CN111718971B - 一种具有降脂活性的米糠多糖及其制备方法 - Google Patents

一种具有降脂活性的米糠多糖及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111718971B
CN111718971B CN202010602634.XA CN202010602634A CN111718971B CN 111718971 B CN111718971 B CN 111718971B CN 202010602634 A CN202010602634 A CN 202010602634A CN 111718971 B CN111718971 B CN 111718971B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rice bran
grifola frondosa
polysaccharide
minutes
bran polysaccharide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010602634.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN111718971A (zh
Inventor
刘倩
魏涛
范誉川
刘素诗
赵洁羽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Union University
Original Assignee
Beijing Union University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Union University filed Critical Beijing Union University
Priority to CN202010602634.XA priority Critical patent/CN111718971B/zh
Publication of CN111718971A publication Critical patent/CN111718971A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111718971B publication Critical patent/CN111718971B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种具有降脂活性的米糠多糖及其制备方法，该方法利用米糠粕液体培养基发酵培养灰树花L1菌株，然后抽滤、洗涤、收集灰树花菌体，冷冻干燥粉碎，通过缓冲液洗涤的方法去除菌体上可溶性的蛋白、多糖等物质，然后以菌体为固定化酶，与米糠多糖在一定条件下进行反应，反应结束后离心去除菌体，上清进行乙醇沉淀即得。该方法制备的米糠多糖能够显著减少秀丽隐杆线虫在高糖饮食下的脂肪积累，具有良好的降脂活性。

Description

一种具有降脂活性的米糠多糖及其制备方法
技术领域
本发明属于生物领域，涉及一种具有降脂活性的米糠多糖及其制备方法。
背景技术
米糠是稻谷加工的主要副产物，约占稻谷的6～8％，却含有稻谷64％的营养物质及90％以上的人体必需元素。米糠含有15％～22％脂类，34.1％～52.3％碳水化合物，10％～16％蛋白质，7％～11.4％粗纤维，6.6％～9.9％灰分以及8％～12％水分，此外还富含维生素E、谷维素等成分。米糠粕是米糠榨油后的产物，与米糠相比脂肪含量降低，而其他营养成分、功能成分保留较好，性质更加稳定。
米糠多糖位于水稻颖果皮层的细胞壁中，经常结合于果胶、纤维素、蛋白质等多种物质上，故米糠多糖的提取关键在于如何从细胞壁中释放多糖。当前提取米糠多糖的方式有热水浸提法、酸碱提取法、超声波法、酶解法、微波法和高压脉冲法。米糠多糖是米糠粕中一类重要的活性成分，研究表明其在抗炎、抗肿瘤、提高免疫力、降血糖、抗菌、抗辐射等方面具有良好效果。同时研究也发现，米糠多糖的活性与其结构、分子量等有紧密关系，不同结构的米糠多糖所表现出的活性差别较大。
从米糠中提取得到的一些天然多糖存在分子量大、粘度高、活性部位未完全暴露等问题，很难穿过多重生物膜，影响吸收，从而影响其在生物体内的免疫调节、抗肿瘤等生物活性。为提高米糠多糖的生物利用度，常通过一些手段对其进行适当的结构修饰。多糖修饰改性主要是通过修饰主链和侧链来完成的，通过增加官能团以提高其生物活性，或将多糖降解成寡糖片段以提高其溶解性这两种途径来实现的。
