CN111714497A - 安替比林衍生物在制备抑制白色念珠菌的制品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种安替比林衍生物在制备抑制白色念珠菌的制品中的应用。本发明具体公开了安替比林类衍生物或包含安替比林类衍生物的组合物在制备抑制白色念珠菌的药物、功能性食品、化妆品或清洁用品中的应用，所述安替比林类衍生物如式(I)所示：
Figure DDA0002004153130000011
其中，R1、R2各自独立的选自氢、卤素、C1～5的直链或支链的烷基。该安替比林衍生物具有较的细胞毒活性，并能在较低剂量时抑制白色念珠菌菌丝的形成、和/或抑制白色念珠菌在细胞表面的侵袭以及和/或抑制白色念珠菌被膜形成，从而阻断白色念珠菌对宿主的侵袭，并且该类化合物在小鼠口腔耐药真菌感染模型和小鼠系统性真菌感染模型中均表现出了良好的治疗效果，且不易产生耐药。

Description

安替比林衍生物在制备抑制白色念珠菌的制品中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及安替比林衍生物在制备抑制白色念珠菌的制品中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
白色念珠菌是一种常见的人体致病真菌，在人体免疫力低下时，可造成不同程度的黏膜或系统性感染。随着骨髓和实体器官移植、抗肿瘤药物和免疫抑制剂的应用、广谱抗生素的使用、插管等侵袭性治疗的开展、HIV感染，使得易感人群增多，造成临床真菌发病率越来越高。白色念珠菌依环境不同能够以酵母态和菌丝态两种形态生长，其中酵母态转换为菌丝态生长是白色念珠菌发挥致病的重要因素。菌丝态真菌更易侵袭上皮细胞，逃逸免疫系统的清除，并能形成复杂的被膜结构，难以被抗真菌药物清除，为临床治疗带来很大难度。因而白色念珠菌菌丝形成是重要的毒力因子，被认为是未来抗真菌药物开发的重要靶点。发明人发现，目前现有抗真菌药物的靶点大多集中于细胞生长分裂中的一些必要过程，长期使用这些药物使得真菌耐药现象愈加普遍，因而亟需开发新型抗真菌药物。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一类安替比林类衍生物(如式(I)所示)，其具有较低的细胞毒活性，并能在较低剂量(该剂量远低于其对人正常细胞产生细胞毒作用的浓度)时抑制白色念珠菌菌丝的形成、和/或抑制白色念珠菌在细胞表面的侵袭以及和/或抑制白色念珠菌被膜形成，从而阻断白色念珠菌对宿主的侵袭，并且该类化合物在小鼠口腔耐药真菌感染模型和小鼠系统性真菌感染模型中均表现出了良好的治疗效果，且不易产生耐药。
本发明所述安替比林衍生物具有式(I)所示结构：
Figure BDA0002004153110000021
其中，R1、R2各自独立的选自氢、卤素、C1～5的直链或支链的烷基。
因此，本发明的第一目的在于提供上述安替比林类衍生物或包含上述安替比林类衍生物的组合物在制备抑制白色念珠菌的药物、功能性食品、化妆品或清洁用品中的应用。
本发明的第二目的在于提供上述安替比林类衍生物或包含上述安替比林类衍生物的组合物在制备抑制白色念珠菌菌丝态形成的药物、功能性食品、化妆品或清洁用品中的应用。
本发明的第三目的在于提供上述安替比林类衍生物或包含上述安替比林类衍生物的组合物在制备抑制白色念珠菌在细胞表面黏附的药物、功能性食品、化妆品或清洁用品中的应用。
以及，本发明的第四目的在于提供上述安替比林类衍生物或包含上述安替比林类衍生物的组合物在制备抑制白色念珠菌被膜形成的药物、功能性食品、化妆品或清洁用品中的应用。
具体地，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种安替比林类衍生物，其具有式(I)所示结构：
Figure BDA0002004153110000022
其中，R1、R2各自独立的选自氢、卤素、C1～5的直链或支链的烷基。
在本发明的一些实施方式中，所述卤素选自氟、氯、溴、碘，尤其选自氯和溴。
在本发明中，所述C1～5的直链或支链的烷基包括甲基、乙基、丙基(包括正丙基、异丙基)、丁基(包括正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基)等；在本发明的一些实施方式中，所述C1～5的直链或支链的烷基为碳链长度不超过3个碳的烷基，优选为甲基和乙基，尤其优选为甲基。
在本发明的一些实施方式中，R1和R2互不相同。
在本发明的一些实施方式中，R1选自氢、卤素和甲基；R2选自氢、卤素和甲基。在又一些实施方式中，R1选自氢、溴、氯和甲基；R2选自氢和甲基。
在本发明较为优选的实施方式中，R1选自卤素和甲基；R2选自氢、卤素和甲基。
在本发明的一些较优的实施方式中，所述的安替比林类衍生物选自以下化合物：
化合物(1)：(Z)-4-((4-(4-溴苯基)-3-苯基噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,5-二甲基-2-苯基-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
化合物(2)：(Z)-1,5-二甲基-2-苯基-4-((3-苯基-4-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
化合物(3)：(Z)-1,5-二甲基-2-苯基-4-((4-苯基-3-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
化合物(4)：(Z)-4-((4-(4-溴苯基)-3-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,5-二甲基-2-苯基-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
化合物(5)：(Z)-4-((4-(4-氯苯基)-3-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,5-二甲基-2-苯基-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮。
在本发明的第二方面，本发明提供了上述安替比林类衍生物或包含该安替比林类衍生物的组合物应用，其包括下述应用中的任一种：
上述安替比林类衍生物或包含该安替比林类衍生物的组合物在制备抑制白色念珠菌的药物、功能性食品、化妆品或清洁用品中的应用；
上述安替比林类衍生物或包含该安替比林类衍生物的组合物在制备抑制白色念珠菌菌丝态形成的药物、功能性食品、化妆品或清洁用品中的应用；
上述安替比林类衍生物或包含该安替比林类衍生物的组合物在制备抑制白色念珠菌在细胞表面黏附的药物、功能性食品、化妆品或清洁用品中的应用；
上述安替比林类衍生物或包含该安替比林类衍生物的组合物在制备抑制白色念珠菌被膜形成的药物、功能性食品、化妆品或清洁用品中的应用；
上述安替比林类衍生物或包含安替比林类衍生物的组合物在制备用于预防和/或治疗与白色念珠菌感染相关的疾病或病症的药物或清洁用品中的应用。
与白色念珠菌感染相关的疾病或病症比如白色念珠菌口腔感染、白色念珠菌系统性感染。
本发明中所述的白色念珠菌可以为实验室常规菌株、临床分离得到的菌株、唑类敏感菌株或唑类耐药菌株，但并不限于此。本发明所述的唑类敏感菌株为对于唑类抗真菌药物具有有效反映的白色念珠菌菌株；所述的唑类耐药菌为具有耐药性的病原菌，在长期的唑类抗真菌药物选择之后出现的对唑类抗真菌药物产生耐药能力的白色念珠菌菌株。本发明所述的唑类抗真菌药物包括咪唑类和三唑类衍生物，举例而言，咪唑类如酮康唑、咪康唑、益康唑、克霉唑等；三唑类如伊曲康唑、氟康唑等。
