CN111647057A

CN111647057A - 一种伤寒沙门菌疫苗重组蛋白及其编码基因和它们的应用

Info

Publication number: CN111647057A
Application number: CN202010378299.XA
Authority: CN
Inventors: 丛延广; 熊坤; 陈志瑾; 王佳; 余玥; 何金芮
Original assignee: Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine TCM of Southwest Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine TCM of Southwest Medical University
Priority date: 2020-05-07
Filing date: 2020-05-07
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2040-05-07
Also published as: CN111647057B

Abstract

本发明公开了一种伤寒沙门菌疫苗重组蛋白及其编码基因和它们的应用，该重组蛋白包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。制备方法包括：构建yncD表达质粒，对yncD表达质粒诱导表达和纯化；所述构建yncD表达质粒采用如SEQ ID NO.3和如SEQ ID NO.4所示的引物做PCR，获得yncD基因全序列，连接到表达质粒，得到重组质粒。本发明的重组蛋白包括具有良好免疫原性的靶蛋白，位于沙门菌表面；其是一个涉及铁摄取的TonB依赖性外膜转运体，为细菌体内生存和致病所必需；蛋白的氨基酸序列保守，广泛存在于目前已测序的伤寒沙门菌菌株中，且其基因功能在不同伤寒沙门菌菌株中是一致的，具有良好的免疫原性，对免疫小鼠具有良好的保护效果。

Description

一种伤寒沙门菌疫苗重组蛋白及其编码基因和它们的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种伤寒沙门菌疫苗重组蛋白及其编码基因和它们的应用。

背景技术

沙门菌属细菌包括2500多个血清型，其中部分血清型(伤寒沙门菌、甲型、乙型和丙型副伤寒沙门菌)可以引起人类的传染病，即肠热症(伤寒或副伤寒)；另外部分沙门菌是人畜共患病的病原体，可引起人类食物中毒或者败血症(如鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌等)。沙门菌引起的疾病发病率高，危害严重，例如作为肠道传染病的伤寒和副伤寒，据世界卫生组织估计，全球每年有1600-3300万感染者，死亡病例在50-60万左右。伤寒病例长期位居我国法定传染病的前10位，各地每年仍有大量散发病例，还时有局部的爆发流行，严重威胁着人们的身体健康。而由沙门菌引起的食物中毒则更为常见，是我国细菌性食物中毒的最常见病原之一。因此对于沙门菌感染的控制是一件非常重要的课题。沙门菌感染的控制需要采取综合措施，包括改善卫生条件以及有效疫苗的使用。通过疫苗刺激机体产生针对沙门菌的特异性免疫反应是一种有效的低成本预防策略。

接种疫苗的基本目的是诱导机体的免疫反应，进而对病原体的感染起到免疫保护的作用。这一目的可以通过重组蛋白疫苗的接种而实现。重组蛋白疫苗是指将病原体的目的抗原基因构建在表达载体上诱导表达，通过纯化后制备的疫苗。此类疫苗制备工艺简便、安全性好，疫苗不存在毒力回复等问题。重组蛋白疫苗还可以根据需要进行适当组合，从而实现一次接种免疫多种疾病的目的。

对于重组蛋白疫苗研制的关键是找到具有良好免疫原性的靶蛋白。良好的蛋白疫苗候选应该具有以下几个特征：

1、一般位于致病菌表面，具有良好的免疫原性；

2、蛋白功能对于致病菌致病至关重要；

3、蛋白的氨基酸序列保守，且存在于该致病菌绝大多数菌株中。

基于此，研究一种符合上述特征的重组蛋白疫苗，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明实施例提出一种伤寒沙门菌疫苗重组蛋白及其编码基因和它们的应用。

本发明实施例所公开的一种伤寒沙门菌疫苗重组蛋白，其包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明实施例还公开了一种编码上述的伤寒沙门菌疫苗重组蛋白的基因。

进一步地，所述基因包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明实施例还公开了一种重组载体，其包括上述的基因。

本发明实施例还公开了一种重组菌株，所述重组菌株含有上述的重组载体。

进一步地，所述菌株为大肠杆菌。

本发明实施例还公开了一种制备伤寒沙门菌疫苗重组蛋白的方法，其包括：

构建yncD表达质粒，对yncD表达质粒诱导表达和纯化；

其中，所述构建yncD表达质粒采用如SEQ ID NO.3和如SEQ ID NO.4所示的引物做PCR，获得yncD基因全序列，连接到表达质粒，得到重组质粒；所述对yncD表达质粒诱导表达包括将所述重组质粒在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。