采用灰树花酶法降解米糠多糖，现有的文献报道的方法有两类，一种是共发酵，即灰树花和米糠多糖或米糠粕水提液一起发酵培养，然后离心后上清醇沉多糖，但是灰树花本身作为大型真菌，在发酵过程中也会产生大量的多糖分泌到发酵液中，所以最后醇沉的多糖混有大量的灰树花多糖，无法针对米糠多糖的活性进行准确评价。另一种方法是把灰树花的胞外酶或胞内酶进行硫铵沉淀，然后再与米糠多糖反应，这个方法一定程度上减少了产物中的灰树花多糖，但是还需要硫铵沉淀、脱盐等处理步骤，比较复杂。
在以往的研究报道中关于米糠多糖的活性研究主要集中在抗炎、抗肿瘤和提高免疫力等方面，对于其降脂活性和对米糠多糖进行改造提高其降脂活性的研究较少。因此，研究米糠多糖的降脂活性，寻找一种快速有效的米糠多糖修饰方法和简便高效的应用技术，对于提高米糠的利用率，推广米糠多糖的使用具有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种具有降脂活性的米糠多糖的制备方法，该方法以灰树花菌体为固定化酶，利用菌体上的酶酶法改造原始米糠多糖，使其具有了降脂活性。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备的米糠多糖。
为了实现上述目的，本发明提供一种具有降脂活性的米糠多糖的制备方法，包括如下步骤：
1)制备米糠粕液体培养基：将米糠粕与水按照料液比g/mL为1:10～1:15混合，在微波频率为400W条件下，辐射5～10分钟；然后，100℃条件下煮沸提取20分钟；按照米糠粕质量，加入800U/g的α-淀粉酶和1000U/g的α-1,4-葡萄糖苷酶，65℃处理2小时，5000转/分离心5分钟，115℃灭菌30分钟备用；
2)制备灰树花菌体冻干粉：将灰树花L1菌体在马铃薯液体培养基上进行培养活化，28℃、180转/分培养2～3天；然后将活化的灰树花L1菌体接种至米糠粕液体培养基中，28℃培养7～9天；培养结束后抽滤收集菌体，大量蒸馏水洗涤菌体3～5次，抽滤冻干，研磨成粉末，制成灰树花冻干粉，备用；
3)制备原始米糠多糖：将米糠粕与水按照料液比g/mL为1:10～1:15混合，在微波频率为400W条件下，辐射5～10分钟，然后，100℃条件下煮沸提取20分钟，降温至65℃；按照米糠粕质量，加入800U/g的α-淀粉酶和1000U/g的α-1,4-葡萄糖苷酶，65℃处理2小时，100℃条件下煮沸10分钟，冷却至室温，按照米糠粕质量，再加入1000U/g的木瓜蛋白酶，55℃处理2小时，100℃条件下煮沸10分钟终止反应，然后5000转/分离心5分钟，取上清，加入4倍体积冷乙醇，4℃沉淀1小时，12000转/分离心3分钟去除上清，沉淀烘干得到原始米糠多糖；
4)将步骤2)制备的灰树花菌体冻干粉进行洗涤，将步骤3)制备的原始米糠多糖配成浓度为25～50mg/mL的水溶液，然后与洗涤后的灰树花冻干粉混合，反应，100℃煮沸10分钟终止反应，12000转/分离心5分钟，吸取上清，0.2～0.45微米孔径滤膜过滤，滤液备用；
冻干粉洗涤可去除可溶的蛋白、多糖等物质，减少后续反应的杂质。
5)向滤液中加入4倍体积冷乙醇，4℃沉淀1小时，12000转/分离心3分钟去除上清，沉淀烘干，得到具有降脂活性的米糠多糖；
其中，所述灰树花L1菌体分类命名为：灰树花(Grifola frondosa)L1；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2020年6月1日，保藏编号为：CGMCCNo.19649。
优选地，所述活化的灰树花L1菌体接种至米糠粕液体培养基中的接种体积百分比为3～5％。
优选地，所述灰树花菌体冻干粉与米糠多糖的质量比为1:5～1:1。
优选地，所述灰树花菌体冻干粉与米糠多糖的反应温度为30～50℃，反应时间为1～4小时。
优选地，步骤4)所述洗涤的方法为：采用pH6.0、20mM的醋酸钠缓冲液洗涤2～3次。
本发明还提供一种采用上述的制备方法制备的米糠多糖。
灰树花(Grifola frondosa)，又名贝叶多孔菌、栗子蘑、莲花菌、叶状奇果菌、千佛菌、云蕈、舞茸，属真菌门、担子菌亚门、层菌纲、同担子菌亚纲、非褶菌目、多孔菌科、灰树花属。灰树花子实体肉质，短柄，呈珊瑚状分枝，末端生扇形至匙形菌盖，重叠成丛，大的丛宽40～60厘米，重3～4公斤；菌盖直径2～7厘米，灰色至浅褐色。表面有细毛，老后光滑，有反射性条纹，边缘薄，内卷。菌肉白，厚2～7毫米。灰树花菌丝在20～30℃范围内均能生长。
