CN111671795B - 一种治疗糖尿病周围神经病变的中药组合物及中药制剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种治疗糖尿病周围神经病变的中药组合物及中药制剂和应用，涉及中药技术领域；所述中药组合物包括：丹参6‑10份，白芥子6‑10份，黄芪4‑8份，川芎4‑8份，元胡4‑8份，女贞子2‑6份，鸡血藤2‑6份，葛根2‑6份，桂枝2‑6份，菟丝子2‑6份，丝瓜络2‑6份。本发明的中药组合物通过对糖尿病周围神经病变“代谢记忆”效应进行干预：针对正气亏虚、脏腑功能失调之本治以补虚扶正，正气存内则邪不可干；同时去除伏匿于体内的痰瘀之邪，邪去则正安。通过有效清除各种损伤性因子，恢复周围神经区域微环境稳定，最终达到阻止“代谢记忆”效应，治疗糖尿病周围神经病变的目的。

Description

一种治疗糖尿病周围神经病变的中药组合物及中药制剂和 应用

技术领域

本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种治疗糖尿病周围神经病变的中药组合物及中药制剂和应用。

背景技术

糖尿病周围神经病变是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一，随着病程的延长其发生率可高达90％以上。糖尿病周围神经病变是造成糖尿病足及糖尿病患者截肢致残的主要原因之一,严重影响着患者的生活质量及寿命。

“代谢记忆”效应与糖尿病周围神经病变的发生密切相关，如何正确认识并打破“代谢记忆”的不良影响及阻止“代谢记忆”对周围神经的持续损伤，成为目前糖尿病周围神经病变防治的重要核心。根据中医理论，糖尿病周围神经病变属本虚标实之证，主要病机是由于消渴日久，气血阴阳精微物质亏虚，导致其在络脉中无以运行，脉络阻滞，气血不能通达四末，肌肉筋脉失于濡养所致。而“代谢记忆”效应的持续存在及对糖尿病周围神经病变发生发展的影响类似于伏邪在体内伏匿的过程，正气亏虚，脏腑功能失调是“伏邪”产生的基本条件，痰浊、瘀血则是“伏邪”的主要构成部分。痰瘀伏邪匿于体内，伺机而动，同时正气损耗，阴阳失衡，正邪交争藏于内，机体功能紊乱，代谢异常无法清除各种损伤因子，则表现为糖尿病周围神经病变的各种症状。

发明内容

为了解决上述问题，本发明针对提供一种治疗糖尿病周围神经病变的中药组合物及中药制剂和应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案之一为：一种治疗糖尿病周围神经病变的中药组合物，所述组合物包括以下组分：丹参6-10份，白芥子6-10份，黄芪4-8份，川芎4-8份，元胡4-8份，女贞子2-6份，鸡血藤2-6份，葛根2-6份，桂枝2-6份，菟丝子2-6份，丝瓜络2-6份。

进一步地，所述组合物包括以下组分：丹参7-9份，白芥子7-9份，黄芪5-7份，川芎5-7份，元胡5-7份，女贞子3-5份，鸡血藤3-5份，葛根3-5份，桂枝3-5份，菟丝子3-5份，丝瓜络3-5份。

更进一步地，所述组合物包括以下组分：丹参8份，白芥子8份，黄芪6份，川芎6份，元胡6份，女贞子4份，鸡血藤4份，葛根4份，桂枝4份，菟丝子4份，丝瓜络4份。

本发明采用的技术方案之二为：一种上述技术方案任一所述的中药组合物在制备治疗糖尿病周围神经病变的药物中的应用。

本发明采用的技术方案之三为：一种治疗糖尿病周围神经病变的中药制剂，包括上述技术方案任一所述的中药组合物和药学上可接受的辅料。

进一步地，所述剂型为散剂、颗粒剂、丸剂、片剂或胶囊剂。

本发明的有益效果：

本发明的方剂中以白芥子丹参为君药，白芥子性辛温，行气豁痰；丹参味苦、微寒,活血祛瘀,凉血消痈,养血安神,功擅通行血脉；两药配伍共为君药，活血化痰，针对糖尿病周围神经病变代谢记忆效应痰瘀伏邪病机。

以黄芪、川芎、元胡、女贞子、鸡血藤、葛根、菟丝子为臣，黄芪味甘、微温，补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水退肿；川芎性辛温，功能活血行气，祛风止痛；元胡性辛苦温，功能活血通络，行气止痛；女贞子性甘苦凉，功能滋补肝肾，乌须明目；鸡血藤性苦微甘温，功能活血调经、舒筋通络、养血补血；葛根甘、辛、凉,功效升阳解肌、生津解热、发表透疹,升阳止泻；菟丝子味辛、甘、平,补阳养阴、固精缩尿,明目止泻。