进一步地，所述表达质粒为PET28a。

进一步地，所述构建yncD表达质粒包括采用SacΙ酶切所述表达质粒。

本发明一些实施例还公开了上述的伤寒沙门菌疫苗重组蛋白、上述的基因、上述的重组载体、上述的重组菌株，以及上述的制备伤寒沙门菌疫苗重组蛋白的方法在制备用于预防伤寒沙门菌感染的疫苗中的应用。

本发明一些实施例还公开了一种用于预防伤寒沙门菌感染的疫苗，所述疫苗含有上述的伤寒沙门菌重组蛋白作为活性成分。

进一步地，所述疫苗还含有药学上可接受的佐剂。

本发明一些实施例还公开了一种药物，其特征在于，所述药物含有上述的伤寒沙门菌重组蛋白作为活性成分；

优选地，所述药物还含有药学上可接受的佐剂。

采用上述技术方案，本发明至少具有如下有益效果：

本发明公开的的伤寒沙门菌重组蛋白包括具有良好免疫原性的靶蛋白，位于沙门菌表面(细菌外膜)；其是一个涉及铁摄取的TonB依赖性外膜转运体，为细菌体内生存和致病所必需；蛋白的氨基酸序列保守，广泛存在于目前已测序的伤寒沙门菌菌株中，且其基因功能在不同伤寒沙门菌菌株中是一致的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为融合蛋白表达小试SDS-PAGE分析图。

图2为融合蛋白镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE分析图。

图3为融合蛋白离子柱纯化SDS-PAGE分析图。

图4为最终纯化蛋白SDS-PAGE分析图。

图5为最终纯化蛋白Western Blot分析图。

图6、图7为YncD蛋白免疫小鼠感染伤寒沙门菌后肝脾带菌。

图8为伤寒沙门菌yncD基因相似性Blast结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明实施例进一步详细说明。

需要说明的是，本发明实施例中所有使用“第一”和“第二”的表述均是为了区分两个相同名称非相同的实体或者非相同的参量，可见“第一”“第二”仅为了表述的方便，不应理解为对本发明实施例的限定，后续实施例对此不再一一说明。

本发明所用试剂材料：

实验中所用试剂除DNA连接酶和试剂盒外，均为Takara公司产品；

LB培养基配方：氯化钠1％，胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％；配制固体培养基，加入琼脂1.4％，121℃高压蒸汽灭菌后使用；

DNA连接酶购自Promega公司，胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Omega公司，引物合成和DNA片段测序由华大公司完成

卡那霉素培养基：即在普通LB培养基基础上加入终浓度100μg/ml的卡那霉素；

氨苄青霉素培养基：即在普通LB培养基基础上加入终浓度100μg/ml的氨苄青霉素。

本发明所用主要仪器：

凝胶成像仪(Bio-rad-T2a)、电转仪(Bio-rad gene-pluserII)、分光光度计(Bio-radsmartspeec 3000)、电泳仪(Bio-rad 72BR5008)、PCR仪(Bio-rad580B5502)、水浴(上海生工HH-2A)、金属浴(杭州博日CHB-A4-HH)、摇床(zhicheng ZHWY-100B恒温摇床)、离心机(Thermo LEGEND Micro21)。

实施例1 yncD表达质粒的构建

以伤寒沙门菌ty2野生株基因组DNA为模板，用PCR方式获得yncD基因全序列(去除该基因前端信号肽序列)，连接到PET28a表达质粒上，得到如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，经验证序列无误后，电转入大肠埃希菌BL21中，诱导表达YncD重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

1.1 PCR：根据yncD基因序列设计引物K1，K2(如表1所示)，做PCR。

表1引物序列

PCR方法如下：

反应条件：

94℃顶盖预热5min；94℃解链30s，55℃退火40s，72℃延长3min，共35个循环。

1.2将所得PCR产物电泳做胶回收，标记为pcr1。用PET28a做单酶切。

体系：

PET28a 43μl

SacΙ 2μl

10×缓冲溶液 5μl

总体积 50μl

条件：37℃水浴过夜。

将酶切产物跑凝胶电泳后胶回收，并测定浓度，标记为L1。用L1和pcr1做无缝克隆反应构建表达载体，记为PET28a-yncD，条件如下：

体系：

反应条件：37℃金属浴30分钟。

1.3将PET28a-yncD电转入大肠埃希菌BL21中复制、扩增、提取质粒(卡那霉素抗性)，送华大公司进行测序鉴定。对测序获得的序列与网上公布的相应序列对比。结果成功构建表达载体，测序结果表明克隆的基因序列完全正确。