本发明使用灰树花菌体，经过培养后，灰树花菌体合成糖苷酶，而糖苷酶可与多糖反应使得多糖的糖苷键发生水解。米糠多糖属于结构复杂的杂多糖，而杂多糖水解需要多种糖苷酶共同作用，糖苷酶水解后多糖的分子量发生改变，分子量变小，并且通过水解可能使一些活性基团暴露出来，从而增强了其功效。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种具有降脂活性的米糠多糖及其制备方法，该米糠多糖通过以灰树花菌体为固定化酶，无需额外的固定化处理，反应后可通过一步离心去除，并且反应前利用缓冲液洗涤菌体去除可溶的蛋白、多糖等物质，减少杂质引入，简便高效，对于提高米糠利用率、挖掘米糠多糖的应用价值具有重要意义，通过饲喂秀丽隐杆线虫高脂模型，可以看出，本发明提供的米糠多糖能够显著降低高脂线虫体内的脂肪增加率。
附图说明
图1本发明所提供的方法在实施例1中制备的米糠多糖在不同饲喂条件下秀丽隐杆线虫油红染色图。
图2本发明所提供的方法在实施例2中制备的米糠多糖在不同饲喂条件下秀丽隐杆线虫油红染色图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明所述灰树花L1菌体分类命名为：灰树花(Grifola frondosa)L1；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2020年6月1日，保藏编号为：CGMCCNo.19649。
材料与方法：
1.米糠粕购买自郑州四维粮油工程技术有限公司。
2.α-淀粉酶(40000U/g)购买自北京索莱宝科技有限公司。
3.α-1,4-葡萄糖苷酶(100000U/g)购买自北京索莱宝科技有限公司。
4.木瓜蛋白酶(100000U/g)购买自北京索莱宝科技有限公司。
5.马铃薯液体培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，自然pH。
6.野生型秀丽隐杆线虫N2：购于美国线虫种质中心(Caenorhabditis GeneticsCenter)
7.NGM平板：蛋白胨2.5g，氯化钠3g，琼脂20g，蒸馏水975mL，灭菌后加入过滤除菌的1mol/L硫酸镁1mL、1mol/L氯化钙1mL、1mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)25mL和5mg/mL胆固醇溶液1mL。
实施例1
(1)灰树花菌体对米糠多糖的改造
制备米糠粕液体培养基：取50g米糠粕，加入500mL蒸馏水混匀，在微波频率为400W条件下，辐射5分钟，然后，100℃条件下煮沸提取20分钟，加入1gα-淀粉酶(40000U/g)和0.5g(100000U/g)的α-1,4-葡萄糖苷酶，65℃处理2小时，5000转/分离心5分钟，取上清，115℃灭菌30分钟备用。
灰树花L1菌株在马铃薯液体培养基上培养，28℃、180转/分培养3天，然后按照5％(v/v)的接种量，接种至上述米糠粕液体培养基中，28℃培养7天，培养结束后抽滤收集菌体，大量蒸馏水洗涤菌体3次，抽滤冻干，研磨成粉末备用。
制备原始米糠多糖：取50g米糠粕，加入500mL蒸馏水混匀，在微波频率为400W条件下，辐射5分钟，然后，100℃条件下煮沸提取20分钟，降温至65℃；加入1gα-淀粉酶(40000U/g)和0.5g(100000U/g)的α-1,4-葡萄糖苷酶，65℃处理2小时，100℃条件下煮沸10分钟，冷却至室温，再加入0.5g(100000U/g)的木瓜蛋白酶55℃处理2小时，100℃条件下煮沸10分钟终止反应，然后5000转/分离心5分钟，加入4倍体积冷乙醇，4℃沉淀1小时，12000转/分离心3分钟去除上清，沉淀烘干，获得原始米糠多糖。
称取10mg灰树花冻干菌体，加入1mL的醋酸钠缓冲液(pH6.0、20mM)洗涤，12000转/分离心3分钟，弃上清，重复三次。取制备的原始米糠多糖配置成浓度为50mg/mL的米糠多糖水溶液，然后取1mL与洗涤后的菌体混合，40℃反应4小时。反应结束后100℃煮沸10分钟终止反应，12000转/分离心5分钟，吸取上清，0.2～0.45微米孔径滤膜过滤，滤液备用。
向滤液中加入4倍体积冷乙醇，4℃沉淀1小时，12000转/分离心3分钟去除上清，沉淀烘干，获得改造米糠多糖。
(2)制备的米糠多糖的分子量和降脂作用
