rs248706、rs2015018、rs4996522、rs26006、rs40401、rs25882、rs162881、rs7404、rs4572、rs27988、rs1368298、rs592403、rs998754、rs61612167、rs3797716、rs2287727、rs827778、rs10155597、rs9043、rs11747030、rs2963670、rs17078347、rs2087210、rs365132、rs1700490、rs251848、rs28932178、rs1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2.一种用于人类三级亲缘关系分析鉴定的多重复合扩增引物组,其特征在于,所述引物组包括用于扩增权利要求1所述SNP分子标记组合中的全部SNP位点的PCR引物组;所述PCR引物组包括SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.1400序列所示引物。
3.一种用于人类三级亲缘关系分析鉴定的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含如权利要求2所述的PCR引物组。
4.一种用于人类三级亲缘关系分析鉴定的高通量检测方法,其特征在于,所述方法包括:
a.获取待检测样本的DNA;
b.构建片段化的DNA文库并纯化;
c.以纯化后的DNA文库为模板,利用权利要求2所述的引物组进行靶向富集;
d.以步骤c所得产物为模板,进行通用聚合酶PCR反应;
e.高通量测序;
f.测序数据分析;
g.计算似然率,鉴定亲缘关系。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述靶向富集在同一个PCR扩增反应体系中同时扩增。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述方法在靶向富集后通用聚合酶PCR反应前,以及通用聚合酶PCR反应后高通量测序前还分别包括纯化步骤。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述纯化步骤为磁珠纯化。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述步骤b包括DNA片段化、DNA片段末端修复、加A操作、添加接头和纯化连接接头的DNA。
9.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,在数据分析过程中,对测序数据进行质控,采用Agilent 2100生物分析仪和High Sensitivity DNA Chip进行质控。
10.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,高通量测序可采用高通量测序仪进行。
11.根据权利要求1所述的SNP分子标记组合、权利要求2所述的引物组或权利要求3所述的试剂盒在鉴定人类三级亲缘关系中的应用。
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