CN111635940A

CN111635940A - 用于宫颈癌检测、筛查、分型、诊断或预后评估的试剂盒及药物组合物

Info

Publication number: CN111635940A
Application number: CN202010495739.XA
Authority: CN
Inventors: 王思贤
Original assignee: Individual
Current assignee: Beijing Huahan Gene Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2020-06-03
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2040-06-03
Also published as: CN111635940B

Abstract

本发明提供一种用于宫颈癌检测、筛查、分型、诊断或预后评估的试剂盒，所示试剂盒包括用于检测CLEC14A基因甲基化水平的试剂。本发明的试剂盒不论是对宫颈癌肿瘤还是高级别病变都显示优异的灵敏度和特异性，其对HSIL+样本的阳性预测值为80％，阴性预测值为92.6％，诊断符合率为88.3％，相比现有的筛查方式，不但极大提高了宫颈高级病变筛查的准确性，也能极大的降低临床过诊的风险。

Description

用于宫颈癌检测、筛查、分型、诊断或预后评估的试剂盒及药物组合物

技术领域

本发明涉及本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种用于宫颈癌检测、筛查、分型、诊断或预后评估的试剂盒及药物组合物。

背景技术

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，近十年来宫颈癌的发病率和死亡率稳步上升，而且呈年轻化趋势。2018年，中国新发宫颈癌病例约13.1万，死亡5.3万例，严重威胁着中国女性的生命和健康，高危型HPV的持续感染是宫颈癌发生的必要条件，宫颈癌是目前唯一病因清楚的肿瘤，也是人类有望消灭的第一个癌症，WHO指出一级预防(疫苗)加二级预防(筛查)是宫颈癌预防的最佳策略。一级预防指疫苗的接种，目前最新的疫苗为9价疫苗，其覆盖型别有限，约30％的宫颈癌目前疫苗未覆盖，适用年龄限制及经济条件所限，加之疫苗的副作用，疫苗我国普遍推广还需时日，中国子宫颈癌综合防控指南指出即便接种了疫苗的人群仍然要定期进行宫颈癌的筛查。

我国自2009年开始推行宫颈癌筛查，至今仍没有统一的筛查指南，多参考欧美国家的指南，筛查方法以细胞学检测和HPV为主，细胞学方法有巴氏涂片发展到液基细胞学，假阴性率高，结果受主观判断影响较大，而HPV检测结果客观性强，但阳性预测值稍差，两种方法造成的漏诊、过诊均给临床带来很大的困扰。临床迫切需要有新的筛查方法出现，DNA甲基化是一种DNA序列以外的基因调控机制，在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，一些研究表明，病毒或患者基因特定基因CpG的甲基化水平和癌前病变的严重成度相关。在肿瘤发生的早期便会出现一些基因的异常甲基化，使其可能成为宫颈癌病变早期的标志物，寻找灵敏度高、特异性好的甲基化标志物成为了宫颈癌早期防治的研究热点。

虽然现在报道宫颈癌相关的甲基化基因超过100个，接近20个有不同的文献报道，CIN2+中高甲基化各研究一致的有10个基因，其中最多的是CADM1,EPB41L3,FAM19A4,MAL,miR-124,PAX1和SOX1，临床设计严谨的报道中，其检测的灵敏度(低于90％)、特异性(50-70％)和阳性预测值(20-50％)都不十分令人满意。

宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)是与宫颈癌的发生密切相关的宫颈病变，根据病变细胞侵入上皮细胞的深度以及细胞核的形态的不同，按严重程度从轻到重将CIN分为3级(CIN I、CINⅡ、CINⅢ或CIN1,CIN2和CIN3)，CIN也有称鳞状细胞内病变(squamous intraepithelial lesion，SIL)，低级别的病变(low grade SIL，LSIL)对应CIN1，高级别病变(high grade SIL，HSIL)对应CIN2/3,CIN进展成浸润癌是一个缓慢的过程，而且转归的可能性很高，CIN 1患者中有60％会转归或消失，43％的CIN2和32％的CIN 3的患者会转归或消失，CIN 2和CIN 3有发展成宫颈癌的风险，也被称为癌前病变宫颈癌筛查的主要目的是及早发现高级别病变并进行干预，阻止病变向肿瘤发展而达到预防宫颈癌的目标。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供一种用于宫颈癌检测、筛查、分型、诊断或预后评估的试剂盒，所示试剂盒包括用于检测CLEC14A基因甲基化水平的试剂。