以桂枝味为佐，桂枝辛、甘、温,功能温经通阳、辛温解表。以丝瓜络为使，丝瓜络祛风通络活血。诸药配伍，共奏活血化痰，温经通络，益气养阴之效。

本申请的中药组合物通过对糖尿病周围神经病变“代谢记忆”效应进行干预；针对正气亏虚、脏腑功能失调之本治以补虚扶正，正气存内则邪不可干；同时去除伏匿于体内的痰瘀之邪，邪去则正安。通过有效清除各种损伤性因子，恢复周围神经区域微环境稳定，最终达到阻止“代谢记忆”效应，治疗糖尿病周围神经病变的目的。

另外，将本申请的中药组合物制备成散剂、颗粒剂、丸剂、片剂或胶囊剂等制剂后可以方便患者服用。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例的各组大鼠坐骨神经HE染色图；

图2是本发明实施例的各组大鼠坐骨神经纤维轴索染色图；

图3是本发明实施例的各组大鼠坐骨神经透射电子显微镜图；

图4是本发明实施例的各组大鼠氧化应激指标8-OHdG浓度检测图；

图5是本发明实施例的各组大鼠氧化应激指标GSH含量检测图；

图6是本发明实施例的各组大鼠氧化应激指标MDA浓度检测图；

图7是本发明实施例的神经组织TUNEL染色检测凋亡图；

图8是本发明实施例的神经神经组织免疫组化染色（Beclin-1）图；

图9是本发明实施例的神经组织bax mRNA表达图；

图10是本发明实施例的神经组织bcl-2 mRNA表达图；

图11是本发明实施例的神经组织Beclin-1mRNA表达图；

图12是本发明实施例的各组神经组织蛋白表达图；

图13是本发明实施例的各组细胞蛋白表达图；

图14是本发明实施例的各组细胞mfn1、mfn2、drp1蛋白表达图；

图15是本发明实施例的各组细胞P-JNK蛋白表达图；

图16是本发明实施例的各组细胞P-Akt蛋白表达图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种治疗糖尿病周围神经病变的中药组合物，所述组合物包括以下组分：丹参6g，白芥子10g，黄芪4g，川芎8g，元胡4g，女贞子6g，鸡血藤2g，葛根6g，桂枝2g，菟丝子6g，丝瓜络2g。

实施例2

一种治疗糖尿病周围神经病变的中药组合物，所述组合物包括以下组分：丹参10g，白芥子6g，黄芪8g，川芎4g，元胡8g，女贞子2g，鸡血藤6g，葛根2g，桂枝6g，菟丝子2g，丝瓜络6g。

实施例3

一种治疗糖尿病周围神经病变的中药组合物，所述组合物包括以下组分：丹参9g，白芥子7g，黄芪7g，川芎5g，元胡7g，女贞子3g，鸡血藤5g，葛根3g，桂枝5g，菟丝子3g，丝瓜络5g。

实施例4

一种治疗糖尿病周围神经病变的中药组合物，所述组合物包括以下组分：丹参7g，白芥子9g，黄芪5g，川芎7g，元胡5g，女贞子5g，鸡血藤3g，葛根5g，桂枝3g，菟丝子5g，丝瓜络3g。

实施例5

一种治疗糖尿病周围神经病变的中药组合物，所述组合物包括以下组分：丹参8g，白芥子8g，黄芪6g，川芎6g，元胡6g，女贞子4g，鸡血藤4g，葛根4g，桂枝4g，菟丝子4g，丝瓜络4g。

实施例6

实施例1-5的中药组合物可以直接煎服，也可以加入药学上可接受的辅料，如矫味剂、粘合剂、溶剂、润滑剂等制备成散剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂。

（一）临床实验

实验地点：西安交通大学第一附属医院

1临床研究方案

1.1 临床资料

2012年12月～2018年7月在西安交通大学第一附属医院就诊的糖尿病周围神经患者112例,均符合1999年WHO关于2型糖尿病的诊断标准,且神经电生理检测明确周围神经损害, 并排除其他原因所致的周围神经病变。采用随机平行对照试验方法，按分层随机方法分组(即入选患者按性别、年龄、病程分层)，同层内的患者以随机数字表法分为实验组和对照组，每组各56例。实验组男31例，女25例，年龄32～72岁,平均(60.15±8.67)岁；糖尿病病程(9.38±6.92)年；糖尿病周围神经病变病程(3.69±1.12)年；合并糖尿病视网膜病变32例；合并糖尿病肾病16例；口服降糖药治疗者32例；胰岛素治疗者21例；单用中药治疗者3例；空腹血糖(7.56±1.72)mmol/L；餐后2h血糖(9.89±1.84)mmol/L。对照组男30例，女26例；年龄(60.94±9.12)岁；糖尿病病程(9.03±7.01)年；糖尿病神经病变病程(3.54±1.42)年；合并糖尿病视网膜病变30例；合并糖尿病肾病15例；口服降糖药治疗者34例; 胰岛素治疗者20例；单用中药治疗者2例；空腹血糖为(7.48±1.66)mmol/L；餐后2h血糖(9.48±1.77)mmol/L。两组治疗前均衡性检验差别无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准和纳入标准

2型糖尿病诊断依据1999年世界卫生组织(WHO)诊断标准。糖尿病周围神经病变包括感觉、运动和植物神经病变。根据神经电生理检测判断有以下情况之一者：(1)神经传导速度(nerve conduction velocity，NCV) 异常(包括运动神经传导速度 motorconduction velocity，MCV；感觉神经传导速度 sensory conduction velocity，SCV)；(2)交感神经皮肤反应(sympatheitc skin response，SSR)异常；(3)传导速度分布(conduction velocity distribu- tion，CVD)异常。

符合上述诊断标准，并将知情同意者纳入这次临床实验病历。

1.3排除标准

(1)1个月内患有糖尿病急性并发症者；(2)有脊髓损伤、脊柱畸形或脑血管病后遗症、神经肌肉接头或肌肉疾病者以及因遗传性、中毒性、免疫性、外伤性及其他神经疾病所致的周围神经病变者；(3)有癫痫或精神病史者；(4)合并其他系统严重原发性疾病、肝肾功能异常、严重感染或晚期肿瘤患者；(5)嗜酒者，在过去5年内有吸毒或其他精神性药物滥用史者，有毒物或化学物质接触者。

1.4治疗方法

治疗开始前患者停用除降糖、降压药以外的一切中、西药物4周，治疗前至少1个月血糖水平稳定。采用随机给药。两组疗程均为6个月，并随时记录复查前后患者饮食、起居及病情变化。实验期间及时记录患者的用药情况和不良反应。(1)实验组：给予本申请实施例制备的中药制剂颗粒，每日服用2次。(2)对照组：给予弥可保即甲钴胺片(甲基维生素B12)，卫材(中国)药业有限公司生产，批准文号：H20030812，规格为每片500μg，每次500μg，每日3次服用。

1.5观察指标

(1)一般指标：包括血脂，血糖，肝、肾功能和血、尿常规及(中医) 临床症状。

(2)神经症状、体征评分：按照《密西根糖尿病神经病评分》( MDNS)标准，并加入《密西根神经病变筛查量表》中有关足部外观的评分标准进行，具体如下：

①周围神经症状：包括运动、感觉、自主神经症状。

运动：肌肉无力(肩带肌上肢近端、手、髋部及下肢)；

感觉：感觉异常(包括麻木、烧灼、蚁走感、冷感、皮肤瘙痒等)、疼痛等；

自主神经：位置性头晕、阳痿、排尿障碍、便秘腹泻交替、出汗异常等。

评分标准：无症状=0；轻度=1(症状轻微，对工作、日常生活及睡眠无明显影响)；中度= 2(症状较重，对工作和生活有不同程度的影响，偶尔需要对症治疗，但不影响睡眠)；重度=3(症状严重，影响睡眠和工作，需要对症治疗)。

②周围神经体征：包括肌力、深浅感觉、跟膝腱反射、下肢营养及外观。

评分标准:

肌力：正常=0，轻度减退= 1(Ⅳ～Ⅴ)；

跟腱反射：正常=0，减低=1，消失=2；膝和跟腱反射均减退或消失= 3；

深浅感觉：正常=0，踝以下异常(减退或过敏)=1，踝以下消失=2，膝以下减退或消失=3；

下肢营养及外观包括皮肤(干燥、脱屑)、足部检查(溃疡、畸形、胼胝等)、足背动脉搏动情况等，正常=0，异常=1。

(3)神经电生理检测：采用美国Nicolet公司生产的Viking Select 4.0诱发电位、肌电图仪。主要测定参数包括：

①交感神经皮肤反应(SSR)：测定正中神经、胫神经SSR起始潜伏期和波幅。

②运动神经传导速度分布(CVD)：测定正中神经、尺神经、腓总神经各自不同速度级别神经纤维的传导速度，分别以CV10%、CV50%、CV90%表示各神经束中传导速度慢速、中速和快速纤维的速度值。

③神经传导速度(NCV)：测定正中神经、尺神经、胫神经、腓总神经运动传导速度(MCV)和运动末端潜伏期(DML)、波幅(Amp)；测定正中神经、尺神经指5、胫神经、腓总神经感觉传导速度(SCV)和感觉动作电位潜伏期(Lat)及波幅(Amp)。

（4）中医证候评分判定标准：根据《中药新药临床研究指导原则》中的“中药新药治疗糖尿病的临床研究指导原则”推荐的中医证候评定标准，分为：

①临床基本控制：疗效指数≥85%；

②显效：66%≤疗效指数＜85%；

③有效：33%≤疗效指数＜66%；

④无效:疗效指数＜33%；

⑤恶化:疗效指数＜－33%。

2 临床研究结果

2.1一般指标的变化

临床研究期间，两组患者血糖控制稳定，实验组和对照组平均空腹血糖(FBG)分别维持在(130±27)mg/dL、(128±26)Mg/dL；餐后2h血糖(2hPBG) 分别为(176±28mg/dL、(171±30)mg/dL，差异无统计学意义(P＞0.05)。治疗前实验组TC、TG、LDL均明显高于对照组(P＜0.05)。治疗前后实验组TC、TG、HDL有所降低(P＞0.05)；对照组TC、TG、HDL、LDL均较治疗前增高(P＜0.01)；结果见表1。肝、肾功能( ALT、AST、BUN、Cr) 和血、尿常规均在正常范围内，未发现异常改变(P＞0.05)。

表1 治疗前后患者血症比较

2.2神经症状变化

（1）运动和感觉神经症状：按照MDNS评分结果，治疗后两组患者肌肉无力、感觉异常及肢体疼痛等症状均有明显改善(P＜0.05)。实验组对肌肉无力、感觉异常症状效果较明显，对照组对感觉异常及肢体疼痛症状效果较好，两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

（2）自主神经功能损害症状：治疗前两组各种自主神经功能损害症状总阳性率高达94.6%，治疗后患者症状均有所改善，实验组位置性头晕和腹泻便秘等症状改善明显，对照组出汗异常症状改善明显，两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

（3）周围神经体征：实验组和对照组的药物对周围神经体征的总体改善率接近，实验组改善率为52.1%，对照组为49.6%，两组间比较无明显统计学差异(P＞0.05)。

2.3 神经功能评分：治疗前后两组的神经功能评分总分和运动感觉症状评分、自主神经症状评分均较治疗前显著下降(P＜0.05)，体征评分虽然有所下降，但差异无统计学意义(P＞0.05)。两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，结果见表2.

表2 两组神经功能评分及症状、体征评分的比较

2.4 SSR 检测结果

治疗前实验组SSR异常52例(93.1% )，其中,17例未引出波形，治疗后11例转为正常，6例治疗前未引出波形者治疗后引出波形。对照组治疗前异常49例(87.5%)，其中，19例未引出波形，治疗后有8例转为正常，11例治疗前未引出波形者治疗后引出波形。两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。比较可引出波形患者治疗前后的SSR参数，结果显示治疗后实验组的上肢波幅增高，对照组的下肢波幅降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，剩余参数差异无统计学意义(P＞0.05)，结果见表 3。

表3 治疗前后两组SSR潜伏期和波幅的比较

2.5 NCV 检测结果

治疗前实验组MCV异常者39例(69.6%)，SCV异常者32例(57.1%)；对照组MCV异常者36例(64.3%)，SCV异常者33例(58.9%)。治疗后实验组MCV好转15例，SCV好转11例；对照组MCV好转9例，SCV好转7例。两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。进一步NCV检测各参数，结果显示:治疗后两组尺神经运动动作电位波幅均较治疗前明显增高，且对照组尺腓总神经感觉传导速度SCV明显增快(P＜0.05)，结果见表4-7。

表4治疗前后两组运动神经传导速度比较

表5治疗前后两组运动末端潜伏期和波幅比较

表6 治疗前后两组感觉神经传导速度比较

表7 治疗前后两组感觉神经末端波幅比较

2.6中医证候评分的变化

实验组显效3例(5.4%)、有效20例(35.7%)、无效33例(58.9%)，总有效率为41.1%；对照组有效22例(39.3%)，无效35例(60.7%)，总有效率为39.3%。总有效率实验组与对照组接近，组间差异无统计学意义(P＞0.05)。治疗后两组患者中医症状总分均明显下降(P＜0.01)，分别由17.±5.2、16.9±5.1降至11.8±5.0、13.1±4.7。对各种(中医)临床症状作进一步分析显示：实验组除视物模糊未见变化外，其他症状均较治疗前有所改善，其中神疲、腰膝酸软、肢体麻痛及二便障碍等症状改善率≥50% ; 对照组的自汗症状较治疗前好转，改善率≥50%。组间比较，失眠多梦症状实验组改善程度优于对照组(P＜0.05)。结果见表8和9。

表8 治疗前后两组中医临床症状的改善情况

表8 治疗前后两组中医临床症状的改善情况

（二）动物实验

1.实验过程

1.1糖尿病周围神经病变代谢记忆模型的建立及分组

①实验动物：3月龄空腹血糖≥11.1mmol/L的SPF级雄性自发性2型糖尿病GK大鼠105只（由中国科学院上海实验动物中心提供），2-3只/笼饲养于恒温、恒湿的屏障设施内；室内照明为人工模拟，12h明暗交替；室内换气次数为20次/h。适应性喂养1周后，受试动物饲喂60Co辐照的高糖高脂饲料。实验周期为16周。

②动物造模及实验分组：所有GK大鼠按随机血糖由高到低排列编号，随机分为7组，糖尿病Ⅰ组，糖尿病Ⅱ组，代谢记忆组，中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、西药组，每组15只大鼠。

糖尿病Ⅰ组为血糖良好控制组:每日注射长效胰岛素6-8单位，使大鼠血糖保持在150mg/dL以下。

糖尿病Ⅱ组为血糖控制不良组:常规饲养，保证大鼠存活，不给予胰岛素。

代谢记忆组：后8周每日注射长效胰岛素6-8单位，使大鼠血糖保持在150mg/dL以下。

中药高剂量组：实验期间以相当于成人剂量20倍给药，后8周每日注射长效胰岛素6-8单位。

中药中剂量组：实验期间以相当于成人剂量10倍给药，后8周每日注射长效胰岛素6-8单位。

中药低剂量组：实验期间以相当于成人剂量5倍给药，后8周每日注射长效胰岛素6-8单位。

西药组：实验期间以相当于成人剂量10倍α-硫辛酸（0.1g/kg·d）给药，后8周每日注射长效胰岛素6-8单位。另设3月龄雄性正常Wistar大鼠15只作为正常对照组。

③治疗方法：实验高、中、低剂量组均灌胃本发明实施例制备的中药组合物。给药方式及剂量见表10。

表10 动物实验不同药物的给药方式及剂量

1.2 实验取材

大鼠处死前留尿，腹主动脉取血，分离血清-80oC保存。大鼠经10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉后，切取双侧坐骨神经，进行后续检测。

1.3观察指标及测定方法

①一般指标：每日观察大鼠毛色、神态、摄食、饮水、行为等。每周监测大鼠体重及血糖，处死前采用YSD-4药理生理多用仪测定大鼠坐骨神经传导速度。

②氧化应激指标测定：HPLC法检测各组大鼠尿液中8-OHDG含量变化，比色法检测血清GSH、MDA含量。

③大鼠神经组织学检测：HE染色分析脊髓背根神经及坐骨神经病理学改变，Bielschowsky氏改良法及Luxol fast blue中性红分别进行周围神经组织轴索及髓鞘染色。

④神经病理超微结构观察：2.5％戊二醛前固定，1％锇酸后固定，脱水，浸透，包埋、聚合、固化，超薄切片，染色后透射电子显微镜观察有髓神经纤维轴索、髓鞘、雪旺细胞；无髓神经纤维；成纤维细胞；血管等结构变化。

⑤Tunel法检测神经组织凋亡：取坐骨神经组织石蜡切片，按Tunel试剂盒使用说明处理，DAB显色，镜下观察，出现棕黄色颗粒后立即加入蒸馏水终止反应。封片干燥后在光学显微镜下观察。细胞核呈深棕黄色圆形或椭圆形颗粒者为阳性。计算出每张图片凋亡的百分率。

⑥检测神经组织mRNA表达：Trizol抽提神经组织RNA，逆转录生成cDNA，根据目的基因及扩增条件进行PCR扩增。计算各组目的基因Ct值和相应GAPDH Ct值的差值(ΔCt)，以2–ΔΔCt计算目的基因与GAPDH的相对表达量。

⑦神经组织免疫组化检测：包埋的神经组织切片，过氧化氢灭活内源性过氧化物酶后山羊血清孵育阻断非特异性结合，分别用单抗孵育，生物素标记的二抗孵育，ABC试剂盒显色。计算机病理图像分析系统进行结果分析，得出阳性显色面积/总面积的百分比等指标。

⑧检测神经组织中相关信号转导通路蛋白表达：抽提神经组织蛋白质， SDS-PADE凝胶电泳后电转至PVDF膜上,室温封闭后加入不同浓度一抗过夜，HRP标记的二抗孵育后ECL显色，曝光显影，Image Tool软件根据杂交条带的光密度值分析相关信号转导通路蛋白表达。

2.实验结果

2.1大鼠一般情况观察

正常组大鼠精神状态良好，进食和饮水量以及尿量都正常，体重增加，动作自如。而糖尿病组大鼠出现明显的多饮、多食、多尿，大鼠神态萎靡，毛竖无光泽，不同程度白内障，耳廓、尾巴苍白湿冷，下腹部鼓胀，倦卧弓背，活动少。中药组合物治疗组及硫辛酸组大鼠的状态均好于糖尿病组大鼠。

2.2各组大鼠血糖变化

各组大鼠血糖情况如表11所示。

表11 各组大鼠不同时间点血糖

各组大鼠生化指标检测情况如表12所示。

表12 各组大鼠生化指标变化

2.3各组大鼠坐骨神经形态变化

HE染色（见图1）：横切面可见正常组大鼠坐骨神经有髓神经纤维被染为紫红色（图中的灰色部分），形态正常，呈圆形或椭圆形，排列整齐。纤维中央深染区域为轴索，轴索外包绕有髓鞘，结构完整清晰，髓鞘边缘可见蓝色的雪旺细胞核。纵向切片可见轴索为深红色线状结构，髓鞘呈紫红色网状结构。间质淡染，同时可见少量血管。糖尿病及代谢记忆组大鼠坐骨神经有髓神经纤维排列紊乱，轴索肿胀或皱缩，髓鞘密度不均匀，空泡样改变，部分神经纤维髓鞘脱失。各治疗组HE染色病变情况较代谢记忆组减轻。

神经纤维轴索染色（见图2）：正常组大鼠坐骨神经纤维形态饱满正常，排列紧密整齐，轴索结构清晰，分布均匀。糖尿病及代谢记忆组大鼠坐骨神经纤维排列紊乱，神经纤维变细，密度下降。部分轴索肿胀，空泡变性，染色变淡；部分轴索皱缩，被变性的髓鞘挤压，形态不规则，甚至消失。纵向切片上可见到部分轴索形态不规则，粗细不均。各治疗组轴索染色病变情况较代谢记忆组减轻。

透射电子显微镜观察（见图3）：与正常组相比，糖尿病组大鼠坐骨神经组织有髓神经分布稀疏、轴索肿胀或皱缩、线粒体肿胀变性、糖原物质沉积，髓鞘密度不均、板层分离、溶解脱失，雪旺细胞线粒体肿胀、内质网扩张、细胞核形状不规则、自噬体少见，无髓神经纤维肿胀、细胞器异常，血管内皮细胞基底膜明显增厚突起、内缘粗糙。各治疗组电镜下病变情况较代谢记忆组减轻。

ELISA试剂盒法检测各组大鼠尿液中8-OHDG含量变化，比色法检测血清GSH、MDA含量变化，具体结果见图4-6。结果显示与正常组相比，糖尿病及代谢记忆组大鼠8-OHDG含量明显增高（P＜0.05），血清MDA含量明显增高（P＜0.05），血清GSH含量明显降低（P＜0.05）。各治疗组8-OHDG及血清MDA含量较糖尿病代谢记忆组明显降低（P＜0.05），血清GSH含量较糖尿病代谢记忆组明显增高（P＜0.05）。

如图7所示，其中为A正常组、B为糖尿病Ι组、C为糖尿病Ⅱ组、D为代谢记忆组、E为中药高剂量组、F为中药中剂量组、G为中药低剂量组、H为硫辛酸组；与正常组相比，糖尿病及代谢记忆组大鼠坐骨神经组织凋亡明显增高（P＜0.05），各治疗组坐骨神经凋亡较糖尿病代谢记忆组明显降低（P＜0.05）。

2.4神经组织免疫组化检测

如图8所示，其中为A正常组、B为糖尿病Ι组、C为糖尿病Ⅱ组、D为代谢记忆组、E为中药高剂量组、F为中药中剂量组、G为中药低剂量组、H为硫辛酸组；与正常组相比，糖尿病及代谢记忆组大鼠坐骨神经Beclin-1蛋白表达水平明显增高（P＜0.05），各治疗组坐骨神经Beclin-1蛋白表达较糖尿病代谢记忆组明显降低（P＜0.05）。

2.5神经组织mRNA表达

如图9-11所示，与正常组相比，糖尿病及代谢记忆组大鼠坐骨神经bax mRNA表达水平明显增高（P＜0.05），Beclin-1mRNA、bcl-2 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）。各治疗组坐骨神经bax mRNA表达水平较糖尿病代谢记忆组明显降低（P＜0.05），Beclin-1mRNA、bcl-2 mRNA表达水平较糖尿病代谢记忆组增高（P＜0.05）。

神经组织相关蛋白表达：如图12所示，其中为A正常组、B为糖尿病Ι组、C为糖尿病Ⅱ组、D为代谢记忆组、E为中药高剂量组、F为中药中剂量组、G为中药低剂量组、H为硫辛酸组；与正常组相比，糖尿病及代谢记忆组大鼠坐骨神经Fisl-1、NLRP3、NF-KB、TLR-4、bax、LC3B表达水平增高（P＜0.05），bcl-2、Beclin-1表达水平明显降低（P＜0.05）。各治疗组Fisl-1、NLRP3、NF-KB、TLR-4、bax、LC3B表达水平较糖尿病代谢记忆组明显降低（P＜0.05），bcl-2、Beclin-1表达水平较糖尿病代谢记忆组明显增高（P＜0.05）。

（二）细胞实验

1.实验过程

1.1大鼠雪旺细胞的分离培养和鉴定

脱颈处死出生3-5天的Wistar乳鼠，75%酒精浸泡消毒后切取双侧坐骨神经，解剖显微镜下仔细剥离神经外膜，尽可能去除束膜，眼科剪将神经组织充分剪碎至0.5～1.0mm²，组织贴块法培养，24 h换液，3-5d传代1次。差速贴壁法、低浓度胰蛋白酶消化法及G418进行雪旺细胞纯化，S-100蛋白进行雪旺细胞免疫组织化学鉴定。

1.2中药含药血清制备

雄性Wistar大鼠60只饲养于SPF级环境，适应性喂养3天后随机分为空白组30只、实验组30只。实验组按25g/（kg·d）灌胃本申请实施例制备的中药组合物，（相当于成人剂量10倍），空白组给予等体积蒸馈水。每日灌胃2次，连续3天。于末次灌胃后1h内颈动脉取血，离心取血清、灭活，0.22μm滤器过滤除菌，－20℃冰箱冻存。

1.3实验分组

前期工作已经证实，50mmol/L葡萄糖是模拟高糖对雪旺细胞损伤的最佳浓度，本研究将在此基础上完成下一步工作，并以96h为干预时间点。分为正常组（5.6mmol/L葡萄糖）；高糖组（50mmol/L葡萄糖）；代谢记忆组（50mmol/L葡萄糖培养48小时后换用5.6mmol/L葡萄糖培养）；中药低剂量组（50mmol/L葡萄糖培养48小时后换用5.6mmol/L葡萄糖培养，加入中药组合物含药血清与空白血清按1∶2比例配置的20%大鼠血清）；中药中剂量组（50mmol/L葡萄糖培养48小时后换用5.6mmol/L葡萄糖培养，加入中药组合物含药血清与空白血清按1∶1比例配置的20%大鼠血清）；中药高剂量组（50mmol/L葡萄糖培养48小时后换用5.6mmol/L葡萄糖培养，加入20%中药组合物含药血清）。

1.4 观察指标及测定方法

①ROS的检测：使用DCFH-DA及DHE荧光探针通过流式细胞仪进行检测。流式细胞仪激发波488nm，发射波525nm和590nm分别检测荧光强度。

②检测8-OHDG含量：提取细胞DNA，95oC变性，核酸酶P1消化，碱性磷酸酶孵育获得单核苷酸。将待测样本或不同浓度的标准品加入微量滴定板中，4oC孵育。加入显色剂摇床避光显色，测量酶标仪405nm波长处光密度。根据标本的OD值在标准曲线上换算出8-OHDG相应的浓度。

③线粒体膜电位的检测：使用JC-1荧光探针通过流式细胞仪进行检测。流式细胞仪激发波490nm，发射波530nm和激发波525nm，发射波590nm分别检测红绿荧光强度，以红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。

④细胞凋亡检测：细胞接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片中，4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX-100孵育。滴加Tunel反应液，封片后荧光倒置显微镜下观察、拍照。凋亡细胞的细胞核表现为绿色荧光。然后滴加POD转换剂，湿盒孵育后加DAB显色剂，镜下观察，出现棕黄色颗粒后立即加入蒸馏水终止反应。封片干燥后光学显微镜下观察。细胞核呈深棕黄色圆形或椭圆形颗粒者为阳性。计数图片中所有的细胞数量和凋亡的细胞数量，算出每张图片凋亡的百分率。

⑤检测8-OHDG含量：提取细胞DNA，95oC变性，核酸酶P1消化，碱性磷酸酶孵育获得单核苷酸。将待测样本或不同浓度的标准品加入微量滴定板中，4oC孵育。加入显色剂摇床避光显色，测量酶标仪405nm波长处光密度。根据标本的OD值在标准曲线上换算出8-OHDG相应的浓度。

⑥ELISA法对细胞培养上清中MDA含量、SOD活性测定，收集各组细胞培养液，离心后取上清，按照试剂盒说明书进行MDA含量、SOD活性检测。

⑦检测神经组织中相关蛋白表达：提取各组细胞蛋白质，SDS-PADE凝胶电泳后电转至PVDF膜上,室温封闭后加入不同浓度一抗过夜，HRP标记的二抗孵育后ECL显色，曝光显影，Image Tool软件根据杂交条带的光密度值分析相关蛋白表达及转位情况。

1.5数据分析

结果以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS13.0统计软件。正态分布数据采用t检验；非正态分布数据采用秩和检验；率的比较采用χ²检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.实验结果

2.1各组培养液中MDA、8-OHDG含量及SOD活性变化

如表13所示，与正常对照组相比，高糖组及代谢记忆组细胞MDA、8-OHDG含量明显增高（P<0.01），SOD活性明显降低（P<0.01）。各治疗组雪旺细胞培养液中MDA、8-OHDG含量较高糖组明显下降（P<0.01，P<0.05），而SOD活性明显增高（P<0.01，P<0.05）。

表13 各组细胞MDA、8-OHDG及SOD水平变化

注：与正常组比较，* P<0.05，** P<0.01；与高糖组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与代谢性记忆组比较，▲* P<0.05，▲▲P<0.01。

2.2各组细胞内活性氧水平变化

表14中，与对照组相比高糖组及代谢记忆组细胞内活性氧水平明显增高（P<0.01），采用本发明的中药组合物干预后，雪旺细胞内活性氧水平呈剂量依赖性下降（P<0.01，P<0.05）。

2.3各组细胞线粒体膜电位（MMP）变化

与正常对照组相比，高糖组及代谢记忆组雪旺细胞MMP明显降低（P<0.01）。不同浓度中药干预组雪旺细胞MMP明显增高（P<0.05，P <0.01），见表14。

2.4各组细胞凋亡率比较

表14中，与对照组相比高糖组及代谢记忆组细胞凋亡率明显增高（P<0.01），中药干预组雪旺细胞凋亡率呈剂量依赖性下降（P<0.01）。

表14 各组细胞凋亡率、MMP、活性氧水平变化

注：与正常组比较，* P<0.05，** P<0.01；与高糖组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与代谢性记忆组比较，▲* P<0.05，▲▲P<0.01。

2.5各组雪旺细胞相关蛋白表达

如图13-16所示，与正常组相比，高糖组及代谢记忆雪旺细胞PARP、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-9、Drp1、mTOR、bax、p-JNK、LC3B表达水平增高（P＜0.05），P-Akt、mfn1、mfn2、bcl-2、Beclin-1表达水平明显降低（P＜0.05）。各治疗组PARP、cleaved-caspase-9、Drp1、mTOR、cleaved-caspase-9、bax、p-JNK、LC3B表达水平较糖尿病代谢记忆组明显降低（P＜0.05），P-Akt、mfn1、mfn2、bcl-2、Beclin-1表达水平较糖尿病代谢记忆组明显增高（P＜0.05）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种治疗糖尿病周围神经病变的中药组合物，其特征在于，所述组合物由以下组分制成：丹参6-10份，白芥子6-10份，黄芪4-8份，川芎4-8份，元胡4-8份，女贞子2-6份，鸡血藤2-6份，葛根2-6份，桂枝2-6份，菟丝子2-6份，丝瓜络2-6份。

2.根据权利要求1所述治疗糖尿病周围神经病变的中药组合物，其特征在于，所述组合物由以下组分制成：丹参7-9份，白芥子7-9份，黄芪5-7份，川芎5-7份，元胡5-7份，女贞子3-5份，鸡血藤3-5份，葛根3-5份，桂枝3-5份，菟丝子3-5份，丝瓜络3-5份。

3.根据权利要求1所述治疗糖尿病周围神经病变的中药组合物，其特征在于，所述组合物由以下组分制成：丹参8份，白芥子8份，黄芪6份，川芎6份，元胡6份，女贞子4份，鸡血藤4份，葛根4份，桂枝4份，菟丝子4份，丝瓜络4份。

4.一种权利要求1-3任一所述的中药组合物在制备治疗糖尿病周围神经病变的药物中的应用。

5.一种治疗糖尿病周围神经病变的中药制剂，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的中药组合物和药学上可接受的辅料。

6.根据权要求5所述的中药制剂，其特征在于，所述剂型为散剂、颗粒剂、丸剂、片剂或胶囊剂。

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