CN104673673A - 一种聚球藻的无菌收集方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于藻类收集领域，特别涉及一种用于食品、药品领域的聚球藻的无菌收集方法，将初始聚球藻液从光生物反应器中转移至聚球藻无菌收集装置中避光、密封保存，温度从降至6-8℃；加入pH调节剂并搅拌，将其pH值调节至10-10.5；将藻液再次降温至6-8℃，保存8-15分钟；从出样口收集聚球藻浓缩液；排出聚球藻上清液，并在上清液中加入培养剂，将其pH值调节至7-7.5，加入光反应器中培养后转入聚球藻无菌收集装置中循环收集。本收集方法可减少聚球藻细胞的蛋白析出，不导致高价值蛋白析出，提高了聚球藻的利用价值。而且收集过程中添加的助剂极少，而且无毒无污染，不生成有害物质，可循环利用，聚球藻收率高。

Description

一种聚球藻的无菌收集方法
技术领域
本发明属于藻类收集领域，特别涉及一种用于食品、药品领域的聚球藻的无菌收集方法。
背景技术
微藻，作为生物质能源已经存在很多种收集方法，工业上采用的方法主要有离心法、超滤法、气浮法与絮凝法。微藻在食品药品生产工艺上尚不存在实用的收集方法，特别是针对于GMP无菌车间内的连续培养工艺，缺少一种连续的收集方法。
离心法即利用高速离心机对微藻细胞进行离心浓缩,是实验室普遍采用的收集蓝藻的方法。但其能源消耗大，操作繁琐，且离心过程中易导致细胞破碎，造成损失；超滤法投资大、操作费用高，必须选择合适的操作压力。如果压力过小，则操作时间长，生产效率不高，而压力太大，又会影响细胞的活性同时也可能使超滤膜损坏；气浮法由于添加了一定量的絮凝剂使藻细胞絮凝聚团或表面活性剂改良气泡，不仅加重了后续工艺负担，且易污染产品,也不利于培养液的循环利用。絮凝剂法，不能用于食品药品领域，因为絮凝剂本身有毒害作用，而且难以降解，为后续处理造成很大不便。
聚球藻是超微型光合自养原核生物，也是海洋蓝细菌最主要的代表性类群之一。目前，尚不存在针对聚球藻的收集方法。传统的离心法成本过高；絮凝法损害藻细胞，造成蛋白大量流失。
专利CN103266063A的方法专为能源微藻的收集而设计，成本较低，但需要加入硝酸、硫酸等酸液，对于真核藻细胞膜破坏较小，但经试验证明对于原核藻细胞膜破坏较大，会直接造成细胞破裂，造成蛋白大量流失，也不适用于GMP车间。
专利CN103184158A通过通入空气或惰性气体减少藻液CO2的浓度，降低光合作用，通过提高藻液pH使微藻产生自动絮凝沉淀。但是该法需要较长的处理时间，包括预先通气5个小时，再静置2个小时，只适合那些降低光合作用会升高pH的藻类，并且长时间的碱性条件会造成细胞蛋白组分的改变，不适用于对蛋白成分要求较高的食品药品领域。
专利CN103484373A已声明适用于培养液中钙镁离子较高的藻类，如杜氏海藻(Dunaliella salina)等真核藻，而经试验证明难以用于培养液中钙镁离子不高的蓝藻等原核藻。并且收集过程中还需通入废气来实现，而对于废气的来源及废气有毒有害成分未做分析，用于能源微藻收集尚可，但绝对不能用于食品药品领域，更不能用于GMP车间。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚球藻的无菌收集方法，该方法无菌操作，适合聚球藻用于食品、药品领域的应用，并满足GMP(良好作业规范)标准，而且聚球藻中的蛋白细胞不易遭到破坏，蛋白析出量低，收率高。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种聚球藻的无菌循环收集方法，其步骤包括：
(1)、将初始聚球藻液从光生物反应器中转移至聚球藻无菌收集装置中避光、密封保存，温度从降至6-8℃。优选的，平均降温速率为1.5℃/分钟；藻液温度迅速达到6-8℃时，并不破坏聚球藻的细胞结构，而聚球藻生理活性降低，光合作用与呼吸作用基本停止，细胞会自然下沉，利于收集。
避光时，由于聚球藻具有趋光性，光照条件下细胞运动活跃，避光可有效减少细胞运动，利于凝聚。藻液转移量为10-20％，未转移的藻液加入新培养剂稀释后，聚球藻密度更容易恢复到0.8-1.2g/L。
(2)、在聚球藻液中加入pH调节剂并以150-200rpm的速度搅拌，将聚球藻液的pH值调节至10-10.5；将藻液再次降温至6-8℃，保存8-15分钟。优选的，平均降温速率为1.5℃/分钟。
pH调节为10-10.5时，聚球藻细胞表面会分泌黏性胶状物质(糖蛋白与小分子蛋白)，属于聚球藻的独有现象，胶状物质促使细胞凝聚成团，同时阻止了大分子蛋白的析出。
(3)、从聚球藻无菌收集装置的出样口收集聚球藻浓缩液；
(4)、排出聚球藻上清液，并在上清液中加入培养剂，用质量浓度为10％的盐酸将其pH值调节至7-7.5，加入光生物反应器中培养，密度达到0.8-1.2g/L后，从光生物反应器中转移10-20％的藻液，转入聚球藻无菌收集装置中循环收集10-30小时。