白色念珠菌能够以三种形态生长，即菌体形态(又称为酵母态，即芽生孢子)、假菌丝形态及菌丝形态(本发明所述的菌丝态包括假菌丝形态及菌丝形态，尤其指菌丝形态，有时直接表述为菌丝)；菌体形态呈卵圆形，彼此之间易分离；假菌丝形态是一串形态延长的菌体细胞，细胞间有明显的分界和缢缩，假菌丝易形成分支；菌丝形态是平行延伸的管状菌丝，有细胞间隔，但间隔处没有缢缩，分隔也不是完全封闭的。不同形态的白色念珠菌形成的菌落不相同，其中，菌丝形态和假菌丝形态形成的菌落会侵入琼脂的下层，含有菌丝形态的菌落边缘会延伸出羽毛状突出物。
白色念珠菌的菌丝态形成与致病性相关联。感染过程中，白色念珠菌的毒力与其菌丝形态密切相关。白色念珠菌菌丝态形成常伴随毒力因子的表达，比如黏附因子等，并且在巨噬细胞吞噬作用下，可诱导被吞噬的白色念珠菌菌丝态的形成，该条件下生长的菌丝可刺破巨噬细胞，导致巨噬细胞死亡，从而赋予白色念珠菌抵抗宿主免疫的能力。白色念珠菌入侵组织的过程中，会发生由酵母态与菌丝态的转换，这种转换被称作二态性，其与白色念珠菌的致病性有关。菌丝态比酵母态具有更强的侵略性，更易持续黏附于宿主的上皮表面，在体外环境中，不能形成菌丝的突变体通常是毒力减弱的，并且菌丝的形成会使细胞的表面积增大，从而提高白色念珠菌细胞间繁殖的几率，利于白色念珠菌对宿主微环境的适应。
白色念珠菌形成的生物被膜为基底数层酵母态细胞黏附于无活力物体或活组织表面，其上方有细胞外基质(多为细胞外多糖)覆盖，内有大量菌丝态细胞生长，形成生物被膜容易表现出高度的耐药性。
本发明上述的安替比林类衍生物(即式(I)化合物)中，R1、R2各自独立的选自氢、卤素、C1～5的直链或支链的烷基；所述卤素选自氟、氯、溴、碘；在本发明的一些实施方式中，当卤素选自氯和溴时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果较优。
在本发明中，所述C1～5的直链或支链的烷基包括甲基、乙基、丙基(包括正丙基、异丙基)、丁基(包括正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基)等；在本发明的一些实施方式中，所述C1～5的直链或支链的烷基为碳链长度不超过3个碳的烷基，尤其为甲基和乙基，更尤其为甲基时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果较优。
在本发明的一些实施方式中，式(I)化合物中，R1和R2互不相同时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果较优。
在本发明的另一些实施方式中，R1选自氢、卤素和甲基；R2选自氢、卤素和甲基时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果较优。
在本发明又一些实施方式中，R1选自氢、溴、氯和甲基；R2选自氢和甲基时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果较优。
在本发明的再一些实施方式中，R1选自溴、氯和甲基；R2选自氢、卤素和甲基时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果较优。
以及，在上述某些实施方式的进一步优选中，R1和R2互不相同，并且R1和R2在上述取代基中选择时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果较优。
此外，在本发明的某些实施方式中或者在上述某些实施方式的进一步优选中，当R1不为H时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果更优。
以及，在本发明的某些实施方式中或者在上述某些实施方式的进一步优选中，R2为氢时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果更优。
以及，在本发明的某些实施方式中或者在上述某些实施方式的进一步优选中，R2为氢时，R1为溴或甲基，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果更优。
以及，在本发明的某些实施方式中或者在上述某些实施方式的进一步优选中，R2不为氢时，R1为氯相较于为溴，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果更优。
此外，在本发明更优的实施方式中，所述的安替比林类衍生物选自以下化合物：
化合物(1)：(Z)-4-((4-(4-溴苯基)-3-苯基噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,5-二甲基-2-苯基-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
化合物(2)：(Z)-1,5-二甲基-2-苯基-4-((3-苯基-4-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
化合物(3)：(Z)-1,5-二甲基-2-苯基-4-((4-苯基-3-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
化合物(4)：(Z)-4-((4-(4-溴苯基)-3-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,5-二甲基-2-苯基-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
化合物(5)：(Z)-4-((4-(4-氯苯基)-3-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,5-二甲基-2-苯基-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮。
本发明上述应用中所述的药物表示一种物质，该物质可以是药物活性成分本身，也可以是含有该活性成分的药物制剂，其对白色念珠菌具有明显的抑制作用，并能在较低剂量(比如不小于1μg/ml)时抑制白色念珠菌菌丝的形成、和/或抑制白色念珠菌在细胞表面的侵袭以及和/或抑制白色念珠菌被膜形成，从而阻断白色念珠菌对宿主的侵袭，并且这种抑制作用呈现出一定的剂量依赖性，比如在1-100μg/ml、1-64μg/ml、1-32μg/ml的浓度范围，随着浓度的升高抑制作用会增强，尤其在1-16μg/ml、1-8μg/ml、2-16μg/ml或2-8μg/ml的浓度范围，浓度依赖性更为尤为明显。
此外，本发明还提供了包括如上所述的安替比林类衍生物组合物，其以安替比林类衍生物为活性成分。所述组合物中包含除上述安替比林类衍生物外的至少一种其他成分。
在本发明的一些实施方式中，组合物中包含的其他成分可以为辅料或载体类物质，该类物质可能对白色念珠菌无直接作用，但可能通过与上述安替比林类衍生物的相互作用而改善或提高、甚至有需要时减弱其上述应用中提及的抑制作用；在本发明的又一些实施方式中，组合物中包含的其它成分可以为一种或多种活性成分，该一种或多种活性成分与上述安替比林类衍生物具有相同或类似的活性，当其与安替比林类衍生物合用时，可进一步增强该活性，该增强作用可以为一般增强，甚至可能会表现出出色的协同增效效果；或者该一种或多种活性成分具有与上述安替比林类衍生物完全不同的活性，当其与上述安替比林类衍生物合用时，可以实现多种效果，比如该一种或多种活性成分可以促进上述安替比林类衍生物的活性；或者，该一种或多种活性成分可以在一定程度上减弱上述安替比林类衍生物的活性；或者，上述安替比林类衍生物可以促进该一种或多种活性成分的活性；或者，上述安替比林类衍生物可以在一定程度上减弱该一种或多种活性成分的活性；或者，甚至会出现新的难以预料的有益效果，等等。