在一种实施方式中，所述试剂盒是焦磷酸测序法试剂盒、重亚硫酸盐转化测序法试剂盒、甲基化芯片试剂盒、qPCR试剂盒、数字PCR试剂盒、二代测序试剂盒、三代测序试剂盒、全基因组甲基化测序试剂盒、DNA富集检测试剂盒、简化亚硫酸氢盐测序试剂盒、HPLC试剂盒、MassArray试剂盒、甲基化特异PCR试剂盒、或它们的组合。

在一种实施方式中，所述试剂盒是用于检测CLEC14A基因启动子区甲基化水平的试剂盒。

在一种实施方式中，所述试剂盒是在检测甲基化同时检测甲基化DNA所占比例的试剂盒。

在一种实施方式中，所述试剂盒是PCR试剂盒，其包括两条Taqman MGB探针和一对扩增引物，两条探针标记不同的荧光基团，一条结合甲基化序列，另一条结合未甲基化序列，在所述一对引物扩增的条件下，通过不同的荧光信号来判断该CpG位点的甲基化情况。

在一种实施方式中，甲基化DNA所占的比例为：甲基化DNA/(甲基化DNA+未甲基化DNA)＝1/(1+1/2-ΔCt)×100％，其中ΔCt＝Ct(甲基化)-Ct(未甲基化)。

在一种实施方式中，所述一对引物的上游引物是SEQ ID NO.1:TTATTTGTGTAAGTATTAGTTTGAGGTTTT，下游引物是SEQ ID NO.2:ATCCCAAATAAACTAAAATCCAAAAC；两条探针分别是SEQ ID NO.3：TGTGTTTTGGGGTT和SEQ IDNO.4：TCGCGTTTCGGGGTC。

在一种实施方式中，本发明提供一种用于宫颈癌预防和/或治疗的药物组合物，所述组合物包括能够抑制CLEC14A基因甲基化水平的分子。

本发明评估了CLEC14A基因甲基化基因对肿瘤和HSIL+样本的检测能力，结果显示，不论是对宫颈癌肿瘤还是高级别病变(HSIL+)都显示优异的灵敏度(分别为100％和84.5％)和特异性(分别为84.2％和90.1％)，其对HSIL+样本的阳性预测值为80％，阴性预测值为92.6％，诊断符合率为88.3％，相比现有的筛查方式，不但极大提高了宫颈高级病变筛查的准确性，也能极大的降低临床过诊的风险。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本发明检测CLEC14A基因甲基化的检测原理示意图；

图2是本发明检测不同样本的CLEC14A基因甲基化比例结果图；和

图3是本发明检测不同样本的CLEC14A基因甲基化ROC结果图，其中图3A是肿瘤VSHSIL+LSIL+正常样本ROC结果图，3B是肿瘤+HSIL VS LSIL+正常样本ROC结果图。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。以下实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种化学试剂，均为市售产品。

一、材料和方法

1.实验材料

1.1.实验试剂及耗材

1.2.实验设备及仪器

1.3.临床样本

临床样本细胞病变程度由病理诊断确定，正常样本为无任何临床症状，TCT及高危型HPV检测阴性，HSIL(CIN2及CIN3)样本51例，LSIL(CIN1)样本62例，正常样本90例，20例肿瘤样本，所有样本为宫颈脱落细胞。

1.4.引物及探针序列

引物探针设计的主要目的是区分检测选定CpG位点的甲基化和未甲基化状态，进行引物探针设计的DNA模板为经过亚硫酸盐处理转化后形成的新的DNA序列，DNA经过亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶(C)转变成尿嘧啶(U)，经过PCR扩增后，转变成胸腺嘧啶(T)，原来的互补配对的双链DNA不再配对，形成两条单链，DNA链的复杂度下降，CG含量下降，AT含量增加，增加有引物探针设计的难度。