实施例2yncD表达质粒的诱导表达和纯化

将测序鉴定正确的PET28a-yncD重组质粒在BL21中进行诱导表达，将表达产物进行纯化，最后通过SDS-PAGE以及Western Blot验证重组YncD蛋白纯化效果。主要材料与试剂、主要缓冲液、主要仪器如表2，表3，表4所示。

表2主要材料与试剂

表3主要缓冲液

表4主要仪器

2.1实验步骤

2.1.1蛋白表达

转化：将重组质粒转入大肠埃希菌感受态细胞，热激后涂布在含有100μg/ml卡那霉素的平板上，培养；

活化：挑取单克隆到含有100μg/ml卡那霉素的液体培养基中培养；

诱导：当OD值达到0.6时，添加诱导剂IPTG，继续培养，分别于20℃条件下培养过夜、37℃条件下培养过夜，未添加诱导剂的为阴性对照；

收集菌体：离心，弃上清，收集菌体；

表达检测：在收集到的菌体中加入缓冲液A悬浮，使用超声破碎仪使其充分溶解并离心，离心后的沉淀使用缓冲液B进行溶解，分别对上清和沉淀处理，制样，准备SDS-PAGE检测。

2.1.2蛋白纯化

2.1.2.1一步纯化——Ni柱

收集粗蛋白：细胞菌体用缓冲液C溶解、超声破碎。离心去上清，沉淀用缓冲液D溶解，超声破碎、离心收集上清粗蛋白。

平衡：采用5ml Ni-NTA柱料，用5倍柱床体积的Binding buffer 1清洗平衡柱子，流速5ml/min；

孵育：将粗蛋白与平衡后的柱填料孵育1h；

上柱：将孵育后的产物上柱，收集流出；

平衡：用Binding buffer 1清洗平衡柱子；

洗杂：用Washing buffer 1洗柱子，并收集流出；

洗脱：用Elution buffer 1洗脱，收集流出；

纯化检测：对粗蛋白、洗杂流出、洗脱流出分别处理，制样，准备SDS-PAGE检测。

透析浓缩：将纯度较好的组分3透析到4M Urea，50mM Tris，pH 8.0中，准备过离子柱。

2.1.2.2二次纯化——离子柱

平衡：采用5ml Q Sefinose FF柱料，用10倍柱床体积的Binding buffer 2清洗平衡柱子，流速5ml/min；

孵育：将粗蛋白与平衡后的柱填料孵育1h；

上柱：将样品上柱，收集流出；

洗杂：用Washing buffer 2洗柱子，并收集流出；

洗脱：用Elution buffer 2洗脱，收集流出；

透析浓缩：将纯度较好的组分5、6透析到50mM Tris，300mM NaCl，0.1％SKL，10％Glycerol，pH 8.0中，透析结束后用PEG20000浓缩，0.22μm滤膜过滤后分装1ml/tube，-80℃保存。

2.1.2.3目的蛋白检测

SDS-PAGE检测：对纯化后蛋白进行处理，制样，跑胶，检测分子量。Western Blot验证：对纯化后蛋白进行处理，制样，使用标签抗体进行验证。

2.2实验结果

2.2.1序列信息

2.2.1.1表达氨基酸序列(融合YncD蛋白氨基酸序列)SEQ ID NO.1

Protein Length＝722MW＝79453.2

Predicted pI＝6.31

MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSEFASAPNEQTMIVTATPQTVSELDTPAAVSVIEGEDMRLATPRVNLSESLTSVPGLQVQNRQNYAQDLQISIRGFGSRSAFGVRGIRLYVDGIPATMPDGQGQISNIDINSIQNVEVLRGPFSALYGNASGGVINVTTETGRQPPTLEASSYYGSYGSWRYGLKATGAMGDGTQPGDVDYTVSTTRFTTHGYRDHSGARKNLANAKLGVRLDDVSKLSLIFNSVDIKADDPGGLTESEWKADPQQAPRAEQYNTRKTIKQTQAGLRYERQLSAQDDISVMAYAGERETTQYQSIPLVAQLKPAQAGGVITLQRHYQGIDSRWTHRGELGVPVTFTGGLNYENMSENRKGYNNFRLNNGTPEFGHKGDLRRDERNLMWNVDPYLQTQWQLTQKLSLDAGVRYSSVWFDSNDHYIAPGNGDDSGDASYHHWLPAGSLKYALTDAWNLYLAAGRGFETPTINELSYRADGQSGFNFDLKPSTNDTVEVGSKTRIGNGLLTAALFQTDTDDEIVVASSMGGRTTYKNAGKTRRQGAELALDQRFAGDWRVKASWTWLDATYRSNVCQGQNCDGNRMPGIARNMGFASLGFIPDEGWYAGTDVRYMGDIMANDENTAKAPSYTVVGLNTGYKFNYSQLTVDIFGRVDNLFDEEYIGSVIVNESNGRYYEPAPGRNYGVGINLAWQFEHHHHHH