在本发明的一些实施方式中，上述安替比林类衍生物可以取不低于1μg/ml的浓度，比如1-100μg/ml、1-64μg/ml、1-32μg/ml、1-16μg/ml、1-8μg/ml、2-16μg/ml或2-8μg/ml；当然，当上述安替比林类衍生物与其他具有抑制和/或杀灭或者协助抑制和/或杀灭白色念珠菌等与本发明内容中所提及的相同应用的药物或活性成分联合使用时，其使用浓度理论上可以低于上述浓度，但也不排除特殊的例外情况。
在本发明的一些实施方式中，上述安替比林类衍生物可用于口腔耐药真菌感染和系统性真菌感染，均表现出了良好的治疗效果，且不易产生耐药。其中，在本发明的某些实施方式中，在用于口腔耐药白色念珠菌感染治疗时，上述安替比林类衍生物的药物浓度为高于1μg/ml，优选为1-100μg/ml，进一步优选为1-50μg/ml或者50-100μg/ml，比如可以为1-32μg/ml、1-16μg/ml、1-8μg/ml、2-16μg/ml或2-8μg/ml这些浓度范围及这些浓度范围内的任意浓度值，或者再高一些的浓度时，比如可以为50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml；其中，在本发明的某些实施方式中，在用于口腔耐药白色念珠菌感染治疗时，上述安替比林类衍生物的药物浓度为不低于1mg/kg，优选为1-50mg/kg，比如可以为5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg等等。
本发明所述安替比林类衍生物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药。给药剂型本领域技术人员可以在常规的剂型中选择，比如通过加入与上述安替比林类衍生物相容的载体、赋形剂、粘合剂、溶剂等等来实现。该处所述的常规剂型比如液体剂型、固体剂型、外用制剂、喷剂等等，比如可以为下列剂型：真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型、片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂等。
本发明的药物组合或药物制剂中还可以含有常用的载体，这里所述可药用载体，本领域技术人员可以在下列常用的载体中选择：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐、甘油、山梨酯、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜂蜡、羊毛酯等。载体在药物组合物中的含量可以是1wt％-98wt％，通常大约占到60wt％-80wt％。为方便起见，如需局部麻醉剂、防腐剂或缓冲剂等，其可直接溶于载体中。
口服片剂和胶囊可以含有赋形剂，本领域技术人员可在常用的选择中根据需求挑选，比如粘合剂，如糖浆、阿拉伯胶、山梨醇、黄芪胶、或聚乙烯吡咯烷酮等；比如填充剂，如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇、氨基乙酸等；比如润滑剂，如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、硅土等；比如崩解剂、如马铃薯淀粉等，或可接受的增润剂，如月桂醇钠硫酸盐等。片剂也可以用制药学上公知的方法包衣。
口服液可以与适宜的溶剂制成悬浮液、溶液、乳浊液、糖浆，也可以制成干品，用前补充适宜溶剂或本领域已知的其他合适的媒质。这类液体制剂可以包含常规的添加剂，可根据需要进行选择，比如悬浮剂，如山梨醇、纤维素甲醚、葡萄糖糖浆、凝胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶、氢化的食用油脂等；比如乳化剂，如卵磷脂，山梨聚糖单油酸盐，阿拉伯树胶等；或非水载体(可能包含可食用油)，如杏仁油，油脂如甘油、乙二醇或乙醇等；比如防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、山梨酸等。如需要可添加调味剂或着色剂。
此外，固体制剂也可以制成如牙膏、固体漱口水、口香糖、含片、口腔贴片等；外用喷剂或液体制剂也可以制成如漱口水、洗剂等。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明实施例1中化合物(1)(2μg/ml)、化合物(2)(2μg/ml)、化合物(3)(8μg/ml)、化合物(4)(4μg/ml)、化合物(5)(2μg/ml)及空白对照在37℃和RPMI-1640液体培养基的条件下抑制白色念珠菌菌丝形成的效果。标尺为50μm。
图2为本发明实施例2中化合物(1)以0～8μg/ml加于固体Spider培养基中时，抑制平板表面的白色念珠菌菌丝态形成的效果。标尺为500μm。
图3为本发明实施例3中化合物(1)以0～8μg/ml使用时，抑制白色念珠菌在不同液体培养基中菌丝态形成的效果。标尺为25μm。
图4本发明实施例4中化合物(1)以0～8μg/ml高二氧化碳条件下于液体RPMI-1640培养基中，抑制白色念珠菌菌丝态形成的效果。标尺为25μm。
图5为本发明实施例5中化合物(1)以0～8μg/ml加于固体YPD平板中时，抑制包埋于培养基内部的白色念珠菌菌丝态形成的效果。标尺为1mm。
图6为本发明实施例6中化合物(1)以0～16μg/ml使用时，抑制白色念珠菌在细胞表面黏附的效果。以卡尔科弗卢尔荧光增白剂染色白色念珠菌细胞壁。标尺为100μm。***表示p值小于0.001。其中，氟康唑的浓度为4μg/ml。
图7为本发明实施例7中化合物(1)以0～16μg/ml使用时，抑制白色念珠菌在RPMI-1640液体培养基中形成被膜的效果。所用的带有绿色荧光的荧光素刀豆蛋白A(ConA-FITC)为着色酵母细胞壁多糖的染料。标尺为25μm。**表示p值小于0.01，***表示p值小于0.001。
图8为本发明实施例8中化合物(1)以0～100μg/ml使用时，对小鼠口腔白色念珠菌感染的治疗效果。标尺为50μm。
图9本发明实施例8中化合物(1)以10mg/kg对小鼠尾静脉注射时，对小鼠白色念珠菌系统性感染的治疗效果。标尺为50μm。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。如无特别说明，本发明所用材料、试剂、菌种、菌株、常用酶等均为本领域常规使用的或可经常规途径购买得到，其使用方法依照本领域常规使用的方式或者依照产品说明。
本发明式(I)化合物的筛选原理：使用在白色念珠菌DPP3基因(编码法尼醇合成酶)上标记了绿色荧光蛋白的荧光菌株(比如DPP3-GFP白色念珠菌荧光菌株)，菌株绿色荧光强度的变化可间接反应法尼醇的合成量。法尼醇是白色念珠菌分泌的一种群体感应分子，能抑制cAMP合成酶Cdc35的活性，降低胞内cAMP含量，稳定菌丝负转录调控因子Nrg1的含量，实现抑制菌丝形成。本发明利用该荧光菌株对合成分子库进行高通量筛选获得能够诱导法尼醇合成的小分子。利用该方法，筛选得到本发明中的安替比林类衍生物，即本发明的式(I)化合物，它们几乎无细胞毒活性，不易产生耐药，在低浓度即可抑制白色念珠菌菌丝的形成、和/或抑制白色念珠菌在细胞表面的侵袭以及和/或抑制白色念珠菌被膜形成，从而阻断白色念珠菌对宿主的侵袭。