利用高压液相色谱分析制备的米糠多糖的分子量。分别准确称取不同分子量标准葡聚糖一定质量，定容成1mg/mL的标准溶液，准确称取提取的原始米糠多糖和改造后的米糠多糖溶解，配成1mg/mL的样品溶液。使用WatersUltrahydrogel 1000和250凝胶排阻色谱柱串联使用，0.1mol/L的硝酸钠水溶液为流动相，流速0.8mL/min，柱温35℃，进样体积20μL，运行时间30min，示差折光检测器检测。利用已知分子量的标准品制作分子量与保留时间的标准曲线，从而计算出检测样品中的分子量分布。结果如表1所示，提取的原始米糠多糖主要包括3个分子量组分，分别为1.1×105Da、5.0×103Da和2.5×103Da，而经过改造后，米糠多糖中大分子量的组分被灰树花产生的酶水解，主要组成为分子量较小的两个组分。合适的分子量利于提高吸收利用，便于发挥作用。
表1.改造前后米糠多糖分子量分布
Figure BDA0002559598080000051
利用秀丽隐杆线虫高脂模型分析降脂活性。在NGM平板上培养野生型秀丽隐杆线虫N2至成虫期，M9缓冲液收集虫体，利用裂解液(每50mL含有0.14g氢氧化钾和6mL浓度为12％的次氯酸钠溶液)对虫体进行破碎，收集虫卵，M9缓冲液洗涤后于20℃孵育16小时，获得同期化线虫。将线虫分为4组，每组3个平行。一组正常对照组，为普通NGM培养基，野生型秀丽隐杆线虫饲喂大肠杆菌OP50；一组高脂对照组，为含有10mM葡萄糖的NGM培养基，野生型秀丽隐杆线虫饲喂大肠杆菌OP50；一组原始米糠多糖组，为含有10mM葡萄糖的NGM培养基，并添加20mg原始米糠多糖，野生型秀丽隐杆线虫饲喂大肠杆菌OP50；一组为改造米糠多糖组，为含有10mM葡萄糖的NGM培养基，并添加20mg改造米糠多糖，野生型秀丽隐杆线虫饲喂大肠杆菌OP50。
野生型秀丽隐杆线虫以大肠杆菌为食，在吞咽过程中会摄入一些环境中的培养基成分，并且其还可以通过体表吸收培养基成分，从而将米糠多糖成分摄入到体内。
每个平板接种2000条同期化线虫，20℃培养45小时至L4期，M9缓冲液收集线虫，多聚甲醛固定后油红染色，显微镜观察，相同参数下拍摄图片，结果如图1所示，其中，a为正常对照组秀丽隐杆线虫；b为高脂对照组秀丽隐杆线虫；c为高脂线虫饲喂原始米糠多糖；d为高脂线虫饲喂本实施例制备的改造米糠多糖；然后，利用imageJ对染色结果进行定量分析。
Figure BDA0002559598080000061
结果表明，高脂对照组线虫与对照组相比，体内脂肪堆积增加，脂肪增加率为14.8％，说明培养基中添加葡萄糖能够显著增加线虫脂肪积累，可建立线虫高脂模型。在培养基中添加原始米糠多糖，对线虫脂肪堆积程度无显著影响。而在培养基中添加改造后的米糠多糖，能显著降低高脂线虫中的脂肪含量，与正常对照组相比脂肪增加率为4.5％，与高脂对照组相比，脂肪增加率减少69.7％。可见，改造后的米糠多糖能够抑制脂肪堆积，具有良好的降脂活性。
实施例2
(1)灰树花胞内酶对米糠多糖的改造
制备米糠粕液体培养基：取50g米糠粕，加入500mL蒸馏水混匀，在微波频率为400W条件下，辐射5分钟，然后，100℃条件下煮沸提取20分钟，加入1gα-淀粉酶(40000U/g)和0.5g(100000U/g)的α-1,4-葡萄糖苷酶，65℃处理2小时，5000转/分离心5分钟，取上清115℃灭菌30分钟备用。
灰树花L1菌株在马铃薯液体培养基上培养，28℃、180转/分培养3天，然后按照3％(v/v)的接种量，接种至上述米糠粕液体培养基中，28℃培养9天，培养结束后抽滤收集菌体，大量蒸馏水洗涤菌体3次，抽滤冻干，研磨成粉末备用。
制备原始米糠多糖：取50g米糠粕，加入500mL蒸馏水混匀，在微波频率为400W条件下，辐射5分钟，然后，100℃条件下煮沸提取20分钟，降温至65℃；加入1gα-淀粉酶(40000U/g)和0.5g(100000U/g)的α-1,4-葡萄糖苷酶，65℃处理2小时，100℃条件下煮沸10分钟，冷却至室温，再加入0.5g(100000U/g)的木瓜蛋白酶55℃处理2小时，100℃条件下煮沸10分钟终止反应，然后5000转/分离心5分钟，加入4倍体积冷乙醇，4℃沉淀1小时，12000转/分离心3分钟去除上清，沉淀烘干，获得原始米糠多糖。
称取25mg灰树花冻干菌粉，加入1mL的醋酸钠缓冲液(pH6.0、20mM)洗涤，12000转/分离心3分钟，弃上清，重复三次。取制备的原始米糠多糖配置成浓度为50mg/mL的米糠多糖水溶液，然后取1mL与洗涤后的菌体混合，40℃反应1小时。反应结束后100℃煮沸10分钟终止反应，12000转/分离心5分钟，吸取上清，0.2～0.45微米孔径滤膜过滤，滤液备用。