(5)、重复步骤(1)-(4)。
所述步骤(1)中，初始聚球藻液的密度为0.8-1.2g/L。该密度下，聚球藻的生长达到对数期后期，蛋白表达率相对较高，有害次级代谢产物相对较少，是理想的收获期，同时光反应器中剩余仍处于对数期的聚球藻可用于连续培养，生长速率较高。
所述步骤(2)中，将浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液作为pH调节剂，调节聚球藻液的pH值。
所述步骤(4)中，培养剂由NaNO3、K2HPO4·3H2O、Na2CO3、CaCl2·2H2O、Na2CO3、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、Ca(NO3)2·6H2O、CuSO4·5H2O和柠檬酸铁铵组成。优选的，所述培养剂中的NaNO3、K2HPO4·3H2O、Na2CO3、CaCl2·2H2O、Na2CO3及柠檬酸铁铵的重量比为1:0.02:0.2:0.018:0.001:0.03：0.006；所述培养剂中的NaNO3、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、Ca(NO3)2·6H2O、CuSO4·5H2O的加入量比为1g：0.03mg：0.1mg:0.9mg:0.15mg:1.5mg：0.025mg：0.04mg。
所述培养剂中的NaNO3和上清液的加入量配比为1g/L。相对于普通藻类培养剂来说，本方法的培养剂中氮、铁、镁元素含量较高，适合聚球藻快速生长。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、所述聚球藻的无菌收集方法可减少聚球藻细胞的蛋白析出，析出的少量蛋白经检验均为15kda以下的小分子蛋白，不导致高价值蛋白析出，提高了聚球藻的利用价值。
2、所述聚球藻无菌收集过程中添加的助剂极少，而且无毒无污染，不生成有害物质，可循环利用。
3、所述聚球藻无菌收集方法中的上清液可循环培养利用，整个收集和培养过程都在密封、遮光的条件下进行，提高了聚球藻的收集质量。
4、本发明的收集方法，根据光生物反应器的生产规模，任意调控收集频率以满足生产需要，适应性强，而且收率高。
附图说明
图1是实施例2中的进入聚球藻无菌收集箱后10、20、30、40、50分钟后的聚球藻藻液，稀释10倍后置于显微镜后的照片。
图2是实施例2中的上清液用Braford法蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白的标准曲线图。
图3是实施例2中的上清液的电泳图。
图4是实施例1中的上清液与浓缩液的占比图。
图5是实施例1中的上清液的OD值变化图。
图6是实施例1中单次收集体积与密度恢复时间的关系图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
实施例1
100L光生物反应器的收集工艺，所用藻种为聚球藻(Synechococcus sp.PCC 7002)
1、将密度为0.8g/L的聚球藻藻液从光生物反应器转移至聚球藻无菌收集装置中，然后放入冷柜中降温至8℃，取出降温速率为1.5℃/分钟；
2、在藻液中加入2mol/L的氢氧化钠溶液，以搅拌转速为150rpm迅速搅拌，调节藻液的pH值至10；
3、将藻液放入冷柜中降温至8℃，保存10min取出，排出上清液，再收集浓缩的藻液，收集到的藻液可以加工成相关的食品、药品；
4.排出的上清液加入营养元素后，每升上清液中添加1g NaNO3、0.02gK2HPO4·3H2O、0.2g Na2CO3、0.006g柠檬酸铁铵、0.018g CaCl2·2H2O、0.001gNa2CO3、0.03mg MgSO4·7H2O、0.1mg ZnSO4·7H2O、0.9mg MnCl2·4H2O、0.15mgNa2MoO4·2H2O、1.5mg H3BO3、0.025mg Ca(NO3)2·6H2O、0.04mg CuSO4·5H2O，用10％HCl调节pH为7.5，通入光生物反应器中循环培养聚球藻20-28小时，每2天收集1-2次。
实施例2
1000L光生物反应器的收集工艺，所用藻种为聚球藻(Synechococcus sp.PCC 7002)
1、将密度为1.0g/L的聚球藻藻液从光生物反应器转移至聚球藻无菌收集装置中，并放入冷柜中降温至8℃取出，降温速率为1.5℃/分钟；
2、在藻液中加入2mol/L的氢氧化钠溶液，以搅拌转速为200rpm迅速搅拌，调节藻液的pH值至10.5；
3、将藻液放入冷柜中降温至8℃，保存10min取出，排出上清液，再收集浓缩的藻液，收集到的藻液可以加工成相关的食品、药品；