在本发明的一个实施方式中，本发明所述的安替比林类衍生物由以下步骤筛选得到：
1)使用白色念珠菌营养缺失型菌株BWP17构建DPP3-GFP白色念珠菌荧光菌株；
2)使用384孔板，将从国家化合物库中购得的50000个化合物在1640培养基中以每毫升16μg与每毫升1×105菌浓度的DPP3-GFP菌株共孵育5h；
3)使用荧光显微镜分别观察384孔板各个孔中菌株的荧光强度，与野生型菌株对比，使荧光强度上升5倍孔的化合物即为筛选得到的化合物，即本发明所述的安替比林类衍生物，具有式(I)所示结构。
本发明筛选得到的安替比林类衍生物(即式(I)化合物)中，R1、R2各自独立的选自氢、卤素、C1～5的直链或支链的烷基；所述卤素选自氟、氯、溴、碘；在本发明的一些实施方式中，当卤素选自氯和溴时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果较优。
在本发明中，所述C1～5的直链或支链的烷基包括甲基、乙基、丙基(包括正丙基、异丙基)、丁基(包括正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基)等；在本发明的一些实施方式中，所述C1～5的直链或支链的烷基为碳链长度不超过3个碳的烷基，尤其为甲基和乙基，更尤其为甲基时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果较优。
在本发明的一些实施方式中，式(I)化合物中，R1和R2互不相同时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果较优。
在本发明的另一些实施方式中，R1选自氢、卤素和甲基；R2选自氢、卤素和甲基时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果较优。
在本发明又一些实施方式中，R1选自氢、溴、氯和甲基；R2选自氢和甲基时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果较优。
在本发明的再一些实施方式中，R1选自溴、氯和甲基；R2选自氢、卤素和甲基时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果较优。
以及，在上述某些实施方式的进一步优选中，R1和R2互不相同，并且R1和R2在上述取代基中选择时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果较优。
此外，在本发明的某些实施方式中或者在上述某些实施方式的进一步优选中，当R1不为H时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果更优。
以及，在本发明的某些实施方式中或者在上述某些实施方式的进一步优选中，R2为氢时，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果更优。
以及，在本发明的某些实施方式中或者在上述某些实施方式的进一步优选中，R2为氢时，R1为溴或甲基，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果更优。
以及，在本发明的某些实施方式中或者在上述某些实施方式的进一步优选中，R2不为氢时，R1为氯相较于为溴，上述应用中所述的对白色念珠菌的抑制，尤其对白色念珠菌菌丝态形成的抑制和/或对白色念珠菌在细胞表面黏附的抑制和/或对白色念珠菌被膜形成的抑制效果更优。
本发明保护的是一类化合物的应用，根据上述筛选实验可知，本发明的安替比林类衍生物可以使DPP3-GFP白色念珠菌荧光菌株的荧光强度上升5倍以间接提示法尼醇的合成量的上升，进而提示其对白色念珠菌的抑制。
以下，本发明提供了某些示例化合物抑制白色念珠菌的实施例，以下实施例旨在进一步说明或解释或验证本发明而非将本发明局限于以下示例化合物，并且以下实施例并不构成对本发明的不当限定。
实施例1安替比林类化合物在液体培养基中对白色念珠菌菌丝态形成的抑制实验
1、试药
二甲基亚砜：北京索莱宝科技有限公司。
化合物(1)：(Z)-4-((4-(4-溴苯基)-3-苯基噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,5-二甲基-2-苯基-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
化合物(2)：(Z)-1,5-二甲基-2-苯基-4-((3-苯基-4-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
化合物(3)：(Z)-1,5-二甲基-2-苯基-4-((4-苯基-3-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
化合物(4)：(Z)-4-((4-(4-溴苯基)-3-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,5-二甲基-2-苯基-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
化合物(5)：(Z)-4-((4-(4-氯苯基)-3-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,5-二甲基-2-苯基-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮。
上述化合物(1)-(5)均购自于国家化合物样品库，使用时分别用二甲基亚砜配成浓度为10mg/ml的母液，作为试药。
各试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学检验。
2、菌株
白色念珠菌野生型SC5314。
所用菌株均于酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)划板活化，于30℃培养2天后，挑取单克隆再次划板活化。
3、培养基
1)YPD液体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
YPD固体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，琼脂8g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
2)RPMI-1640液体培养基：
RPMI-1640固体粉末(Gibco BRL)10g，NaHCO3 2.0g，吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g，加三蒸水900ml溶解，1M NaOH调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。
4、仪器设备
SW-CJ-JC型双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)
NBS Innova 42型恒温摇床(德国eppendorf产品)
5、实验方法
将活化过夜的白色念珠菌SC5314菌株，用RPMI-1640培养基调节至每毫升1×105个细胞，加入到无菌的96孔板中，然后通过倍数稀释法，分别梯度加入不同剂量式1中的化合物，使各孔的最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1和0.5μg/ml(空白对照组试药浓度为0)，各孔中DMSO含量均低于1％。37℃静止培养6h后，用显微镜观察白色念珠菌的形态。