2.2.1.2质粒基因序列(YncD融合蛋白基因DNA序列)SEQ ID NO.2

ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCGCCAGCGCGCCCAATGAACAAACCATGATAGTCACCGCAACGCCGCAAACCGTATCCGAGCTGGATACACCTGCCGCCGTTAGCGTCATTGAGGGAGAAGACATGCGTCTGGCGACGCCGCGCGTTAATTTATCTGAGTCTTTAACCAGCGTCCCGGGATTGCAGGTGCAGAACCGGCAGAACTACGCGCAGGATCTGCAAATCTCTATCCGTGGATTTGGCTCGCGTTCCGCCTTTGGCGTGCGCGGCATTCGTCTGTATGTTGATGGCATTCCCGCCACCATGCCGGATGGACAAGGCCAGATTTCAAATATTGATATTAACAGCATACAAAACGTTGAAGTGTTACGCGGCCCCTTCTCAGCGCTATACGGCAATGCTTCCGGCGGCGTGATAAATGTCACCACCGAAACCGGGAGACAGCCGCCCACCCTTGAGGCCAGCAGCTACTACGGCAGTTATGGAAGCTGGCGCTATGGGTTAAAAGCCACGGGCGCGATGGGGGACGGCACACAGCCTGGCGACGTGGATTACACGGTATCGACTACCCGTTTCACCACCCACGGCTACCGCGATCACAGCGGCGCGCGAAAAAATCTGGCTAATGCCAAACTGGGCGTGCGCCTTGACGATGTCAGTAAACTTTCGCTGATTTTTAATAGTGTGGACATTAAGGCGGACGATCCCGGCGGACTTACCGAATCTGAATGGAAAGCCGATCCGCAGCAGGCGCCGCGCGCTGAACAGTACAATACGCGTAAAACCATCAAACAAACTCAGGCAGGATTGCGTTATGAACGTCAGCTCAGCGCGCAGGATGATATCAGCGTGATGGCCTACGCCGGAGAGCGGGAAACCACGCAATACCAGTCTATTCCCCTGGTGGCACAGCTAAAACCAGCCCAGGCTGGCGGCGTAATTACACTGCAACGCCACTATCAGGGAATTGATTCCCGCTGGACTCACCGGGGAGAATTAGGTGTGCCGGTCACCTTCACTGGCGGGTTAAACTATGAAAACATGAGCGAAAACCGCAAGGGTTACAATAATTTCCGTCTCAACAACGGCACCCCTGAGTTCGGGCATAAAGGCGATTTACGGCGGGATGAGCGTAACCTGATGTGGAATGTCGATCCTTATCTGCAAACCCAGTGGCAGCTTACGCAAAAACTCTCGCTGGATGCTGGCGTGCGCTACAGTTCCGTGTGGTTCGATTCTAACGATCACTATATCGCGCCCGGCAATGGCGATGACAGCGGCGACGCCAGCTATCACCACTGGCTACCCGCCGGATCGCTAAAATATGCGTTAACTGACGCCTGGAATCTCTATCTTGCTGCCGGTCGCGGATTTGAAACTCCCACTATCAATGAACTTTCTTATCGCGCTGACGGCCAAAGCGGGTTCAACTTTGACCTCAAACCGTCGACCAATGATACGGTGGAAGTCGGCAGTAAAACGCGGATTGGCAATGGCTTGTTGACCGCCGCGTTATTTCAAACCGATACCGATGATGAAATTGTCGTCGCCAGTAGTATGGGAGGACGCACTACCTACAAAAACGCGGGCAAAACGCGCCGCCAGGGCGCAGAGCTCGCGTTGGACCAGCGCTTCGCCGGCGACTGGCGGGTGAAAGCATCATGGACCTGGCTGGATGCGACCTATCGCAGTAACGTTTGTCAGGGGCAAAACTGTGATGGAAACCGGATGCCCGGCATCGCCCGTAATATGGGATTCGCCTCATTAGGTTTTATCCCGGATGAGGGGTGGTACGCCGGAACAGACGTTCGGTATATGGGCGATATCATGGCCAATGATGAAAATACCGCCAAAGCGCCTTCGTATACCGTTGTTGGACTAAATACAGGGTATAAATTTAATTACAGTCAGCTTACCGTCGATATTTTTGGGCGGGTAGATAATCTATTTGATGAAGAATATATCGGTTCGGTGATCGTTAATGAATCTAATGGCCGATATTATGAGCCAGCGCCAGGGCGTAACTATGGCGTGGGGATTAATCTGGCATGGCAATTTGAACACCACCACCACCACCACTGA