参见图1，为了在检测甲基化同时检测甲基化DNA所占的比例，我们设计采用共同的引物进行扩增，避免不同引物的扩增差异，用taqma探针来区分检测(如图)。引物设计在不含CpG的区域内，对目标的甲基化CpG位点，设计两条Taqman MGB探针，标记不同的荧光基团，一条结合甲基化序列，一条结合未甲基化序列，在一对引物扩增的条件下，通过不同的荧光信号来判断该CpG位点的甲基化情况。据此，针对CLEC14A基因启动子区设计引物和探针。

表1 CLEC14A基因启动子区设计引物和探针

1.5分析软件

SPSS Statistics(IBM Corp.,Armonk,NY,USA)

2.实验方法

2.1 DNA提取和定量

见试剂盒说明

2.2 DNA亚硫酸氢盐转化及纯化

见试剂盒说明

2.3荧光PCR检测

表2荧光PCR体系配置

荧光通道：FAM，VIC双通道(无ROX校正)

分析条件：基线值和阈值的设定均使用默认设置。

根据荧光PCR的Ct值来计算样本中甲基化DNA的比例，检测结果中有三种情况：

(1)当仅有FAM通道出现扩增荧光信号，DNA中甲基化比例为100％；

(2)当仅有VIC通道出现扩增荧光信号，DNA中甲基化比例为0％；

(3)当FAM和VIC都有扩增荧光信号时，采用公式计算甲基化比例：

甲基化DNA/(甲基化DNA+未甲基化DNA)＝1/(1+1/2^-ΔCt)×100％，

其中ΔCt＝Ct_(甲基化)-Ct_{(未甲基化)}

二、结果与分析

1.样本荧光PCR检测结果

参见图2，所有样本检测结果正常，51例HSIL样本中检出甲基化样本46例，占90.2％，63例LSIL样本中检出甲基化样本48例，占77.4％，正常样本中有2例检测出甲基化，20例肿瘤样本全部检测甲基化，正常样本、LSIL样本、HSIL样本和肿瘤样本中甲基化比例平均值分别为0.2％、4.6％、32.3％和51.5％。肿瘤样本全部检出较高水平的甲基化，HSIL样本中有一定比例未检出甲基化，这可能和病理判断HSIL的原则有关，病理上将CIN2和CIN3都归为高级别病变，而临床中CIN2判断的一致性不高，本着就高不就低的诊断原则，有部分可能的低级别病变也会归为高级别病变。

表3样本荧光PCR检测结果

表中：L代表LSIL、HSIL样本，C代表宫颈癌和N代表正常样本

2.临床筛查价值的评估

参见图3，研究甲基化检测对肿瘤的检测能力，肿瘤样本定义病变，将LSIL、HSIL和正常样本定义为正常样本，采用SPSS软件做ROC曲线分析，AUC曲线下面积为0.916，甲基化参考值设为15.95％时，对肿瘤的检测灵敏度为100％，特异性为84.2％，然后研究对高级别病变的检测能力，将肿瘤和HSIL样本定义为高级别病变(HSIL+)，LSIL和正常样本定义为正常样本，AUC曲线下面积为0.924，甲基化参考值定为6.85％时，对高级别病变检测灵敏度84.5％，特异性90.1％。甲基化检测无论对肿瘤样本还是高级别病变样本都有很好的检测性能。

以病理结果HSIL+为阳性，其他结果为阴性分析甲基化检测的阴性预测值和阳性预测值，CLEC14A甲基化检测阳性预测值为80％，阴性预测值为92.6％，诊断符合率为88.3％。

表4甲基化检测对肿瘤及高级别病变检测灵敏度和特异性

表5样本检测符合率统计表

3.结果分析

发明人研究采用不同的临床样本(正常、LSIL、HSIL和肿瘤样本)检测了CLEC14A基因的CpG位点的甲基化情况，发现该位点的甲基化程度随着病变程度的增加而增加，提示该位点的甲基化程度和宫颈癌的进展密切相关，CLEC14A是内皮特异性的单次跨膜糖蛋白，最初是通过免疫组化发现在肿瘤中表达而正常组织中基本不存在而提出可能是肿瘤的潜在标志物，不过随后在小细胞肺癌研究中发现，CLEC14A基因的甲基化和蛋白的表达密切相关，肿瘤相比正常组织，蛋白量显著下降。本发明首次发现CLEC14A和宫颈癌的进展有关，检索文献未发现有CLEC14A基因与宫颈癌相关研究报道，有动物实验表明，CLEC14A有抗肿瘤的作用，可以抑制细胞分化，迁移和促进细胞凋亡，肺癌组织中，CLEC14A基因启动子区高度甲基化，蛋白表达下降，细胞实验表明，通过抑制甲基化水平，可以阻止细胞复制，促进凋亡，迁移能力下降，甚至可以使细胞停留在G0/G1期。结合已有的研究数据，CLEC14A基因和宫颈癌的发生有关。