6、实验结果
通过显微镜观察，显微镜拍摄照片见图1，图1示出了化合物(1)(2μg/ml)、化合物(2)(2μg/ml)、化合物(3)(8μg/ml)、化合物(4)(4μg/ml)、化合物(5)(2μg/ml)及空白对照在37℃和RPMI-1640液体培养基的条件下抑制白色念珠菌菌丝形成的效果，标尺为50μm。与空白对照相比，化合物(1)-(5)中均未观察到菌丝形成，表明化合物(1)-(5)均有较好的抑制白色念珠菌菌丝态形成的效果。
实施例2
安替比林类化合物在固体培养基中对白色念珠菌菌丝态形成的抑制实验
1、试药
二甲基亚砜：北京索莱宝科技有限公司。
将化合物(1)用二甲基亚砜配成浓度为10mg/ml的母液，作为试药。
试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，进行药效学检验。
2、菌株
白色念珠菌野生型SC5314。
所用菌株均于酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)划板活化，于30℃培养2天后，挑取单克隆再次划板活化。
3、培养基
1)YPD液体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
2)YPD固体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，琼脂8g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
3)Spider固体加药培养基：
营养肉汤10g，甘露醇10g，磷酸二氢钾2g，琼脂20g，加900ml蒸馏水溶解，用1MNaOH溶液调pH至7.2，定容至1000ml，高压灭菌(121℃，20min)后，冷却到约45℃时分装，加入不同浓度的化合物(1)，充分混匀，倒于细胞培养皿中，密封后于4℃保存备用。
4、仪器设备
SW-CJ-JC型双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)
NBS Innova 42型恒温摇床(德国eppendorf产品)
5、实验方法
将过夜培养的白色念珠菌SC5314菌株，用磷酸盐缓冲液调整菌浓度为每毫升1×103个细胞，取50μl菌液涂布于上述加药的Spider固体培养基上。30℃条件下静置培养5天，长出的单克隆用光学显微镜观察并拍照记录。
6、实验结果：
对不同剂量药物平板上菌落形态的观察，选取0-8μg/ml范围内的实验结果并拍照，如图2所示。图2示出了化合物(1)分别以0、1、2、4、8μg/ml的剂量加于固体Spider培养基中时，抑制平板表面的白色念珠菌菌丝态形成的效果，标尺为500μm。由图2可知，化合物(1)在浓度1μg/ml时即显示出一定的菌丝抑制能力，随着浓度的提升，化合物(1)对菌丝抑制能力提高，当浓度达到4μg/ml，基本完全抑制了菌丝的形成，当浓度达到8μg/ml，菌体表面光滑。
实施例3安替比林类化合物在诱导菌丝形成条件下抑制白色念珠菌菌丝态形成的实验
1、试药
二甲基亚砜：北京索莱宝科技有限公司。
将化合物(1)用二甲基亚砜配成浓度为10mg/ml的母液，作为试液。
试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，进行药效学检验。
2、菌株
白色念珠菌野生型SC5314。
所用菌株均于酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)划板活化，于30℃培养2天后，挑取单克隆再次划板活化。
3、培养基
1)YPD液体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
2)YPD固体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，琼脂8g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
3)RPMI-1640液体培养基：
RPMI-1640固体粉末(Gibco BRL)10g，NaHCO3 2.0g，吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g，加三蒸水900ml溶解，1M NaOH调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。
3)RPMI-1640液体培养基+5％血清：
RPMI-1640固体粉末(Gibco BRL)10g，NaHCO3 2.0g，吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g，加三蒸水900ml溶解，1M NaOH调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至995ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，加入5ml血清(Sigma)分装后于4℃保存备用。
4)合成培养基(SC)+N-乙酰葡糖胺(即GlcNAc)：
取硫酸铵粉末5g，混合氨基酸粉末1.36g，酵母氮源6.7g，N-乙酰葡糖胺20g，加三蒸水900ml溶解，1M NaOH调pH至7.0(25℃)，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
5)Spider液体培养基：
营养肉汤10g，甘露醇10g，磷酸二氢钾2g，加900ml蒸馏水溶解，用1M NaOH溶液调pH至7.2，定容至1000ml，高压灭菌(121℃，15min)于4℃保存备用。
4、仪器设备
SW-CJ-JC型双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)
NBS Innova 42型恒温摇床(德国eppendorf产品)
5、实验方法
将活化过夜的白色念珠菌SC5314菌株，分别用RPMI-1640培养基、RPMI-1640液体培养基+5％血清、合成培养基(SD)+N-乙酰葡糖胺或Spider液体培养基调节至每毫升1×105个细胞，加入到无菌的96孔板中，然后通过倍数稀释法，梯度分别加入不同剂量的化合物(1)，使各孔的最终药物浓度分别为8、4、2和1μg/ml(对照组试药浓度为0)，各孔中DMSO含量均低于1％。37℃静止培养6h后，用显微镜观察白色念珠菌的形态。
6、实验结果
通过显微镜对菌株形态进行观察后，可以发现在各种诱导菌丝生成条件下(RPMI-1640液体培养基、RPMI-1640液体培养基+5％血清、合成培养基+N-乙酰葡糖胺、Spider液体培养基)，化合物(1)分别以1、2、4、8μg/ml的浓度使用时，均能极强的抑制白色念珠菌菌丝态的形成，结果见图3(标尺为25μm)所示，并且随着浓度的升高，抑制效果显著提高，尤其在Spider液体培养基中，化合物的浓度为1μg/ml时，即可基本上完全抑制了菌丝的形成。
实施例4安替比林类化合物在高浓度二氧化碳条件下抑制白色念珠菌菌丝态形成的实验
1、试药
二甲基亚砜：北京索莱宝科技有限公司。
将化合物(1)用二甲基亚砜配成浓度为10mg/ml的母液，作为试药。
试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，进行药效学检验。
2、菌株
白色念珠菌野生型SC5314。
