CN111575264B

CN111575264B - 一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶及其应用

Info

Publication number: CN111575264B
Application number: CN202010527461.XA
Authority: CN
Inventors: 常耀光; 张玉莹; 薛长湖; 申晶晶; 陈广宁; 唐庆娟; 张恬恬
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2020-06-11
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2040-06-11
Also published as: CN111575264A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶及其应用。所述紫菜多糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1以及经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有1中酶活性的，由1所衍生的酶。本发明的紫菜多糖酶能够以内切方式降解紫菜多糖，该酶对于经典的紫菜多糖结构片段以及甲基化的紫菜多糖结构片段均具有高效的催化能力；通过控制加酶量或反应时间等条件，可快速降解紫菜多糖生成分子量为1kDa‑171kDa的不同分子量紫菜多糖及寡糖。

Description

一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶及其应用。

背景技术

紫菜具有可食用性且营养价值高，是我国大规模养殖的重要经济红藻之一。紫菜多糖存在于紫菜细胞壁及细胞间隙中，是紫菜的主要多糖组分，含量约占紫菜干重的40％。紫菜多糖具有丰富的生理调节功能，其巨大的应用潜力被广泛认可。紫菜多糖结构主要由(1-4)-O-α-l-吡喃半乳糖-6-硫酸基残基(L6S)及(1-3)-O-β-d-吡喃半乳糖残基(G)交替连接组成。与自然界中其他多糖相似，紫菜多糖的结构也被证实具有高度异质性，其结构中含有琼脂糖单元的取代；此外，紫菜多糖结构中的G残基往往被甲基化修饰，且修饰程度高达50％。

紫菜多糖的分子量大，生物利用度低；其粘度高，在分离纯化过程中难分离、产品后处理繁琐，导致其产品纯度及得率低。由紫菜多糖降解得到的低分子量紫菜多糖及寡糖具有粘度低、水溶性好、生物利用率高等特点，是潜在的功能食品因子，在食品、医药行业中展现出良好的应用前景。

酶法降解获取低分子量紫菜多糖及寡糖符合目前绿色清洁生产的发展趋势。紫菜多糖酶是一类可特异性降解紫菜多糖的水解酶，其断裂糖链中的β-1,4糖苷键，生成低分子量紫菜多糖及寡糖。糖苷水解酶的高度特异性以及多糖结构的异质性，意味着多糖的完全转化需要特异性不同的水解酶。对于甲基化程度可高达50％的紫菜多糖而言，能够容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶对于紫菜多糖的完全转化至关重要。而在目前的研究报道中，仅有一种野生型紫菜多糖酶(来源菌株：Pseudoalteromonas atlantica T6c)被证实能够在切割位点处容受甲基化半乳糖，即能够降解甲基化糖链结构。野生酶需要在紫菜多糖底物的诱导下才可产生紫菜多糖酶，酶的制备成本高、纯化难度大，且产酶总量低、活力低，难以用于低分子量紫菜多糖及寡糖的大规模生产应用中。分子克隆可以依据基因实现酶的高效表达及大量获取，是解决以上问题的理想策略。实现产酶序列的克隆表达可为酶法降解紫菜多糖提供工具，为低分子量紫菜多糖及寡糖的大规模生产应用提供前提。

发明内容

本发明要解决的技术问题是野生型容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶产量低、活力低、纯化难度大，产酶菌株需在紫菜多糖底物的诱导下才可产酶，致使酶的制备成本高，而且紫菜多糖的完全转化也缺少关键的工具酶。

为解决上述问题，本发明从Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127^T菌株中发掘得到一条基因，其原始核苷酸编码290个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用Signal P软件预测1-21位氨基酸为信号肽序列，利用ExPASy软件预测其理论分子量为35.5kDa。根据序列比对发现此酶与目前已知紫菜多糖酶的相似性最高仅为31％，所以此酶为一种序列新颖的酶。以此为基础提供一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶的基因及其应用，从而突破该类酶的高效获取及实际应用、紫菜多糖的完全转化、低分子量紫菜多糖及寡糖规模化制备的关键瓶颈。

为达到上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1以及经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有1中酶活性的，由1所衍生的酶。

SEQ ID NO.1：

MKTKYFYFLIFLVLLSNTMFAQELTIPPKKYVDSVKIESAVNRINNSYPLSDQQNSKKWKLLKEVSDEFNGDKLNTILWFPNNPKWKGRPPTFFHDSNVKIENDELVIRVNQHGKDSLPKYFTHSTGFIKSKNKFLYGYFEAECKLMDAPWVSGFWMTNAGKDWWTEIDICENAPGVSYNRHDLNSNIHVFKSPKEQGNIKKHFSRTKKYYFPKELQADYHVWGLEWTAKYIRFYIDGVLFREAENTHWHQPLEVNFNCESNKWFGALPDNNRLDGEFHVKYFRAWKLTK