宫颈癌筛查目前临床的主要手段为TCT和HPV检测，2016年，赵超等评估TCT和高危型HPV检测的临床筛查价值，两者对HSIL+的样本阳性预测值分别为28.88％和28.7％，阴性预测值分别为83.09％和80.33％，灵敏度和特异性为77.4％、87.66％和36.71％、18.79％。诊断符合率仅为46.86％和37.5％，TCT和高危型HPV联合检测阳性预测值提高到31.87％，阴性预测值为95.28％，诊断符合率也仅40.02％。研究结果和国外文献报道数据基本一致，不论是TCT还是HPV检测，较低的阳性预测值和特异性导致的临床过诊问题严重，甲基化标志物被认为是解决此问题的潜在方案，也有很多甲基化位点被发现，但大多临床性能并未能满足临床要求，国内研究最多的PAX1基因，对HSIL+的检测灵敏度仅54％。

本发明评估了CLEC14A基因甲基化基因对肿瘤和HSIL+样本的检测能力，结果显示，不论是对肿瘤还是高级别病变(HSIL+)都显示优异的灵敏度(分别为100％和84.5％)和特异性(分别为84.2％和90.1％)，其对HSIL+样本的阳性预测值为80％，阴性预测值为92.6％，诊断符合率为88.3％，相比现有的筛查方式，不但极大提高了宫颈高级病变筛查的准确性，也能极大的降低临床过诊的风险。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

序列表

<110> 王思贤

<120> 用于宫颈癌检测、筛查、分型、诊断或预后评估的试剂盒及药物组合物

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttatttgtgt aagtattagt ttgaggtttt 30

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcccaaata aactaaaatc caaaac 26

<210> 3

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtgttttgg ggtt 14

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgcgtttcg gggtc 15

Claims

1.一种用于宫颈癌检测、筛查、分型、诊断或预后评估的试剂盒，其特征在于，所示试剂盒包括用于检测CLEC14A基因甲基化水平的试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是焦磷酸测序法试剂盒、重亚硫酸盐转化测序法试剂盒、甲基化芯片试剂盒、qPCR试剂盒、数字PCR试剂盒、二代测序试剂盒、三代测序试剂盒、全基因组甲基化测序试剂盒、DNA富集检测试剂盒、简化亚硫酸氢盐测序试剂盒、HPLC试剂盒、MassArray试剂盒、甲基化特异PCR试剂盒、或它们的组合。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是用于检测CLEC14A基因启动子区甲基化水平的试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是在检测甲基化同时检测甲基化DNA所占比例的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是PCR试剂盒，其包括两条Taqman MGB探针和一对扩增引物，两条探针标记不同的荧光基团，一条结合甲基化序列，另一条结合未甲基化序列，在所述一对引物扩增的条件下，通过不同的荧光信号来判断该CpG位点的甲基化情况。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，甲基化DNA所占的比例为：甲基化DNA/(甲基化DNA+未甲基化DNA)＝1/(1+1/2^-ΔCt)×100％，其中ΔCt＝Ct_(甲基化)-Ct_{(未甲基化)}。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述一对引物的上游引物是SEQ IDNO.1:TTATTTGTGTAAGTATTAGTTTGAGGTTTT，下游引物是SEQ ID NO.2:ATCCCAAATAAACTAAAATCCAAAAC；两条探针分别是SEQ ID NO.3：TGTGTTTTGGGGTT和SEQ IDNO.4：TCGCGTTTCGGGGTC。

8.一种用于宫颈癌预防和/或治疗的药物组合物，其特征在于，所述组合物包括能够抑制CLEC14A基因甲基化水平的分子。