4.排出的上清液加入营养元素后，每升上清液中添加1g NaNO3、0.02gK2HPO4·3H2O、0.2g Na2CO3、0.006g柠檬酸铁铵、0.018g CaCl2·2H2O、0.001gNa2CO3、0.03mg MgSO4·7H2O、0.1mg ZnSO4·7H2O、0.9mg MnCl2·4H2O、0.15mgNa2MoO4·2H2O、1.5mg H3BO3、0.025mg Ca(NO3)2·6H2O、0.04mg CuSO4·5H2O，用10％HCl调节pH为7.5，通入光生物反应器中循环培养聚球藻12-20小时，每天收集2-3次。
检测结果：
1、将实施例2中，分别取进入聚球藻无菌收集箱后10、20、30、40、50分钟后的藻液，稀释10倍后置于显微镜下观察，分别如图1中的图A、图B、图C、图D及图E所示，经过本发明的收集工艺，聚球藻的藻细胞聚集效果明显提高。
2、取实例2中的上清液，迅速用1％的HCl调节上清液的pH值至7.5，Braford法蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白，标准曲线如图2，平行样结果分别为0.81ug/ml、0.92ug/ml、0.87ug/ml、0.73ug/ml、0.82ug/ml，证明析出量较低，均在每毫升1ug/ml以下；
3、取实例2中的上清液，迅速用1％HCL调节pH至7.5，冷冻干燥法浓缩为不同梯度(1、4、8、12)，用考马斯亮蓝法染色，PAGE凝胶电泳，结果证明析出蛋白的分子量在15kda左右，均为小分子蛋白。具体如图3所示。
4、上清液与浓缩液分层线变化检测：
实例1中，从降温开始10分钟后，每隔5min检测一次上清液与浓缩液的分层线，并计算上清液与浓缩液的高度比。图4是上清液所占比例变化曲线，随着工艺进行，上清液的比例增高，下层浓缩液比例变小，说明藻液浓缩效果较好，同时说明上清液回收率较高；图5是上清液中聚球藻A750变化曲线，随着工艺进行，上清液藻液吸光值越来越低，藻细胞个数越来越少，同时藻细胞大量聚集在下层浓缩液中，证明藻细胞收率较高。
5、单次收集体积与密度恢复时间的关系
实例1中，统计不同收集的体积下，光生物反应器中的藻液密度再次恢复到0.8g/L的所需时间，如图6所示，单次收集体积越高，恢复速度约慢，从成本角度考虑，最佳收集体积约在10％-20％。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (7)

1.一种聚球藻的无菌循环收集方法，其步骤包括：
(1)、将初始聚球藻液从光生物反应器中转移至聚球藻无菌收集装置中避光、密封保存，以1.5℃/分钟的平均降温速度，将藻液的温度降至6-8℃；
(2)、在聚球藻液中加入pH调节剂并以150-200rpm的速度搅拌，将聚球藻液的pH值调节至10-10.5；将藻液再次降温至6-8℃，保存8-15分钟；
(3)、从聚球藻无菌收集装置的出样口收集聚球藻浓缩液；
(4)、排出聚球藻上清液，并在上清液中加入培养剂，用质量浓度为10％的盐酸将其pH值调节至7-7.5，加入光生物反应器中培养10-30小时后，密度达到0.8-1.2g/L，将光生物反应器中的10-20％的藻液转入聚球藻无菌收集装置中循环收集；
(5)、重复步骤(1)-(4)。
2.根据权利要求1所述的聚球藻的无菌收集方法，其特征在于：所述步骤(1)中，初始聚球藻液的密度达到0.8-1.2g/L。
3.根据权利要求1所述的聚球藻的无菌收集方法，其特征在于：所述步骤(2)中，将浓度为2mol/L的氢氧化钠溶液作为pH调节剂，调节聚球藻液的pH值。
4.根据权利要求1所述的聚球藻的无菌收集方法，其特征在于：所述步骤(2)中，平均降温速率为1.5℃/分钟。
5.根据权利要求1所述的聚球藻的无菌收集方法，其特征在于：所述步骤(4)中，培养剂由NaNO3、K2HPO4·3H2O、Na2CO3、CaCl2·2H2O、Na2CO3、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、Ca(NO3)2·6H2O、CuSO4·5H2O和柠檬酸铁铵组成。
6.根据权利要求5所述的聚球藻的无菌收集方法，其特征在于：所述培养剂中的NaNO3、K2HPO4·3H2O、Na2CO3、CaCl2·2H2O、Na2CO3及柠檬酸铁铵的重量比为1:0.02:0.2:0.018:0.001:0.03：0.006；所述培养剂中的NaNO3、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、Na2MoO4·2H2O、H3BO3、Ca(NO3)2·6H2O、CuSO4·5H2O的加入量比为1g：0.03mg：0.1mg:0.9mg:0.15mg:1.5mg：0.025mg：0.04mg。
7.根据权利要求1、5或6中所述的聚球藻的无菌收集方法，其特征在于：所述培养剂中的NaNO3和上清液的加入量配比为1g/L。
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