CN111748630A - 与肝癌生存率相关的snp位点、引物对、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物技术领域，提供了一种与肝癌生存率相关的SNP位点、引物对、试剂盒及应用，该SNP位点为7p21.2区域上的rs2237492位点，rs2237492位点碱基为A或T，其周围的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。另外，本发明实施例还提供一种用于检测上述SNP位点基因型的引物对，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2～3所示，该引物对可以对rs2237492位点进行基因分型，其方法简便、快速、结果准确、明了，从而可以为肝癌生存率鉴定以及预后提供一个新的途径。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种与肝癌生存率相关的SNP位点、引物对、试剂盒及应用。
背景技术
原发性肝癌(Primary Hepatic Cancer，PHC)是全球高发的癌症之一，我国是肝炎大国，肝癌发病人数占全球人口的一半以上，已经成为严重威胁我国人民身心健康的恶性肿瘤之一。目前认为，肝癌发生的可能分子基础是多个遗传性因素及其特定组合的累积效应、病毒、生活方式及饮食习惯相互作用的结果。
早期PHC手术患者依靠定量组织RNA水平和蛋白表达水平来预测预后和疗效，但大部分中、晚期PHC患者无法接受手术，无法预测预后和疗效。随着科技的发展，针对癌症诊治、预后和疗效的不断研究，少部分患者得到了一定的改善，但对未受益患者的生存率等预后情况仍存在争议。因此，亟待开展预测PHC预后的标记物。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种与肝癌生存率相关的SNP位点，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种与肝癌生存率相关的SNP位点，为7p21.2区域上的rs2237492位点，rs2237492位点碱基为A或T；另外，rs2237492位于基因MEOX2的3′UTR。
作为本发明实施例的一个优选方案，所述SNP位点周围的核苷酸序列(即7p21.2区域上的部分基因序列)如序列表SEQ ID NO:1所示，其中W碱基(即rs2237492位点碱基)为A或T。
本发明实施例的另一目的在于提供一种用于检测上述的SNP位点的引物对，其包括：
上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；以及
下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
本发明实施例的另一目的在于提供一种试剂盒，其包括PCR缓冲液以及上述的引物对。
作为本发明实施例的另一个优选方案，所述试剂盒用于检测所述SNP位点的基因型。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的SNP位点在制备用于判定肝癌患者生存率的试剂盒中的应用。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的引物对在制备用于判定肝癌患者生存率的试剂盒中的应用。
本发明实施例提供的一种与肝癌生存率相关的SNP位点，为7p21.2区域上的rs2237492位点，其可以用于判定肝癌患者生存率。具体的，本发明实施例通过设计一组特异性引物对，可以对rs2237492位点进行基因分型，其方法简便、快速、结果准确、明了，从而可以为肝癌生存率鉴定以及预后提供一个新的途径，将该方法应用于对肝癌辅助治疗评判，有利于预测疾病的发展。
附图说明
图1为试验例统计分析得到的生存曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种与肝癌生存率相关的SNP位点，其为7p21.2区域上的rs2237492位点，rs2237492位点碱基为A或T；另外，rs2237492位于基因MEOX2的3′UTR，其周围的核苷酸序列(即7p21.2区域上的部分基因序列)如序列表SEQ ID NO:1所示，具体为：
CAAAAGCAAATACCTGCCCACTGTAATACACATGATCTCACACATCTGGAATGTTCAATGCAAGTTCATCCTCGGCATCTTCACTCTGGAGACATCTTGAATAAAAAACCGTTCATAGTTTGCTCTTGATAGCAATTTAATTTTCAGTGCAAGCAAAAGCAAACACATACCTGCTCACTGCCATACGCACGACCAAACACATCTGGAATATTCAAAGCAAGTTCACCTTCTCCATCTTCACTGTGGAAGCTCTTTAATAAGTGGCACTTTGTGTAAACCCTCTATAAATCATGAAAAACAGATTCGAAATGCCTGGAWTTATAATATTAAACATCACTGCCATAGTCATCTCTCTGTGTAAACGATATTTGGGTAAGGCTTGCCATCACAACATTTCTTTCCTGAGAATGGAGCTGGTCCTCTGTTTATATCATAAGTGCGCATGCTCTGAGCTGTGGTCACTGTCGTGACTGTCTTCATTTGCTATAGAGTCCCCTGTTTGCTGGAGGGTGGCTGCACCAATTCCCGACAGCTCTGATGGGAGAAGTGTTCCCTTTTTC。
其中W碱基(即rs2237492位点碱基)为A或T。根据该rs2237492位点的基因型可以用于预测肝癌患者的生存率情况。
实施例2
该实施例提供一种用于检测上述rs2237492位点的引物对，其包括：
上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，具体为：CAGATTCGAAATGCCTGGAAT；以及
下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，具体为：ATATAAACAGAGGACCAGCTC。