其中，

ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTC和CACCACCACCACCACCACTGA为pet28a质粒序列，其余为无信号肽，无终止密码子TAA的YncD蛋白序列。

2.2.2蛋白表达检测

如图1所示为融合蛋白表达小试SDS-PAGE分析图，其中，

M：Protein Marker；1：诱导前总蛋白；2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀。

2.2.3蛋白纯化检测

2.2.3.1一步纯化

如图2所示为融合蛋白镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE分析图，其中，

M：Protein marker；1：上样；2：流出；3-4：20mM Imidazole洗脱组分；5：50mMImidazole洗脱组分；6：500mM Imidazole洗脱组分。

2.2.3.2二次纯化

如图3所示为融合蛋白离子柱纯化SDS-PAGE分析图，其中，

M：Protein marker；1：上样；2：流出；3-4：50mM NaCl洗脱组分；5：100mM NaCl洗脱组分；6：200mM NaCl洗脱组分；7：500mM NaCl洗脱组分。

2.2.4融合目的蛋白验证

如图4所示，融合蛋白经过纯化，SDS-PAGE电泳分析在理论分子量相应位置出现明显条带，可初步确定融合蛋白成功得到了纯化。其中，

M：Protein marker；1：融合目的蛋白。

为进一步确定纯化获得的蛋白为目的蛋白，如图5所示，按照Western Blot步骤用TMB显色试剂盒显色。结果显示在相应位置出现明显条带，表明该蛋白为目的蛋白。其中，

M：Protein marker；1：融合目的蛋白。

综上所述，成功纯化出目的蛋白。

实施例3 YncD蛋白动物免疫效果

3.1实验步骤：

3.1.1将纯化的YncD蛋白和完全弗氏佐剂按1:1的比例混合并反复研磨直至形成油包水样的悬液；

3.1.2分别在第0、2、4周的时候，用悬液对BALB/c雌鼠进行皮下接种，蛋白接种量为50μg/只，共50只。同时设置PBS免疫对照组35只；

3.1.3BALB/c雌鼠在第6周末时(即42天)，分别腹腔接种ty2野生株细菌。接种菌量分别为2.5x10¹cfu、2.5x10²cfu、5.0x10²cfu、2.5x10³cfu、5.0x10³cfu，每个浓度10只小鼠，同时设置PBS免疫对照组，接种细菌量为2.5x10¹cfu、2.5x10²cfu、5.0x10²cfu每个浓度10只，2.5x10³cfu浓度5只；

3.1.4接种细菌的小鼠禁食喂水72小时，并及时观察记录小鼠存活情况和取出死亡小鼠。

3.2实验结果：

如表5所示为YncD蛋白小鼠免疫效果，其中，

YNCD：YncD蛋白免疫组；PBS：PBS对照组。

表5 YncD蛋白小鼠免疫效果

结果显示：YncD蛋白免疫组相较于对照组具有更高的存活率，伤寒沙门菌对二者的半数致死量分别为6.09x10²CFU和9.05x10¹CFU，相差大约7倍。说明YncD蛋白免疫接种对小鼠具有显著的免疫保护效果。

实施例4小鼠免疫与肝脾带菌量

4.1实验步骤：

4.1.1将纯化的YncD蛋白和完全弗氏佐剂按1:1的比例混合并反复研磨直至形成油包水样的悬液；

4.1.2分别在第0,2,4周的时候，用悬液对BALB/c雌鼠进行皮下接种，蛋白接种量为50μg/只；

4.1.3 BALB/c雌鼠在第6周末时(即42天)，分别腹腔接种ty2野生株细菌。接种菌量分别为2.5x10⁴cfu、2.5x10⁵cfu、2.5x10⁶cfu，每个浓度三只小鼠，同时设置PBS对照组；

4.1.4接种细菌的小鼠正常饲养一周(7天)后，处死并分别摘取肝脏和脾脏；

4.1.5将每只小鼠的肝脏和脾脏分别破碎并用1ml无菌超纯水混悬，破碎液用无菌超纯水进行适当稀释，并取各梯度稀释液100μl涂布PLB平板，37℃孵育过夜；

4.1.6计数平板上的菌落并分析；

4.2实验结果：

如图6，图7所示，结果显示，免疫组的肝脾载菌量显著低于对照组，在2.5x10⁴CFU剂量组甚至无细菌存留。说明小鼠经YncD蛋白免疫接种后，对伤寒沙门菌具有更好的免疫耐受力和清除能力。