向滤液中加入4倍体积冷乙醇，4℃沉淀1小时，12000转/分离心3分钟去除上清，沉淀烘干，获得改造米糠多糖。
(2)制备的米糠多糖的分子量和降脂作用
利用高压液相色谱分析制备的米糠多糖的分子量。分别准确称取不同分子量标准葡聚糖一定质量，定容成1mg/mL的标准溶液，准确称取提取的原始米糠多糖和改造后的米糠多糖溶解，配成1mg/mL的样品溶液。使用WatersUltrahydrogel 1000和250凝胶排阻色谱柱串联使用，0.1mol/L的硝酸钠水溶液为流动相，流速0.8mL/min，柱温35℃，进样体积20μL，运行时间30min，示差折光检测器检测。利用已知分子量的标准品制作分子量与保留时间的标准曲线，从而计算出检测样品中的分子量分布。结果如表2所示，提取的原始米糠多糖主要包括3个分子量组分，分别为1.1×105Da、5.0×103Da和2.5×103Da，而经过改造后，米糠多糖中大分子量的组分被灰树花产生的酶水解，主要组成为分子量较小的两个组分。合适的分子量利用提高吸收利用，便于发挥作用。
表2.改造前后米糠多糖分子量分布
Figure BDA0002559598080000071
Figure BDA0002559598080000081
利用秀丽隐杆线虫高脂模型分析降脂活性。在NGM平板上培养野生型秀丽隐杆线虫N2至成虫期，M9缓冲液收集虫体，利用裂解液(每50mL含有0.14g氢氧化钾和6mL浓度为12％的次氯酸钠溶液)对虫体进行破碎，收集虫卵，M9缓冲液洗涤后于20℃孵育16小时，获得同期化线虫。将线虫分为4组，每组3个平行。一组正常对照组，为普通NGM培养基，野生型秀丽隐杆线虫饲喂大肠杆菌OP50；一组高脂对照组，为含有10mM葡萄糖的NGM培养基，野生型秀丽隐杆线虫饲喂大肠杆菌OP50；一组原始米糠多糖组，为含有10mM葡萄糖的NGM培养基，并添加20mg原始米糠多糖，野生型秀丽隐杆线虫饲喂大肠杆菌OP50；一组为改造米糠多糖组，为含有10mM葡萄糖的NGM培养基，并添加20mg改造米糠多糖，野生型秀丽隐杆线虫饲喂大肠杆菌OP50。
每个平板接种2000条同期化线虫，20℃培养45小时至L4期，M9缓冲液收集线虫，多聚甲醛固定后油红染色，显微镜观察，相同参数下拍摄图片，结果如图2所示，其中，a为正常对照组秀丽隐杆线虫；b为高脂对照组秀丽隐杆线虫；c为高脂线虫饲喂原始米糠多糖；d为高脂线虫饲喂本实施例制备的改造米糠多糖；然后，利用imageJ对染色结果进行定量分析。
Figure BDA0002559598080000082
结果表明，高脂对照组线虫与对照组相比，体内脂肪堆积增加，脂肪增加率为14.8％，说明培养基中添加葡萄糖能够显著增加线虫脂肪积累，可建立线虫高脂模型。在培养基中添加原始米糠多糖，对线虫脂肪堆积程度无显著影响。而在培养基中添加改造后的米糠多糖，能显著降低高脂线虫中的脂肪含量，与正常对照组相比脂肪增加率为4.2％，与高脂对照组相比，脂肪增加率减少71.9％。可见，改造后的米糠多糖能够抑制脂肪堆积，具有良好的降脂活性。
从上述实施例可以看出，本发明提供的具有降脂活性的米糠多糖的制备方法，直接利用灰树花菌体碎片进行反应，灰树花菌体碎片具有良好的糖苷酶活性，且糖苷酶与菌体结合较为紧密，不容易流失，反应完后通过一步离心就可以简单除去，简化了操作流程，节省了经济成本和时间成本。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (2)

1.一种具有降脂活性的米糠多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备米糠粕液体培养基：将米糠粕与水按照料液比g/mL为1:10混合，在微波频率为400W条件下，辐射5分钟；然后，100℃条件下煮沸提取20分钟，降温至65℃；按照米糠粕质量，加入800U/g的α-淀粉酶和1000U/g的α-1,4-葡萄糖苷酶，65℃处理2小时，5000转/分离心5分钟，取上清，115℃灭菌30分钟备用；
2）制备灰树花菌体冻干粉：将灰树花L1菌体在马铃薯液体培养基上进行培养活化，28℃、180转/分培养2~3天；然后将活化的灰树花L1菌体接种至米糠粕液体培养基中，28℃培养7~9天；培养结束后抽滤收集菌体，大量蒸馏水洗涤菌体3~5次，抽滤冻干，研磨成粉末，制成灰树花菌体冻干粉，备用；