另外，该实施例还提供了一种试剂盒，其包括PCR缓冲液以及上述的引物对。此外，该试剂盒还可包括DNA聚合酶(可采用市售HotStarTaq DNA聚合酶)、三蒸水、脱氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTP mix)、AseI限制性内切酶、NEB3缓冲液等试剂，但不限于此。
实施例3
该实施例提供了一种上述试剂盒的应用，具体的，通过提取受试者基因组DNA进行SNP位点rs2237492的基因分型，其包括以下步骤：
S1、基因组DNA的提取：抽取受试者外周静脉血2mL，利用现有技术中市售的全血DNA提取试剂盒提取外周静脉血中的基因组DNA，并置于-20℃保存，备用。
S2、SNP基因分型：根据SNP位点rs2237492序列信息，设计聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，并在生物工程有限公司进行引物对的合成，其中引物对的序列与实施例2提供的相同。合成后的引物与上述基因组DNA进行PCR反应，可得到PCR产物；接着，将PCR产物与限制性内切酶进行RFLP(限制性内切酶片段长度多态性，Restriction Fragment Length Poly morphism)反应，得到反应产物；然后，将反应物置于37℃孵育后，再置于聚丙酰胺凝胶或微芯片电泳系统(MCE-202MultiNA)中，根据被切断的条带大小来判断基因型。其中，引物对的GC比值、Tm值、PCR产物长度、不同基因型切断后条带长度如表1所示。
表1
另外，PCR反应体系如下：将2μL的10×PCR缓冲液，2μL的dNTP mix，1μL的上游引物，1μL的下游引物，0.3μL的HotStarTaq DNA聚合酶，1μL的基因组DNA进行混匀，并用三蒸水补足至20μL，即可得到PCR反应体系。其中，dNTP的终浓度为200μM，上游引物的终浓度为0.25μM，下游引物的终浓度为0.25μM，DNA聚合酶的终浓度为2.5units/20μL，基因组DNA的终浓度为1μg/20μL。
需要说明的是，上述实验所用的试剂、耗材和和限制性内切酶均为市售常见。
PCR反应的循环条件如表2所示：
表2
此外，RFLP反应体系如下：将1μL的10×NEB3缓冲液，0.3units的Ase I限制性内切酶，3μL上述得到的PCR产物进行混匀，并用三蒸水补足10μL，即可得到RFLP反应体系。
需要说明的是，上述实验所用的试剂、耗材和和限制性内切酶均为市售常见。
实施例4
该实施例提供了一种上述试剂盒的应用，具体的，通过提取受试者基因组DNA进行SNP位点rs2237492的基因分型，其包括以下步骤：
S1、基因组DNA的提取：抽取受试者外周静脉血2mL，利用现有技术中市售的全血DNA提取试剂盒提取外周静脉血中的基因组DNA，并置于-20℃保存，备用。
S2、SNP基因分型：根据SNP位点rs2237492序列信息，设计聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，并在生物工程有限公司进行引物对的合成，其中引物对的序列与实施例2提供的相同。合成后的引物与上述基因组DNA进行PCR反应，可得到PCR产物；接着，将PCR产物与限制性内切酶进行RFLP(限制性内切酶片段长度多态性，Restriction Fragment Length Poly morphism)反应，得到反应产物；然后，将反应物置于37℃孵育后，再置于聚丙酰胺凝胶或微芯片电泳系统(MCE-202MultiNA)中，根据被切断的条带大小来判断基因型。
其中，PCR反应体系如下：将2μL的10×PCR缓冲液，1μL的dNTP mix，0.4μL的上游引物，0.4μL的下游引物，0.24μL的HotStarTaq DNA聚合酶，0.5μL的基因组DNA进行混匀，并用三蒸水补足至20μL，即可得到PCR反应体系。其中，dNTP的终浓度为100μM，上游引物的终浓度为0.1μM，下游引物的终浓度为0.1μM，DNA聚合酶的终浓度为2units/20μL，基因组DNA的终浓度为0.5μg/20μL。
需要说明的是，上述实验所用的试剂、耗材和和限制性内切酶均为市售常见。PCR反应的循环条件与实施例3的相同。
此外，RFLP反应体系如下：将1μL的10×NEB3缓冲液，0.2units的Ase I限制性内切酶，2μL上述得到的PCR产物进行混匀，并用三蒸水补足10μL，即可得到RFLP反应体系。
需要说明的是，上述实验所用的试剂、耗材和和限制性内切酶均为市售常见。
实施例5
该实施例提供了一种上述试剂盒的应用，具体的，通过提取受试者基因组DNA进行SNP位点rs2237492的基因分型，其包括以下步骤：
S1、基因组DNA的提取：抽取受试者外周静脉血2mL，利用现有技术中市售的全血DNA提取试剂盒提取外周静脉血中的基因组DNA，并置于-20℃保存，备用。
S2、SNP基因分型：根据SNP位点rs2237492序列信息，设计聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，并在生物工程有限公司进行引物对的合成，其中引物对的序列与实施例2提供的相同。合成后的引物与上述基因组DNA进行PCR反应，可得到PCR产物；接着，将PCR产物与限制性内切酶进行RFLP(限制性内切酶片段长度多态性，Restriction Fragment Length Poly morphism)反应，得到反应产物；然后，将反应物置于37℃孵育后，再置于聚丙酰胺凝胶或微芯片电泳系统(MCE-202MultiNA)中，根据被切断的条带大小来判断基因型。
其中，PCR反应体系如下：将2μL的10×PCR缓冲液，3μL的dNTP mix，2μL的上游引物，2μL的下游引物，0.36μL的HotStarTaq DNA聚合酶，3μL的基因组DNA进行混匀，并用三蒸水补足至20μL，即可得到PCR反应体系。其中，dNTP的终浓度为300μM，上游引物的终浓度为0.5μM，下游引物的终浓度为0.5μM，DNA聚合酶的终浓度为3units/20μL，基因组DNA的终浓度为3μg/20μL。