该酶与其他已知酶的序列相似度最高仅为31％(与来源于Zobelliagalactanivorans Dsij^T的PorB相似度最高)，为一种序列新颖的酶。利用MEGA6将该酶与CAZy数据库中的GH16家族已性质研究的序列构建系统发育树，结果如图6所示：可以看出该酶处于GH16家族的系统发育树中，与经典的紫菜多糖酶的进化分支相邻，并且形成了单独的进化分支。因此，本发明中的紫菜多糖酶是GH16家族的一个新成员。

一种编码上述容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶的基因，其核苷酸序列为SEQ IDNO.2及可翻译出SEQ ID NO.1的所有基因。

SEQ ID NO.2：

ATGAAAACAAAATATTTTTATTTTCTCATATTTTTAGTGCTTTTATCTAATACAATGTTTGCACAAGAGTTAACAATTCCTCCCAAAAAATATGTGGATTCTGTTAAAATTGAATCTGCAGTAAATAGAATAAACAATAGTTATCCATTGTCAGATCAGCAAAACTCAAAAAAGTGGAAATTGTTAAAAGAGGTGTCAGATGAGTTTAATGGGGATAAATTAAATACAATTCTATGGTTTCCCAATAATCCTAAATGGAAAGGAAGGCCACCTACTTTTTTTCATGACTCTAATGTAAAGATAGAAAATGATGAATTAGTTATTCGGGTAAATCAACATGGTAAAGATTCTTTGCCAAAATATTTTACACATTCTACAGGGTTTATAAAAAGTAAAAATAAATTCTTATACGGTTATTTTGAAGCTGAATGTAAATTAATGGATGCTCCTTGGGTGTCTGGTTTTTGGATGACCAATGCAGGTAAAGATTGGTGGACAGAAATAGACATATGCGAAAATGCACCAGGAGTATCATACAATCGTCATGATCTAAATTCAAATATCCATGTTTTTAAATCTCCTAAAGAACAAGGAAACATAAAAAAACATTTTTCACGAACTAAAAAATATTATTTTCCAAAGGAGTTACAAGCAGATTATCATGTTTGGGGATTGGAATGGACAGCCAAATACATTCGTTTTTATATTGATGGCGTTTTATTTCGTGAGGCAGAAAATACCCATTGGCATCAGCCTTTAGAAGTTAATTTTAATTGTGAATCAAACAAATGGTTTGGTGCTTTACCAGATAACAATCGATTAGATGGTGAATTTCACGTAAAGTATTTTAGAGCTTGGAAACTAACAAAATAA

本发明提供了一种上述容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶的制备方法，将酶异源表达在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母等体系中，通过诱导产酶即可大量制备紫菜多糖酶。上述的容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶成功异源表达在了大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母等体系中可用于大量生产、制备目标酶，且在毕赤酵母表达体系中的表达活力最高，可有效地应用于食品工业、化学分析等领域。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明的紫菜多糖酶基因可以通过克隆表达的方式实现容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶的高效制备。

(2)本发明的紫菜多糖酶能够以内切方式降解紫菜多糖，该酶对于经典的紫菜多糖结构片段以及甲基化的紫菜多糖结构片段均具有高效的催化能力；通过控制加酶量或反应时间等条件，可快速降解紫菜多糖生成分子量为1kDa-171kDa的不同分子量紫菜多糖及寡糖。

附图说明

图1：本发明的紫菜多糖酶编码基因PCR扩增后的核酸电泳图谱；

图2：本发明的紫菜多糖酶的最适反应条件示意图；

图3：本发明的紫菜多糖酶的降解终产物提取离子流色谱图；

图4：本发明的紫菜多糖酶在控制加酶量的条件下产生不同分子量的紫菜多糖的示意图；

图5：本发明的紫菜多糖酶在控制反应时间的条件下产生不同分子量的紫菜多糖的示意图；

图6：本发明的紫菜多糖酶的系统发育分析图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：紫菜多糖酶在大肠杆菌中的异源表达

在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127^T直至对数末期并提取全基因组DNA，根据目的基因设计上下游引物，以全基因组为模板进行PCR，PCR反应条件为：95℃3min，95℃20s，42℃22s，72℃60s，22个循环，最后72℃持续5min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并切胶回收纯化得到了紫菜多糖酶基因片段(如图1)。将目的基因片段连接至pET-28a(+)载体，构成重组质粒。将重组质粒导入BL21(DE3)感受态细胞中构成重组菌株。在含卡那霉素的LB培养基中利用异丙基硫代半乳糖苷进行诱导表达，诱导温度为17℃，诱导时间为12h。离心收集菌体，加入一定量的20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)缓冲液悬浮，然后在冰水浴中进行超声破碎(功率400W，工作2s，间隙6s，循环99次)，离心收集上清，此即为紫菜多糖酶的粗酶液。