3）制备原始米糠多糖：将米糠粕与水按照料液比g/mL为1:10混合，在微波频率为400W条件下，辐射5分钟，然后，100℃条件下煮沸提取20分钟，降温至65℃；按照米糠粕质量，加入800U/g的α-淀粉酶和1000U/g的α-1,4-葡萄糖苷酶，65℃处理2小时，100℃条件下煮沸10分钟，冷却至室温；按照米糠粕质量，再加入1000U/g的木瓜蛋白酶，55℃处理2小时，100℃条件下煮沸10分钟终止反应，然后5000转/分离心5分钟，取上清，加入4倍体积冷乙醇，4℃沉淀1小时，12000转/分离心3分钟去除上清，沉淀烘干得到原始米糠多糖；
4）将步骤2）制备的灰树花菌体冻干粉进行洗涤，将步骤3）制备的原始米糠多糖配成浓度为25~50mg/mL的水溶液，然后与洗涤后的灰树花冻干粉混合，反应，100℃煮沸10分钟终止反应，12000转/分离心5分钟，吸取上清，0.2~0.45微米孔径滤膜过滤，滤液备用；
5）向滤液中加入4倍体积冷乙醇，4℃沉淀1小时，12000转/分离心3分钟去除上清，沉淀烘干，得到具有降脂活性的米糠多糖；
其中，所述灰树花L1菌体为：灰树花（Grifola frondosa）L1；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2020年6月1日，保藏编号为：CGMCC No. 19649；
步骤2）所述活化的灰树花L1菌体接种至米糠粕液体培养基中的接种体积百分比为3~5%；
步骤4）所述灰树花菌体冻干粉与原始米糠多糖的质量比为1:5~1:1；
步骤4）所述灰树花菌体冻干粉与米糠多糖的反应温度为40℃，反应时间为1~4小时；
步骤4）所述洗涤的方法为：采用pH6.0、20mM的醋酸钠缓冲液洗涤2~3次。
2.一种采用权利要求1所述的制备方法制备的米糠多糖。
CN202010602634.XA 2020-06-29 2020-06-29 一种具有降脂活性的米糠多糖及其制备方法 Active CN111718971B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010602634.XA CN111718971B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 一种具有降脂活性的米糠多糖及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010602634.XA CN111718971B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 一种具有降脂活性的米糠多糖及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111718971A CN111718971A (zh) 2020-09-29
CN111718971B true CN111718971B (zh) 2023-02-17

Family

ID=72569435

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010602634.XA Active CN111718971B (zh) 2020-06-29 2020-06-29 一种具有降脂活性的米糠多糖及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111718971B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103290081A (zh) * 2012-02-27 2013-09-11 潘千水 一种米糠活性多糖的提取方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103290081A (zh) * 2012-02-27 2013-09-11 潘千水 一种米糠活性多糖的提取方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Rice bran polysaccharides and oligosaccharides modified by Grifola frondosa fermentation Antioxidant activities and effects on the production of NO";Qian Liu, et al;《Food Chem》;20170515;摘要，材料和方法部分 *
"发酵米糠多糖的制取及其生物活性研究";曹秀娟;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)工程科技Ⅰ辑》;20151215;摘要，第三、四章 *