需要说明的是，上述实验所用的试剂、耗材和和限制性内切酶均为市售常见。
此外，RFLP反应体系如下：将1μL的10×NEB3缓冲液，0.4units的Ase I限制性内切酶，4μL上述得到的PCR产物进行混匀，并用三蒸水补足10μL，即可得到RFLP反应体系。
需要说明的是，上述实验所用的试剂、耗材和和限制性内切酶均为市售常见。
试验例：
选取637名肝癌患者，分别按照上述实施例3提供的方法进行SNP位点rs2237492基因型鉴定，其中每种基因型的患者人数以及死亡率如表3所示，其生存曲线图如附图1所示。
表3
其中，Log-rank p的值是基于Kaplan-Meier分析法。
从表3可以看出，rs2237492的TT基因型与TA+AA基因型比较生存比值HR＝2.070，95％CI＝1.597-2.684，其表面rs2237492基因型为TT的个体为肝癌生存率较低的人群。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 延边大学
<120> 与肝癌生存率相关的SNP位点、引物对、试剂盒及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 560
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaaagcaaa tacctgccca ctgtaataca catgatctca cacatctgga atgttcaatg 60
caagttcatc ctcggcatct tcactctgga gacatcttga ataaaaaacc gttcatagtt 120
tgctcttgat agcaatttaa ttttcagtgc aagcaaaagc aaacacatac ctgctcactg 180
ccatacgcac gaccaaacac atctggaata ttcaaagcaa gttcaccttc tccatcttca 240
ctgtggaagc tctttaataa gtggcacttt gtgtaaaccc tctataaatc atgaaaaaca 300
gattcgaaat gcctggawtt ataatattaa acatcactgc catagtcatc tctctgtgta 360
aacgatattt gggtaaggct tgccatcaca acatttcttt cctgagaatg gagctggtcc 420
tctgtttata tcataagtgc gcatgctctg agctgtggtc actgtcgtga ctgtcttcat 480
ttgctataga gtcccctgtt tgctggaggg tggctgcacc aattcccgac agctctgatg 540
ggagaagtgt tccctttttc 560
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagattcgaa atgcctggaa t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atataaacag aggaccagct c 21
Claims (7)
1.一种与肝癌生存率相关的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点为7p21.2区域上的rs2237492位点，rs2237492位点碱基为A或T。
2.根据权利要求1所述的一种与肝癌生存率相关的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点周围的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其中W碱基为A或T。
3.一种用于检测如权利要求1或2所述的SNP位点的引物对，其特征在于，包括：
上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；以及
下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。
4.一种试剂盒，包括PCR缓冲液，其特征在于，还包括如权利要求3所述引物对。
5.根据权利要求4所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测所述SNP位点的基因型。
6.一种如权利要求1或2所述的SNP位点在制备用于判定肝癌患者生存率的试剂盒中的应用。
7.一种如权利要求3所述的引物对在制备用于判定肝癌患者生存率的试剂盒中的应用。
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| CN202010773666.6A CN111748630A (zh) | 2020-08-04 | 2020-08-04 | 与肝癌生存率相关的snp位点、引物对、试剂盒及应用 |
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| CN202010773666.6A CN111748630A (zh) | 2020-08-04 | 2020-08-04 | 与肝癌生存率相关的snp位点、引物对、试剂盒及应用 |
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-
2020
- 2020-08-04 CN CN202010773666.6A patent/CN111748630A/zh active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ANONYMOUS: "rs2237492", 《GENBANK》 * |
| 冯涛等: "MEOX2基因与先天性小耳畸形相关性研究", 《中华耳科学杂志》 * |
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