实施例5 yncD基因在伤寒沙门菌中的相似度分析

对已测序的伤寒沙门菌的yncD基因序列进行相似度比对。伤寒沙门菌yncD基因相似性Blast结果参见图8。分析表明，yncD基因序列在伤寒沙门菌中有高度的保守性，相似度为100％，高度的保守性表明其基因功能在不同伤寒沙门菌菌株中是一致的。

综上所述，本发明提供的可用作伤寒疫苗的重组蛋白，具有良好的免疫原性和免疫保护性，YncD蛋白免疫组对实验动物具有显著的免疫保护作用。因此，可作为一种良好的疫苗预防伤寒沙门菌感染；同时本发明的重组蛋白可以较低成本大规模生产，具有良好的市场前景。

需要特别指出的是，上述各个实施例中的各个组件或步骤均可以相互交叉、替换、增加、删减，因此，这些合理的排列组合变换形成的组合也应当属于本发明的保护范围，并且不应将本发明的保护范围局限在所述实施例之上。

以上是本发明公开的示例性实施例，上述本发明实施例公开的顺序仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。但是应当注意，以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明实施例公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子，在不背离权利要求限定的范围的前提下，可以进行多种改变和修改。根据这里描述的公开实施例的方法权利要求的功能、步骤和/或动作不需以任何特定顺序执行。此外，尽管本发明实施例公开的元素可以以个体形式描述或要求，但除非明确限制为单数，也可以理解为多个。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明实施例公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明实施例的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明实施例的保护范围之内。

序列表

<110> 西南医科大学附属中医医院

<120> 一种伤寒沙门菌疫苗重组蛋白及其编码基因和它们的应用

<141> 2020-05-07

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 722

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 1

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Glu Phe Ala Ser Ala Pro Asn Glu Gln Thr Met Ile Val Thr

35 40 45

Ala Thr Pro Gln Thr Val Ser Glu Leu Asp Thr Pro Ala Ala Val Ser

50 55 60

Val Ile Glu Gly Glu Asp Met Arg Leu Ala Thr Pro Arg Val Asn Leu

65 70 75 80

Ser Glu Ser Leu Thr Ser Val Pro Gly Leu Gln Val Gln Asn Arg Gln

85 90 95

Asn Tyr Ala Gln Asp Leu Gln Ile Ser Ile Arg Gly Phe Gly Ser Arg

100 105 110

Ser Ala Phe Gly Val Arg Gly Ile Arg Leu Tyr Val Asp Gly Ile Pro

115 120 125

Ala Thr Met Pro Asp Gly Gln Gly Gln Ile Ser Asn Ile Asp Ile Asn

130 135 140

Ser Ile Gln Asn Val Glu Val Leu Arg Gly Pro Phe Ser Ala Leu Tyr

145 150 155 160

Gly Asn Ala Ser Gly Gly Val Ile Asn Val Thr Thr Glu Thr Gly Arg

165 170 175

Gln Pro Pro Thr Leu Glu Ala Ser Ser Tyr Tyr Gly Ser Tyr Gly Ser

180 185 190

Trp Arg Tyr Gly Leu Lys Ala Thr Gly Ala Met Gly Asp Gly Thr Gln

195 200 205

Pro Gly Asp Val Asp Tyr Thr Val Ser Thr Thr Arg Phe Thr Thr His

210 215 220

Gly Tyr Arg Asp His Ser Gly Ala Arg Lys Asn Leu Ala Asn Ala Lys

225 230 235 240

Leu Gly Val Arg Leu Asp Asp Val Ser Lys Leu Ser Leu Ile Phe Asn

245 250 255

Ser Val Asp Ile Lys Ala Asp Asp Pro Gly Gly Leu Thr Glu Ser Glu

260 265 270

Trp Lys Ala Asp Pro Gln Gln Ala Pro Arg Ala Glu Gln Tyr Asn Thr

275 280 285

Arg Lys Thr Ile Lys Gln Thr Gln Ala Gly Leu Arg Tyr Glu Arg Gln

290 295 300

Leu Ser Ala Gln Asp Asp Ile Ser Val Met Ala Tyr Ala Gly Glu Arg

305 310 315 320

Glu Thr Thr Gln Tyr Gln Ser Ile Pro Leu Val Ala Gln Leu Lys Pro

325 330 335

Ala Gln Ala Gly Gly Val Ile Thr Leu Gln Arg His Tyr Gln Gly Ile

340 345 350

Asp Ser Arg Trp Thr His Arg Gly Glu Leu Gly Val Pro Val Thr Phe

355 360 365

Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Glu Asn Met Ser Glu Asn Arg Lys Gly Tyr