实施例2：紫菜多糖酶在枯草芽孢杆菌中的异源表达

在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127^T直至对数末期并提取全基因组DNA，根据目的基因设计上下游引物，以全基因组为模板如实施例1进行PCR，得到紫菜多糖酶基因片段，连接至pHT01载体，构成重组质粒。将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆并利用异丙基硫代半乳糖苷在LB培养液中进行诱导表达，诱导温度为37℃，诱导时间为12h。离心收集菌体，加入一定量的20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液悬浮，然后在冰水浴中进行超声破碎(功率400W，工作2s，间隙6s，循环99次)，离心收集上清，此即为紫菜多糖酶的粗酶液。

实施例3：紫菜多糖酶在毕赤酵母中的异源表达

在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127^T直至对数末期并提取全基因组DNA，根据目的基因设计上下游引物，以全基因组为模板如实施例1进行PCR，得到紫菜多糖酶基因片段，将pPIC9K载体及目标序列同时使用EcoRI及NotI进行双酶切，并将酶切后的目的基因连接至pPIC9K载体上。将构建好的重组质粒使用SalI酶过夜酶切后回收，电泳检测线性化及未线性化质粒。将线性化质粒电转化至GS115感受态细胞中，提取单菌落进行PCR验证。将测序正确、抗生素筛选后的单克隆于YPD液体培养基中，30℃培养20h，然后接种于BMGY培养基，30℃、200rpm下摇床培养至OD600＝2.0，离心收集菌体，弃上清，用BMMY培养基重悬沉淀，29℃下200rpm用甲醇诱导培养72h。诱导结束后，离心收集上清液，即为粗酶液。

实施例4：紫菜多糖酶在多种表达体系中的活力比较

将实施例1-实施例3中50μL适当稀释的酶液分别与50μL2mg/mL紫菜多糖溶液混合35℃反应10min后，100℃灭活5min。同样使用50μL适当稀释的灭活酶液与紫菜多糖溶液混合于相同条件下反应，作为对照。使用还原糖增量法pHBH法检测实验组和对照组体系中的还原糖，计算紫菜多糖酶的酶活。1U活力定义为1min内生成1μmol还原糖的活力。利用pHBH法检测1mL发酵液在不同表达体系下的活力如下表所示：

从以上结果可以看出，本发明中的紫菜多糖酶可成功表达在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母等异源体系中，且在毕赤酵母中的表达活力最高。毕赤酵母表达体系可实现重组酶的胞外表达，且外源蛋白含量低，简化了后续重组酶的分离纯化操作，有助于其应用于保健品、食品及药物的开发与生产。

实施例5：紫菜多糖酶的生化性质

使用实施例1中大肠杆菌获得的重组酶液，进行生化性质的探究。

1)温度对酶活的影响

最适反应温度：将适量酶液与紫菜多糖底物溶液混合，混匀后置于15℃-60℃温度下反应10min，于100℃金属浴中放置5min以灭酶，pHBH法测定酶活力。温度稳定性：将纯化后的酶液于4℃、25℃、30℃、35℃及45℃分别放置24h，间隔时间取样并检测酶活力，将放置0h的酶的活力定义为100％，分析紫菜多糖酶在不同放置温度下的温度稳定性。结果表明，该酶在35℃展现出最高的酶活力，在4℃～25℃具有较好的稳定性。

2)pH对酶活的影响

缓冲体系：pH4.0-7.0：20mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；pH7.0-9.0：20mMPBS缓冲液；pH9.0-11.0：20mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

最适反应pH：以上述不同pH值的缓冲液配制紫菜多糖底物，使底物浓度为2mg/mL。使用上述不同pH值的缓冲液置换酶液原来的缓冲环境，并将相应的pH的底物与酶液混匀，于35℃反应10min，100℃金属浴5min灭酶，pHBH法测定酶活力。pH稳定性：使用上述不同pH值的缓冲液置换酶液原来的缓冲环境，并将酶液置于4℃下1h。然后将酶液的pH值调至pH7.0，按照酶活测定条件测定酶活。将未经任何处理的酶液酶活定义为100％，分析紫菜多糖酶在不同放置pH条件下的pH稳定性。结果表明，该酶在pH7.0时具有最该的酶活力，在pH5.0-7.0的范围内活力保持稳定。

3)金属离子及有机试剂对酶活的影响

将酶解反应中添加有机试剂和金属离子，然后计算相对残余酶活，结果详见下表。Hg²⁺、SDS能够显著抑制酶活；二价金属阳离子Mg²⁺能显著提高酶活，并且对酶活的促进作用在5mM时更为显著。Ca²⁺、EDTA·Na₂、β-巯基乙醇在盐离子浓度为1mM对酶活无显著影响，而在5mM时均能明显提高酶活。此外，Mn²⁺对酶活无显著影响。