所用菌株均于酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)划板活化，于30℃培养2天后，挑取单克隆再次划板活化。
3、培养基
1)YPD液体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
2)YPD固体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，琼脂8g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。
3)RPMI-1640液体培养基：
RPMI-1640固体粉末(Gibco BRL)10g，NaHCO3 2.0g，吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g，加三蒸水900ml溶解，1M NaOH调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。
4)RPMI-1640液体培养基+25mM NaHCO3：
取5ml中分装好的RPMI-1640液体培养基，加入125μl 1M的NaHCO3水溶液(已用0.22μm微孔滤膜过滤除菌)，使其终浓度为25mM。
4、仪器设备
SW-CJ-JC型双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)
NBS Innova 42型恒温摇床(德国eppendorf产品)
5、实验方法
将活化过夜的白色念珠菌SC5314菌株，用RPMI-1640培养基和RPMI-1640培养基+25mM NaHCO3分别调节至每毫升1×105个细胞，加入到无菌的96孔板中，然后通过倍数稀释法，梯度分别加入不同剂量式1中的化合物，使各孔的最终药物浓度分别为8、4和2μg/ml(对照中试药浓度为0)，各孔中DMSO含量均低于1％。37℃静止培养6h后，用显微镜观察白色念珠菌的形态。
6、实验结果
通过显微镜对菌株形态进行观察后，可以发现在高浓度二氧化碳条件下，化合物(1)仍具有极强的抑制菌丝的活性，具体实验结果如图4所示，根据图4可知，当化合物浓度在2μg/ml时即表现出对菌丝形成的明显的抑制，在2-8μg/ml随着浓度的提高，抑制效果显著提升，并且高二氧化碳的存在并未对该抑制效果产生明显影响，推测在更高浓度下，可能具有更高的抑制活性。
实施例5安替比林类化合物在固体包埋条件下抑制白色念珠菌菌丝态形成的实验
1、试药
二甲基亚砜：北京索莱宝科技有限公司。
将化合物(1)用二甲基亚砜配成浓度为10mg/ml的母液，作为试药。
试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，进行药效学检验。
2、菌株
白色念珠菌野生型SC5314。
所用菌株均于酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)划板活化，于30℃培养2天后，挑取单克隆再次划板活化。
3、培养基
1)YPD液体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
2)YPD固体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，琼脂8g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。
3)YPD固体加药培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，琼脂8g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后，冷却到约45℃时分装，加入不同浓度的化合物(1)，充分混匀，进行包埋试验时，将50μl菌浓度为1×103个每毫升的菌液同时加入混匀，倒于细胞培养皿中，密封后于4℃保存备用。
4、仪器设备
SW-CJ-JC型双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)
NBS Innova 42型恒温摇床(德国eppendorf产品)
5、实验方法
将过夜培养的白色念珠菌SC5314菌株，用磷酸盐缓冲液调整菌浓度为每毫升1×103个细胞，每次取50μl，分别与含不同剂量化合物(1)的融化了的YPD固体培养基(45℃左右)混合。30℃条件下静置培养5天，长出的单克隆用光学显微镜观察并拍照记录。
6、实验结果：
通过显微镜对菌株形态进行观察，选取0-8μg/ml范围内的实验结果拍照，如图5所示，结果发现在固体培养基包埋条件下，当化合物(1)的浓度大于1μg/ml时仍具有极强的抑制菌丝形成的活性，并且随着浓度的升高，对菌丝形成的抑制活性增强，如图所示，当化合物浓度为4μg/ml，基本上完全抑制了菌丝的形成。
实施例6安替比林类化合物抑制白色念珠菌在细胞表面黏附的实验
1、试药
二甲基亚砜：北京索莱宝科技有限公司。
将化合物(1)用二甲基亚砜配成浓度为10mg/ml的母液，作为试药。
试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，进行药效学检验。
2、细胞株
人口腔癌KB细胞。
3、菌株
白色念珠菌野生型SC5314。
所用菌株均于酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)划板活化，于30℃培养2天后，挑取单克隆再次划板活化。
4、培养基
1)YPD液体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。
2)YPD固体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，琼脂8g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
3)RPMI-1640液体培养基：
RPMI-1640固体粉末(Gibco BRL)10g，NaHCO3 2.0g，吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g，加三蒸水900ml溶解，1M NaOH调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。
5、仪器设备
SW-CJ-JC型双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)
NBS Innova 42型恒温摇床(德国eppendorf产品)
6、实验方法
KB细胞(2×104个细胞每孔)，在含10％胎牛血清和抗生素的RPMI-1640培养基中37℃培养24h，弃上清，PBS缓冲液洗去未贴壁细胞。每孔接种5×105个白色念珠菌，同时加入不同浓度的化合物(1)。37℃静置孵育90min后，弃上清，用磷酸盐缓冲液洗去未贴壁细胞，4％多聚甲醛固定细胞。白色念珠菌用5μg/ml卡尔科弗卢尔荧光增白剂染色细胞壁，暗处孵育30min。染色后，PBS缓冲液洗去未结合的染料，显微镜下观察拍照并计数黏附的白色念珠菌的数量。
7、实验结果
通过显微镜对菌株形态进行观察，可以发现在以细胞作为基底的条件下，化合物(1)具有极强的抑制白色念珠菌在细胞表面黏附的能力。选取0-16μg/ml的实验结果进行分析，结果如图6所示，根据图6可知，在0-16μg/ml的范围内，随着浓度的提升，化合物对白色念珠菌在细胞表面黏附能力的抑制作用显著提高，在4μg/ml时，化合物表现出较强的抑制黏附的能力，黏附到细胞表面的白色念珠菌的数量相较于对照组大幅降低，并且抑制活性明显优于氟康唑(4μg/ml)；当化合物浓度高于4μg/ml，达到8μg/ml时，黏附到细胞表面的白色念珠菌的数量已经寥寥无几，抑制黏附的效果特别显著。