370 375 380

Asn Asn Phe Arg Leu Asn Asn Gly Thr Pro Glu Phe Gly His Lys Gly

385 390 395 400

Asp Leu Arg Arg Asp Glu Arg Asn Leu Met Trp Asn Val Asp Pro Tyr

405 410 415

Leu Gln Thr Gln Trp Gln Leu Thr Gln Lys Leu Ser Leu Asp Ala Gly

420 425 430

Val Arg Tyr Ser Ser Val Trp Phe Asp Ser Asn Asp His Tyr Ile Ala

435 440 445

Pro Gly Asn Gly Asp Asp Ser Gly Asp Ala Ser Tyr His His Trp Leu

450 455 460

Pro Ala Gly Ser Leu Lys Tyr Ala Leu Thr Asp Ala Trp Asn Leu Tyr

465 470 475 480

Leu Ala Ala Gly Arg Gly Phe Glu Thr Pro Thr Ile Asn Glu Leu Ser

485 490 495

Tyr Arg Ala Asp Gly Gln Ser Gly Phe Asn Phe Asp Leu Lys Pro Ser

500 505 510

Thr Asn Asp Thr Val Glu Val Gly Ser Lys Thr Arg Ile Gly Asn Gly

515 520 525

Leu Leu Thr Ala Ala Leu Phe Gln Thr Asp Thr Asp Asp Glu Ile Val

530 535 540

Val Ala Ser Ser Met Gly Gly Arg Thr Thr Tyr Lys Asn Ala Gly Lys

545 550 555 560

Thr Arg Arg Gln Gly Ala Glu Leu Ala Leu Asp Gln Arg Phe Ala Gly

565 570 575

Asp Trp Arg Val Lys Ala Ser Trp Thr Trp Leu Asp Ala Thr Tyr Arg

580 585 590

Ser Asn Val Cys Gln Gly Gln Asn Cys Asp Gly Asn Arg Met Pro Gly

595 600 605

Ile Ala Arg Asn Met Gly Phe Ala Ser Leu Gly Phe Ile Pro Asp Glu

610 615 620

Gly Trp Tyr Ala Gly Thr Asp Val Arg Tyr Met Gly Asp Ile Met Ala

625 630 635 640

Asn Asp Glu Asn Thr Ala Lys Ala Pro Ser Tyr Thr Val Val Gly Leu

645 650 655

Asn Thr Gly Tyr Lys Phe Asn Tyr Ser Gln Leu Thr Val Asp Ile Phe

660 665 670

Gly Arg Val Asp Asn Leu Phe Asp Glu Glu Tyr Ile Gly Ser Val Ile

675 680 685

Val Asn Glu Ser Asn Gly Arg Tyr Tyr Glu Pro Ala Pro Gly Arg Asn

690 695 700

Tyr Gly Val Gly Ile Asn Leu Ala Trp Gln Phe Glu His His His His

705 710 715 720

His His

<210> 2

<211> 2169

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 2

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcgc cagcgcgccc 120

aatgaacaaa ccatgatagt caccgcaacg ccgcaaaccg tatccgagct ggatacacct 180

gccgccgtta gcgtcattga gggagaagac atgcgtctgg cgacgccgcg cgttaattta 240

tctgagtctt taaccagcgt cccgggattg caggtgcaga accggcagaa ctacgcgcag 300

gatctgcaaa tctctatccg tggatttggc tcgcgttccg cctttggcgt gcgcggcatt 360

cgtctgtatg ttgatggcat tcccgccacc atgccggatg gacaaggcca gatttcaaat 420

attgatatta acagcataca aaacgttgaa gtgttacgcg gccccttctc agcgctatac 480

ggcaatgctt ccggcggcgt gataaatgtc accaccgaaa ccgggagaca gccgcccacc 540

cttgaggcca gcagctacta cggcagttat ggaagctggc gctatgggtt aaaagccacg 600

ggcgcgatgg gggacggcac acagcctggc gacgtggatt acacggtatc gactacccgt 660

ttcaccaccc acggctaccg cgatcacagc ggcgcgcgaa aaaatctggc taatgccaaa 720

ctgggcgtgc gccttgacga tgtcagtaaa ctttcgctga tttttaatag tgtggacatt 780