"灰树花对米糠多糖的酶法改性及活性研究";刘诗瑶;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)基础科学辑》;20180715;摘要，第1.3节，第2.2节，第5节 *
"米糠多糖提取工艺中脱蛋白方法的研究";赵凤敏 等;《农产品加工（学刊）》;20110925;第1.2.4节，第3节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111718971A (zh) 2020-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100290044B1 (ko) 신규 다당체물질 및 그 제조 방법
CN101643759B (zh) 一种制备裂褶菌多糖的方法及专用培养基
Sun et al. High-efficiency production of Tremella aurantialba polysaccharide through basidiospore fermentation
CN111978421B (zh) 一种桑树桑黄多糖及其制备和用途
US11999984B2 (en) Method and special complex enzyme for hydrolyzing galactomannan (GM) to prepare small-molecule GM and galactomannan oligosaccharide (GMOS)
CN109527602B (zh) 提高青稞若叶粉中可溶性膳食纤维含量的方法
Wang et al. Antioxidant and antibacterial activities of a polysaccharide produced by Chaetomium globosum CGMCC 6882
CN113912750B (zh) 一种发酵预处理提取灵芝子实体多糖的方法
KR100344755B1 (ko) 면역력증강물질및그제조방법
CN110923281A (zh) 一种食用菌多糖提取方法、食用菌多糖、食用菌饮料
CN111718971B (zh) 一种具有降脂活性的米糠多糖及其制备方法
CN110922499B (zh) 一种富硒化绣球菌多糖及其制备方法和应用
Hamza et al. Efficient production of biomass and exopolysaccharide from P. ostreatus and physio-chemical characterization of biomass powder
Selvasekaran et al. Fungal Exopolysaccharides: production and biotechnological industrial applications in food and allied sectors
Long et al. Production, characterization, and bioactivities of exopolysaccharides from the submerged culture of Ganoderma cantharelloideum MH Liu
KR100491362B1 (ko) 면역 활성 증진 복합 다당체의 제조 방법
KR20040096000A (ko) 초음파에 의한 세포벽 파쇄 및 효소발효법을 이용한상황버섯 베타글루칸 추출방법
CN113999325B (zh) 一种米糠发酵多糖，制备及应用
CN112961883B (zh) 一种耐热型白芸豆淀粉酶抑制剂及制备方法
CN112021563B (zh) 一种富含游离去氢表雄酮的甘薯全粉的制备方法
CN112370487A (zh) 一种树莓及灰树花发酵产品及其发酵方法
CN111139277A (zh) 粗多糖及其制备工艺、保健口服液及其制备方法
CN115260324B (zh) 一种具有肠道益生活性的佛手多糖的制备方法
CN114874356B (zh) 一种以小麦麸皮为原料提取阿拉伯木聚糖的方法、阿拉伯木聚糖和应用
CN109601846B (zh) 一种脱脂米糠中的膳食纤维的改性方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant