CN111657499A - 聚球藻源富锌纳米多聚磷酸体补锌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚球藻源富锌纳米多聚磷酸体（PPB‑Zn）补锌剂及其制备方法，其制备方法，包括下列步骤：采用锌强化medium A培养基（硫酸锌浓度为10‑25 mg/L）培养聚球藻至对数后期，收集藻体，现用或冷冻保藏；将藻体置于沸水中抽提5‑30 min，离心后取上清，获得藻体水提物；将藻体水提物进行葡聚糖凝胶（Sephadex G50/G75/G100/G150）柱层析，收集排阻峰组分；对排阻峰组分进行超滤（截留分子量3‑10 KDa）浓缩后，冻干，即得PPB‑Zn样品。本发明中PPB‑Zn是粒径约为10‑30 nm的不规则形状微粒，在小鼠体外结扎肠段中能够以内吞作用的方式被高效吸收和转运，在大鼠口服药物代谢动力学和急性吸收模型中也表现出良好的生物可利用性，特别在对抗植酸对锌吸收的抑制作用方面有很好的效果，故PPB‑Zn是一种较为理想的微藻源补锌剂，可应用于素食习惯导致的锌缺乏人群的营养强化和营养补充。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚球藻源富锌纳米多聚磷酸体（PPB-Zn）补锌剂的制备方法及其用途。
背景技术
迄今为止，全球锌缺乏的流行率仍然高居不下，因此，锌营养补充剂和强化剂的开发一直备受人们关注。目前市场上以溶解性较好的无机或有机锌盐类补锌剂为主，在面对复杂的食物环境（如存在植酸抑制剂）时吸收效果会大打折扣，且会在一定程度上改变食品的感官品质（如带来金属味或苦涩味）和营养价值（如引起蛋白絮凝和脂肪的氧化等），这是限制锌营养干预推广和有效性的一个重要原因。纳米锌具有良好的“溶解性”（即能够形成稳定的胶体溶液），且相对于离子锌而言，不易与食品成分发生化学反应，较为耐受植酸等抑制剂对吸收的不利影响，故纳米锌是一类较为理想的补锌剂。
生物矿化一般以大分子聚合物为“软模板”，在温和条件下合成矿物质纳米微粒，大分子聚合物所提供的空间位阻或电荷还使得矿物质纳米微粒具有更好的胶体稳定性，故生物矿化非常适合于纳米矿物质营养补充剂或强化剂的生产。多聚磷酸盐是一种无毒的大分子聚合物，在肉制品加工中常作为保水剂使用，在自来水处理中作为作絮凝剂使用。多聚磷酸盐在生物细胞中由多聚磷酸盐激酶催化合成，常以一种纳米或亚微米尺度（15-200nm）的包涵体——多聚磷酸体（PPB）的形态存在于细胞中。PPB中的阳离子种类通常以钙和镁为主，但当生物细胞生存环境中存在较高浓度的锌时，亦可大量富集锌。因此，PPB作为矿物质营养元素锌的载体，具有开发成为一种天然纳米锌营养补充剂或强化剂的潜力，但目前国内外还没有相关的研究报道。
聚球藻7002是一种单细胞海洋蓝细菌，有多种适用于生物技术和食品工业应用的优良特征，例如，能够以多种方式（包括光合自养、异养和混合培养）进行生长，具有广盐性和耐高光性，倍增时间非常短（< 4 h），未被发现分泌任何蓝藻毒素或具有相关的同源基因，利用廉价海水作为培养基的光合发酵不侵占耕地、粮食、淡水和化石能源等。PPB在聚球藻7002中以纳米颗粒的形态存在。因此，聚球藻7002是一种理想的生产新型纳米PPB矿物质营养补充剂或强化剂的细胞工厂。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的聚球藻源PPB-Zn补锌剂及其制备方法。
本发明所要解决的技术问题是：利用聚球藻7002制备一种纳米锌补锌剂，成分为PPB-Zn。
实现本发明目的采取的技术方案如下：
采用锌强化medium A培养基培养聚球藻7002至对数后期，收集藻体；通过热水抽提得到藻体水提物，并利用葡聚糖凝胶柱层析对其进行分离，收集排阻峰组分；对排阻峰组分进行超滤浓缩后，冻干，即得PPB-Zn样品。
聚球藻源PPB-Zn补锌剂的制备方法，具体包括下列步骤：
（1）采用锌强化medium A培养基（硫酸锌浓度为10-25 mg/L）培养聚球藻，至对数后期时采收藻体。
（2）通过热水抽提法获得藻体水提物，即将藻体置于沸水中抽提5-30 min，冷却至室温，离心后收集上清即为藻体水提物。
（3）使用葡聚糖凝胶柱层析（Sephadex G50/G75/G100/G150）对藻体水提物进行分离，收集排阻峰组分；
（4）对步骤（3）排阻峰组分进行超滤浓缩后，冻干，即得PPB-Zn样品。
优选的，本发明步骤（1）锌强化medium A培养基中硫酸锌浓度为16.65 mg/L，培养至对数后期时，聚球藻生物量和PPB-Zn产量为最佳水平。
进一步的，本发明步骤（2）的热水抽提时间最佳范围为10-15 min。时间较短，对PPB提取不够充分；时间太长，会一定程度上破坏其多聚磷酸盐长链结构，降低PPB-Zn的得率。
进一步的，本发明步骤（3）的葡聚糖凝胶最佳规格型号为Sephadex G100。Sephadex G50/G75去除小分子杂质的效果略差，Sephadex G150的实验效率略低。
优选的，本发明步骤（4）的超滤膜截留分子量范围为3-10 KDa。截留分子量小于3KDa的超滤膜，浓缩效率较低；截留分子量大于10 KDa的超滤膜，会有部分粒径较小的PPB穿过，降低PPB-Zn的得率。
本发明的有益效果：
本发明中PPB-Zn是粒径约为10-30 nm 的不规则形状微粒，在小鼠体外结扎肠段中能够以内吞作用的方式被高效吸收和转运，在大鼠口服药物代谢动力学和急性吸收模型中也表现出良好的生物可利用性，特别在对抗植酸方面有很好的效果，故PPB-Zn是一种较为理想的微藻源补锌剂，可应用于素食习惯导致的锌缺乏人群的营养强化和营养补充。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式和有益效果作进一步详细的说明。
图1 PPB-Zn的结构表征。a）动态光散射计数率；b）多分散指数；c）水合粒径分布；d）Zeta电位；e）透射电镜图；f）高分辨透射电镜图；g）扫描电镜图。
图2 流式细胞法测定Zinquin标记的Caco-2细胞单层对PPB-Zn的吸收效果。
图3 体外结扎小鼠肠段对PPB-Zn的吸收转运效果。a）PPB-Zn在体外结扎小鼠肠段中跨膜转运的效果；b）内吞抑制剂对PPB-Zn在体外结扎小鼠肠段中跨膜转运的影响。星号表示差异与PPB-Zn对照相比有统计学意义(** P < 0.01，* P < 0.05)。注：2-APB：2-氨基乙基二苯硼酸盐。
图4 口服不同种类锌源的大鼠药代动力学曲线。
图5 口服不同种类锌源在大鼠体内24 h后的急性吸收实验。a）血清锌含量；b）肌肉锌含量；c）肝脏锌含量；d）肺脏锌含量。不同上标字母表示差异有统计学意义(P <0.05)。
具体实施方式
实施例1本实施例提供一种基于聚球藻源纳米多聚磷酸体的补锌剂及其制备过程。
具体技术方案步骤如下：
（1）采用锌强化medium A培养基（硫酸锌浓度为16.65 mg/L）培养聚球藻，至对数后期时采收藻体。
（2）通过热水抽提法获得藻体水提物，即将藻体置于沸水中抽提10 min，冷却至室温，离心后收集上清即为藻体水提物。
（3）使用Sephadex G100葡聚糖凝胶柱层析对藻体水提物进行分离，收集排阻峰组分。
（4）对步骤（3）排阻峰组分进行超滤（截留分子量3 KDa）浓缩后，冻干，即得PPB-Zn样品。
实施例2 实施例1制备的聚球藻源纳米锌补锌剂的实验结果
本实施例的相关实验是以实施例1中聚球藻源PPB-Zn补锌剂为基础进行的。具体为：
（一） PPB-Zn的结构表征，具体实验过程和实验结论如下：
图1中，a）是动态光散射计数率；b）是多分散指数；c）是水合粒径分布；d）是Zeta电位；e）是透射电镜图；f）是高分辨透射电镜图；g）是扫描电镜图。
动态光散射的分析使用激光粒度分析仪(Malvern Nano ZS)，633 nm He-Ne激光器，在25±0.1 ℃下，恒定散射角为90°。结果显示，PPB-Zn浓缩液具有明显的散射光信号（见图1a）、相对较小的多分散指数（见图1b）和较稳定的电位分布（-36.2 ± 0.5，见图1d）。水合粒径分布显示，PPB-Zn的粒径多集中在20 nm左右处（见图1c）。将PPB-Zn溶液滴加到碳涂层铜网上，风干，然后使用JEM-2100Plus透射电镜设备在200 kV下进行观察发现，它们是大约10-30 nm不规则形状的单分散纳米团簇（见图1e）。高分辨透射电镜图片显示，PPB-Zn纳米微粒存在晶格结构（见图1f），表明锌的富集可能使纳米PPB发生了结晶。对PPB-Zn粉末进行喷金处理，并使用TESCAN VEGA3设备在20 kV下进行检查，整个区域的扫描电镜图像显示这些纳米粒子为不规则形貌（见图1g）。
（二）流式细胞法测定Zinquin标记的Caco-2细胞单层对PPB-Zn的吸收效果，具体实验过程和实验结论如下：
结果见图2。人结肠癌细胞系Caco-2来自上海的中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；在37 ℃、5% CO2和恒定湿度条件下，分别使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-链霉素的DMEM完全培养基将Caco-2培养于25 cm2或者75 cm2的细胞培养瓶，每隔2 d更换培养基一次，当细胞的融合度达到80%左右时，根据实验需要按一定比例进行传代。实验中使用的Caco-2细胞代数为55至65。新传代的细胞以1×106 个细胞密度接种到培养皿25 cm2或者75cm2的细胞培养瓶中，每隔2 d更换培养基一次，培养21 d后，通过在DMEM完全培养基中，用10 μM N, N, N’, N’-四（2-吡啶基甲基）-乙二胺处理2 h，使极化的Caco-2单层细胞中游离锌耗尽，然后在黑暗中用50 μM Zinquin荧光探针在HBSS中染色40 min。然后将细胞培养瓶中的细胞用TrypLETM Express消化成单细胞悬液，将其分为三组，即空白对照组、阳性对照组ZnSO4（100μM）和样品组PPB-Zn。每组设置平行，细胞数量不少于1×106 个，将样品加入带有荧光探针标记的Caco-2细胞，于37 ℃的细胞培养箱中孵育1 h。处理完毕后用HBSS清洗2-3次，然后用含有4%多聚甲醛的组织固定液固定15 min，之后重悬在流式细胞仪缓冲液中，上样前过200目的细胞分子筛。最后，通过FACScan流式细胞仪（Becton-Dickinson，加利福尼亚，美国）检测各组Caco-2细胞内Zinquin荧光强度。
Zinquin乙酯是Zinquin的亲脂性衍生物，进入细胞质后，便被酯酶水解形成Zinquin。Zinquin是一种标记细胞弱结合锌池（Labile zinc pool, LZP）大小的荧光探针，其荧光越强，表明细胞LZP内锌含量越高。结果显示，PPB-Zn引起了胞内LZP的显著增加，效果稍弱于硫酸锌，表明PPB-Zn能够且容易被吸收进入胞内LZP。
（三）体外结扎小鼠肠段对PPB-Zn的吸收转运效果，具体实验过程和实验结论如下：
结果见图3，a）是PPB-Zn在体外结扎小鼠肠段中跨膜转运的效果；b）是内吞抑制剂对PPB-Zn在体外结扎小鼠肠段中跨膜转运的影响。星号表示差异与PPB-Zn对照相比有统计学意义(** P < 0.01，* P < 0.05)。注：2-APB：2-氨基乙基二苯硼酸盐。
7-8周龄的雄性C57BL/6小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，并饲养在有空调的温度为20-24 ℃，湿度为55-65％，12h/12h亮/暗循环的动物房内，给动物投喂AIN-93G标准饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司），超纯水自由饮用，实验前适应7 d。获得中国海洋大学动物实验伦理委员会批准(批准号:SPXY20180929)。
实验前将小鼠食物取出，禁食12 h。颈部脱臼使小鼠安乐死，剪开腹部后在距回盲连接点14和20 cm处切下一块回肠，用HBSS冲洗掉肠道内容物后放入37 ℃的HBSS培养基中预热一段时间。在一端结扎后，将0.35 mL溶于HBSS的ZnSO4和PPB-Zn中性溶液分别灌入肠段。另外在PPB-Zn基础上分别添加氯化钙（0 或1.67 mM）、植酸（0 或0.67 mM）、阿米洛利（0或2 mM）、叠氮钠（0或10 mM）、2-氨基乙基二苯硼酸盐（2-APB ，0或100 μM）、氯喹啉（0或100μM）和渥曼青霉素（0或1 μM），考察在钙离子和植酸同时存在的条件下，体外结扎小鼠肠道对PPB-Zn的吸收转运效果以及不同内吞抑制剂对PPB-Zn跨膜转运的影响。然后结扎另一端，将回肠放入含有2 mL HBSS的24孔细胞培养板中于温度37 ℃、振荡频率为50 rpm/min的培养箱中孵育1 h。孵育完成后，取肠外培养基稀释相应倍数过0.22 μm滤膜后，使用火焰原子吸收光谱法测定锌浓度。
图3a显示在体外结扎的小鼠肠段中，采用HBSS体系时，PPB-Zn的跨膜转运速率与ZnSO4相当，但当HBSS中添加植酸盐时，ZnSO4的吸收受到了显著抑制，而PPB-Zn的吸收速率则显著高于ZnSO4，这表明PPB-Zn较易被肠道吸收转运，特别是存在植酸时，比离子锌更容易被吸收和转运。
图3b显示，典型的三磷酸腺苷水解抑制剂叠氮钠对PPB-Zn中的锌吸收没有显著影响，因此，肠道对PPB-Zn的吸收似乎是一个与能量无关的过程。考虑到网格蛋白/小泡介导的内吞作用的能量消耗特性，巨胞饮可能是肠道摄取PPB-Zn的内吞机制。我们还观察到经典的巨胞饮抑制剂阿米诺利对PPB-Zn中锌吸收具有显著的抑制作用。低温（4 ℃）可以降低细胞膜的流动性，显著地抑制了肠段对PPB-Zn的摄取效率，进一步验证了吞饮作用参与了肠道细胞吸收PPB-Zn的过程。另外，氯喹啉和渥曼青霉素均显著抑制了PPB-Zn的跨膜转运，表明PPB-Zn经内吞进入肠上皮细胞溶酶体后，部分被降解而释放出锌离子进入细胞LZP，部分经胞吐作用进入肠上皮基底侧。
（四）口服PPB-Zn的大鼠药代动力学和急性吸收实验，具体实验过程和实验结论如下：
4-5周龄、体重130-150 g的雄性SD大鼠购于济南朋悦实验动物繁育有限公司。饲养在有空调的温度为20-24 ℃，湿度为55-65％，12h/12h亮/暗循环的动物房内，每2只一笼。给动物喂食粒状食物，饲料为AIN-93G标准饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司），超纯水随意饮用，实验前适应7 d。获得中国海洋大学动物实验伦理委员会批准(批准号:SPXY20180929)。
大鼠根据体重被随机分为5组，每组8只。实验前将大鼠食物取出，禁食12 h，各组大鼠灌胃现制的生理盐水、硫酸锌、硫酸锌+氯化钙+植酸、PPB-Zn、PPB-Zn+氯化钙+植酸五组样品。期间禁食，超纯水自由摄取，并保证适宜温度和湿度，并于0 min、15 min、30 min、1h、2 h、4 h和8 h等7个时间点尾部静脉取血30 μL，稀释到1.5 mL后使用原子吸收光谱测定锌含量。利用软件绘制药物代谢动力学曲线，如图4所示，分析最大达峰时间、最高浓度、曲线下面积、半衰期及平均滞留时间等参数，如表1所示。
表1. 口服不同种类锌源的大鼠药代动力学的相关参数
| 锌源种类 | 锌摄入剂量 (mg/kg 体重) | 最大达峰时间 (h) | 最高浓度 (μmol/L) | 曲线下面积(μmol/L.8h) | 半衰期 (h) | 平均滞留时间 (h) |
| ZnSO<sub>4</sub> | 2.6 | 0.5 | 53.15±1.28 | 367.53±5.16 | 24.16 | 3.83 |
| ZnSO<sub>4</sub>+Ca+PA | 2.6 | 0.5 | 44.02±1.06 | 338.41±3.51 | 117.78 | 3.96 |
| PPB-Zn | 2.6 | 1 | 48.17±1.44 | 351.26±4.01 | 42.12 | 3.92 |
| PPB-Zn+Ca+PA | 2.6 | 1 | 46.80±1.89 | 344.95±4.91 | 45.36 | 3.93 |
注：PA为植酸盐缩写。
最高浓度，曲线下面积等指标表明，PPB-Zn的肠道锌吸收效果低于ZnSO4，但当存在植酸时，ZnSO4的锌吸收受到了显著抑制，而PPB-Zn的锌吸收速率显著高于ZnSO4，表明PPB-Zn可被肠道吸收转运，特别是存在植酸时，比离子锌更容易被吸收和转运。
（五）口服不同种类锌源在大鼠体内24 h后的急性吸收实验，具体实验过程和实验结论如下：
图5 中，a）是血清锌含量；b）是肌肉锌含量；c）是肝脏锌含量；d）是肺脏锌含量。不同上标字母表示差异有统计学意义(P < 0.05)。
图5显示，阳性对照硫酸锌在大鼠血清、肌肉和肝肺等器官中均具有最高的锌保留浓度，PPB-Zn的效果与硫酸锌组的水平相当，肌肉中锌保留浓度稍稍差于硫酸锌组。当体系中存在植酸盐时，PPB-Zn的锌保留效率会明显降低，除肺脏外，其余均要显著强于硫酸锌组。二十四小时急性吸收实验结果表明，PPB-Zn在大鼠血清、肌肉和肝肺等器官中具有较高的锌保留浓度，在一定程度上较为耐受植酸的抑制作用，在大鼠体内具有良好的生物可利用性。
本发明中PPB-Zn是粒径约为10-30 nm 的不规则形状微粒，在小鼠体外结扎肠段中能够以内吞作用的方式被高效吸收和转运，在大鼠口服药物代谢动力学和急性吸收模型中也表现出良好的生物可利用性，特别在对抗植酸方面有很好的效果，故PPB-Zn是一种较为理想的微藻源补锌剂，可应用于素食习惯导致的锌缺乏人群的营养强化和营养补充。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.聚球藻在生产一种新型基于纳米多聚磷酸体的锌营养补充剂或强化剂上的应用。
2.一种聚球藻源纳米锌补锌剂，其特征在于，成分为富锌多聚磷酸盐纳米颗粒（PPB-Zn）。
3.权利要求2所述聚球藻源纳米锌补锌剂的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）采用锌强化medium A培养基培养聚球藻，至对数后期时采收藻体。
（2）通过热水抽提法获得藻体水提物，即将藻体置于沸水中抽提后冷却至室温，离心后收集上清即为藻体水提物。
（3）使用葡聚糖凝胶柱层析对藻体水提物进行分离，收集排阻峰组分；
（4）对步骤（3）排阻峰组分进行超滤浓缩后，冻干，即得PPB-Zn样品。
4. 根据权利要求3所述聚球藻源纳米锌补锌剂的制备方法，其特征在于，步骤（1）的锌强化medium A培养基中硫酸锌浓度为10-25 mg/L。
5. 根据权利要求3所述聚球藻源纳米锌补锌剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）的热水抽提时间为5-30 min。
6. 根据权利要求3所述聚球藻源纳米锌补锌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）的葡聚糖凝胶为Sephadex G50/G75/G100/G150。
7. 根据权利要求3所述聚球藻源纳米锌补锌剂的制备方法，其特征在于，步骤（4）的超滤膜截留分子量范围为3-10 KDa。
8.利用上述权利要求3-7任一项获得的聚球藻源纳米锌补锌剂。
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| CB02 | Change of applicant information | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20200915 |