aaggcggacg atcccggcgg acttaccgaa tctgaatgga aagccgatcc gcagcaggcg 840

ccgcgcgctg aacagtacaa tacgcgtaaa accatcaaac aaactcaggc aggattgcgt 900

tatgaacgtc agctcagcgc gcaggatgat atcagcgtga tggcctacgc cggagagcgg 960

gaaaccacgc aataccagtc tattcccctg gtggcacagc taaaaccagc ccaggctggc 1020

ggcgtaatta cactgcaacg ccactatcag ggaattgatt cccgctggac tcaccgggga 1080

gaattaggtg tgccggtcac cttcactggc gggttaaact atgaaaacat gagcgaaaac 1140

cgcaagggtt acaataattt ccgtctcaac aacggcaccc ctgagttcgg gcataaaggc 1200

gatttacggc gggatgagcg taacctgatg tggaatgtcg atccttatct gcaaacccag 1260

tggcagctta cgcaaaaact ctcgctggat gctggcgtgc gctacagttc cgtgtggttc 1320

gattctaacg atcactatat cgcgcccggc aatggcgatg acagcggcga cgccagctat 1380

caccactggc tacccgccgg atcgctaaaa tatgcgttaa ctgacgcctg gaatctctat 1440

cttgctgccg gtcgcggatt tgaaactccc actatcaatg aactttctta tcgcgctgac 1500

ggccaaagcg ggttcaactt tgacctcaaa ccgtcgacca atgatacggt ggaagtcggc 1560

agtaaaacgc ggattggcaa tggcttgttg accgccgcgt tatttcaaac cgataccgat 1620

gatgaaattg tcgtcgccag tagtatggga ggacgcacta cctacaaaaa cgcgggcaaa 1680

acgcgccgcc agggcgcaga gctcgcgttg gaccagcgct tcgccggcga ctggcgggtg 1740

aaagcatcat ggacctggct ggatgcgacc tatcgcagta acgtttgtca ggggcaaaac 1800

tgtgatggaa accggatgcc cggcatcgcc cgtaatatgg gattcgcctc attaggtttt 1860

atcccggatg aggggtggta cgccggaaca gacgttcggt atatgggcga tatcatggcc 1920

aatgatgaaa ataccgccaa agcgccttcg tataccgttg ttggactaaa tacagggtat 1980

aaatttaatt acagtcagct taccgtcgat atttttgggc gggtagataa tctatttgat 2040

gaagaatata tcggttcggt gatcgttaat gaatctaatg gccgatatta tgagccagcg 2100

ccagggcgta actatggcgt ggggattaat ctggcatggc aatttgaaca ccaccaccac 2160

caccactga 2169

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 3

gtcgcggatc cgaattcgcc agcgcgccca atgaacaaa 39

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 4

gcaagcttgt cgacgttatt caaattgcca tgcc 34

Claims

1.一种伤寒沙门菌疫苗重组蛋白，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的伤寒沙门菌疫苗重组蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求2或3所述的基因。

5.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求4所述的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌。

7.一种制备伤寒沙门菌疫苗重组蛋白的方法，其特征在于，包括：

构建yncD表达质粒，对yncD表达质粒诱导表达和纯化；

其中，所述构建yncD表达质粒采用如SEQ ID NO.3和如SEQ ID NO.4所示的引物做PCR，获得yncD基因全序列，连接到表达质粒，得到重组质粒；所述对yncD表达质粒诱导表达包括将所述重组质粒在大肠杆菌BL21中进行诱导表达7。

8.权利要求1所述的伤寒沙门菌疫苗重组蛋白、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的重组载体、权利要求5或6所述的重组菌株，以及权利要求7所述的制备伤寒沙门菌疫苗重组蛋白的方法在制备用于预防伤寒沙门菌感染的疫苗中的应用。

9.一种用于预防伤寒沙门菌感染的疫苗，其特征在于，所述疫苗含有权利要求1所述的伤寒沙门菌重组蛋白作为活性成分；

优选地，所述疫苗还含有药学上可接受的佐剂。

10.一种药物，其特征在于，所述药物含有权利要求1所述的伤寒沙门菌重组蛋白作为活性成分；

优选地，所述药物还含有药学上可接受的佐剂。