实施例7安替比林类化合物抑制白色念珠菌形成被膜方面的实验
1、试药
二甲基亚砜：北京索莱宝科技有限公司
将化合物(1)用二甲基亚砜配成浓度为10mg/ml的母液，作为试药。
试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，进行药效学检验
2、菌株
白色念珠菌野生型SC5314。
所用菌株均于酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)划板活化，于30℃培养2天后，挑取单克隆再次划板活化。
3、培养基
1)YPD液体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
2)YPD固体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，琼脂8g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
3)RPMI-1640液体培养基：
RPMI-1640固体粉末(Gibco BRL)10g，NaHCO3 2.0g，吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g，加三蒸水900ml溶解，1M NaOH调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。
4、仪器设备
SW-CJ-JC型双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)
NBS Innova 42型恒温摇床(德国Eppendorf)
Synergy H1多功能酶标仪(美国Biotek)
IX71倒置荧光显微镜(日本Olympus)
5、实验方法
将活化过夜的白色念珠菌SC5314菌株，用RPMI-1640培养基调节至每毫升1×106个细胞，加入到无菌的96孔板中，然后通过倍数稀释法，分别梯度加入不同剂量的化合物(1)，使各孔的最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1和0.5μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1％。37℃静止培养24h后，弃上清，用PBS缓冲液洗3次，除去悬浮菌。在孔中加入100μl的XTT/甲萘醌溶液，37℃孵育4h后，取70μl上清液转移至新孔中，使用酶标仪测量其在490nm波长下的吸光度，计算抑制率。此外在在每个药物剂量的副孔中加入细胞壁染色剂ConA-FITC(40μg/ml)，染色30分钟后，用PBS清洗2次，用荧光显微镜绿色荧光通道进行观察。
6、实验结果
通过显微镜对菌株形态进行观察，选取以0～16μg/ml浓度范围拍照记录，结果如图7所示，可以发现在适宜诱导菌丝生成的条件下，化合物(1)仍具有极强的抑制菌丝活性，并能够显著抑制被膜的形成；如图所示，相较于对照组，化合物在2μg/ml浓度就能显著地抑制被膜的形成，随着浓度升高，这种抑制效果更为明显，当浓度达到4μg/ml时，菌丝基本上无法形成，白色念珠菌细胞无聚集黏附现象，被膜无法形成。
实施例8安替比林类化合物对小鼠口腔白色念珠菌感染的治疗作用
1、试药
二甲基亚砜：北京索莱宝科技有限公司，批号2021101。
将化合物(1)用二甲基亚砜配成浓度为10mg/ml的母液，作为试药。
试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，进行药效学检验。
2、菌株
临床唑类耐药白色念珠菌菌株28A。
所用菌株均于酵母浸出粉蛋白胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)划板活化，于30℃培养2天后，挑取单克隆再次划板活化。
3、动物
6～8周龄BALB/c雌性小鼠，购自山东大学动物实验中心。
4、培养基
1)YPD液体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
2)YPD固体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，琼脂8g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
5、仪器设备
SW-CJ-JC型双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)
NBS Innova 42型恒温摇床(德国eppendorf产品)
6、实验方法
选取6-8周的BALB/c小鼠随机分组，在感染前2d每天给小鼠腹腔注射220mg/kg醋酸可的松抑制小鼠免疫系统，感染前1d在小鼠饮水中加入盐酸四环素0.83g/L直至实验结束。感染前禁水6h，感染时在小鼠皮下注射200μl 0.3％戊巴比妥钠水溶液使其麻醉，麻醉持续时间约2h。用棉拭子浸入2.0×108个/mL的白色念珠菌悬液，在小鼠口腔黏膜表面涂抹约1min，随后将棉签置于舌上，保持该状态1.5h，取出棉签，观察小鼠状态至其恢复清醒。感染3h后，在小鼠饮水中加入一定浓度的安替比林类衍生物(如0-100μg/ml化合物(1))，每天更换一次饮用水。治疗3d后，处死小鼠，用无菌棉拭子擦拭小鼠整个口腔1min，棉签头部剪掉立即放入含有0.6mL PBS的离心管内，使用旋涡振荡器高速震荡10min，点板计数。使用灭菌手术器械将舌取下，一半进行研磨处理，计数舌头中的菌量，另一半置于4％的多聚甲醛中，制备切片，糖原和H&E染色，用显微镜观察白色念珠菌感染情况和组织损伤程度。
7、实验结果
通过对口腔中残留菌计数和使用显微镜对糖原染色切片观察后，可以发现在小鼠口腔白色念珠菌感染模型中，化合物(1)在不低于1μg/ml时，比如本实施例测定的1-100μg/ml具有极强的抑制菌丝的活性，并能降低白色念珠菌对舌头组织的侵袭，控制真菌感染，选取两个浓度值(50μg/ml和100μg/ml)的结果作为展示，如图8所示，根据实验结果(A)，相较于感染对照组，化合物浓度为50μg/ml时，口腔中残留白色念珠菌的数量下降将近1.5个数量级，抑制效果显著，并且随着浓度提升至100μg/ml，残留菌数量仍有约0.5个数量级的下降；根据实验结果(B)，相较于感染对照组，给与50μg/ml和100μg/ml化合物的组织中白色念珠菌的数量较低且损伤程度较低，并且随着浓度的提高(比如在1-100μg/ml内)菌数量更低以及因白色念珠菌感染所致的组织损伤程度更轻。
实施例9安替比林类化合物对小鼠白色念珠菌系统性感染的治疗作用
1、试药
二甲基亚砜：北京索莱宝科技有限公司，批号2021101。
将化合物(1)用二甲基亚砜配成浓度为10mg/ml的母液，作为试药。
试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，进行药效学检验。
2、菌株
白色念珠菌野生株SC5314。
所用菌株均于酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)划板活化，于30℃培养2天后，挑取单克隆再次划板活化。
3、动物
6～8周龄BALB/c雌性小鼠，购自山东大学动物实验中心。
4、培养基
1)YPD液体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
2)YPD固体培养基：
蛋白胨8g，葡萄糖8g，酵母淀粉4g，琼脂8g，加三蒸水350ml溶解，再用三蒸水定容至400ml，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。
5、仪器设备
SW-CJ-JC型双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)
NBS Innova 42型恒温摇床(德国eppendorf产品)
6、实验方法
选取6-8周的BALB/c小鼠分成给药组和对照组，建立系统性真菌感染模型。将活化过夜的SC5314菌株，用生理盐水配成浓度为每毫升5×106个细胞的菌液，小鼠通过尾静脉注射100μl菌液，约5×105个白色念珠菌SC5314酵母态细胞。感染4小时后，给药组按小鼠体重腹腔注射给药化合物(1)(10mg/kg)，对照组注射等量生理盐水。每天给药一次，连续给药5d后停止治疗。统计每组小鼠的存活率，在治疗的第四天，每组取一只小鼠，进行解剖，进行组织切片观察糖原染色。
7、实验结果
通过对肾脏中的菌量计数和使用显微镜对糖原染色切片观察后，可以发现在小鼠白色念珠菌系统性感染模型中，化合物(1)仍具有极强的抑制菌丝的活性，并能显著提高被感染小鼠的存活率。具体实验结果如图9所示。
实施例10安替比林类化合物细胞毒活性测试
1、试药
二甲基亚砜：北京索莱宝科技有限公司。
MTT(四唑盐)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
将化合物(1)用二甲基亚砜配成浓度为10mg/ml的母液，作为试药。
试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，进行药效学检验。
2、细胞株
人支气管上皮样细胞(HBE)，人视网膜色素上皮细胞(RPE1)，人前列腺上皮细胞(RWPE-1)。每次实验前，将所用细胞株从液氮中取出复苏，在细胞培养箱中继续培养。
3、MTT溶液及培养基配制
MTT溶液：称取MTT粉末0.5g，避光溶于适量灭菌PBS后定容至100ml。过0.22μm无菌滤膜除菌，分装，用封口膜封口后放置于-20℃避光保存。
DMEM基础培养基：DMEM粉末14.6g，碳酸氢钠2.5g，HEPES4.76g，溶于900ml灭菌三蒸水中，再用三蒸水定容至1L。0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。
DMEM完全培养基：于100ml灭菌处理过的玻璃瓶中加入10ml胎牛血清、1mlL-谷氨酰胺(29.2mg/ml)、青霉素(10万单位/ml)和硫酸链霉素(10万单位/ml)各100μl，加入DMEM基础培养基定容至100ml，混合均匀，用封口膜封口后置于4℃备用。
4、仪器设备
SW-CJ-JC型双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)
NBS Innova 42型恒温摇床(德国eppendorf产品)
370型细胞培养箱(美国Thermo产品)
Synergy H1多功能酶标仪(美国Biotek)
5、实验方法
取生长状态良好的处于对数生长期的细胞接种于96孔板中，1×104个细胞每孔，放入细胞培养箱培养过夜，根据实验设计加药处理细胞，每组3个复孔，药物处理细胞24h后，加入10μl配制好的MTT溶液，于细胞培养箱中孵育4h，光学显微镜下观察有结晶紫生成，缓慢吸出培养基，每孔中加入100μl DMSO，室温振摇至结晶溶解完全，将酶标仪设置成570nm波长测量各个孔吸光度值，根据测量结果计算细胞活力，重复3次。
6、实验结果如表1所示
表1化合物(1)对人体正常细胞的细胞毒活性
表1
Figure BDA0002004153110000261
由表1所示结果可见，化合物(1)对人正常细胞产生细胞毒作用的浓度远高于化合物(1)抑制白色念珠菌菌丝态形成的浓度，化合物(1)对人正常细胞具有较低的细胞毒活性。
根据相同的方法对其他化合物进行测试，其对人正常细胞产生细胞毒作用的浓度也远高于其抑制白色念珠菌菌丝态形成的浓度，对人正常细胞具有较低的细胞毒活性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.安替比林类衍生物或包含安替比林类衍生物的组合物在制备抑制白色念珠菌的药物、功能性食品、化妆品或清洁用品中的应用，所述安替比林类衍生物如式(I)所示：
Figure FDA0002004153100000011
其中，R1、R2各自独立的选自氢、卤素、C1～5的直链或支链的烷基。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述卤素选自氟、氯、溴、碘，优选为氯和溴。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述C1～5的直链或支链的烷基选自甲基、乙基、丙基、丁基。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，R1和R2互不相同。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，R1选自氢、卤素和甲基；R2选自氢、卤素和甲基。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的应用，其特征在于，所述安替比林类衍生物选自以下化合物：
(Z)-4-((4-(4-溴苯基)-3-苯基噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,5-二甲基-2-苯基-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
(Z)-1,5-二甲基-2-苯基-4-((3-苯基-4-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
(Z)-1,5-二甲基-2-苯基-4-((4-苯基-3-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
(Z)-4-((4-(4-溴苯基)-3-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,5-二甲基-2-苯基-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮；
(Z)-4-((4-(4-氯苯基)-3-(对甲苯基)噻唑-2(3H)-亚甲基)氨基)-1,5-二甲基-2-苯基-1,2-二氢-3H-吡唑-3-酮。
7.安替比林类衍生物或包含安替比林类衍生物的组合物在制备抑制白色念珠菌菌丝态形成的药物、功能性食品、化妆品或清洁用品中的应用，所述安替比林类衍生物的结构如权利要求1至6中任一项所述。
8.安替比林类衍生物或包含安替比林类衍生物的组合物在制备抑制白色念珠菌在细胞表面黏附的药物、功能性食品、化妆品或清洁用品中的应用，所述安替比林类衍生物的结构如权利要求1至6中任一项所述。
9.安替比林类衍生物或包含安替比林类衍生物的组合物在制备抑制白色念珠菌被膜形成的药物、功能性食品、化妆品或清洁用品中的应用，所述安替比林类衍生物的结构如权利要求1至6中任一项所述。
10.安替比林类衍生物或包含安替比林类衍生物的组合物在制备治疗与白色念珠菌感染相关的疾病或病症的药物或清洁用品中的应用。
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