实施例6：液质联用分析紫菜多糖酶降解终产物

使用实施例1中大肠杆菌获得的重组酶液，加入至100mg2mg/mL紫菜多糖底物(pH7.0水溶液溶解)中，并添加pH 7.0的水溶液将反应体系补足至100mL，于25℃反应12h，100℃金属浴5min以灭酶，得到降解终产物，以0.22μm水系微孔滤膜过滤，待用。利用ThermoScientific Q-Exactive Orbitrap质谱仪，以Acquity UPLC BEH 125SEC色谱柱，进行产物的液质联用分析。如图3所示，质谱分析结果表明，降解产物主要由两种二糖产物构成：紫菜二糖以及甲基化紫菜二糖；同时含有少量的六糖；此外，产物中紫菜二糖构成的连续片段以及甲基化紫菜二糖构成的连续片段均被完全降解，证明该酶对于典型的紫菜多糖结构片段以及甲基化的紫菜多糖结构片段具有高效的催化能力。目前已经报道的已知序列结构的紫菜多糖酶均不能在切割位点处容受甲基化半乳糖，这一特点限制了此类酶对于紫菜多糖的完全降解。相较之下，本研究的紫菜多糖酶的催化特点有利于紫菜多糖的完全转化。我国每年约有10％的紫菜因口感差且售价低廉被放弃采收，导致污染海域。以这部分紫菜为原料提取紫菜多糖并进行生物乙醇的生产，不仅符合可再生能源的要求，而且能够促进低值紫菜的高值化利用。紫菜多糖的完全转化是进行生物乙醇生产的前提条件，因此本发明的紫菜多糖酶对于紫菜及紫菜多糖的利用具有重要意义。

实施例7：通过控制加酶量可制备不同分子量的紫菜多糖

向紫菜多糖溶液中加入实施例1大肠杆菌体系所获得的重组酶，按照1g底物(2mg/mL)对应于1U、2U、4U、6U、8U、10U重组酶的比例进行反应。35℃反应1h后分别取500μL灭活。利用凝胶柱Shodex OHpak LB-806M柱连接示差检测器及多角度激光光散射检测器(HPSEC-MALLS法)监测紫菜多糖的分子量，流动相为pH7.4、含10mM PBS的0.15M NaCl，流速为0.5mL/min。分子量检测结果如图4所示，随着加酶量的增大，在1h内即可获得1kDa-171kDa的不同分子量的紫菜多糖及寡糖。

实施例8：通过控制反应时间可制备不同分子量的紫菜多糖

向紫菜多糖溶液中加入实施例1大肠杆菌体系所获得的重组酶，按照1g底物(2mg/mL)对应于4U重组酶的比例进行反应。35℃反应10min、20min、30min、40min、50min、60min后分别取500μL灭活。利用上述HPSEC-MALLS法监测紫菜多糖的分子量，流动相条件同实施例7。分子量检测结果如图5所示，随着反应时间的延长，在1h内即可获得5kDa-171kDa的不同分子量的紫菜多糖及寡糖。

综合实施例7-8，通过控制加酶量或反应时间，可制备出1kDa-171kDa的不同分子量的紫菜多糖及寡糖。不同分子量的的紫菜多糖及寡糖为紫菜多糖的构-效关系研究奠定了基础。

最后需要说明，以上实施例虽然描述了本发明的具体实施方式，但是并非限制本发明；本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书所限定的。而一切进行修改或等同替换，其均应包含在本发明的保护范围内。

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序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶及其应用

<130> 中国海洋大学

<140> 1

<141> 2020-06-09

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 290

<212> PRT

<213> Wenyingzhuangia fucanilytica CZ1127T

<400> 1

Met Lys Thr Lys Tyr Phe Tyr Phe Leu Ile Phe Leu Val Leu Leu Ser

1 5 10 15

Asn Thr Met Phe Ala Gln Glu Leu Thr Ile Pro Pro Lys Lys Tyr Val

20 25 30

Asp Ser Val Lys Ile Glu Ser Ala Val Asn Arg Ile Asn Asn Ser Tyr

35 40 45

Pro Leu Ser Asp Gln Gln Asn Ser Lys Lys Trp Lys Leu Leu Lys Glu

50 55 60

Val Ser Asp Glu Phe Asn Gly Asp Lys Leu Asn Thr Ile Leu Trp Phe

65 70 75 80

Pro Asn Asn Pro Lys Trp Lys Gly Arg Pro Pro Thr Phe Phe His Asp

85 90 95

Ser Asn Val Lys Ile Glu Asn Asp Glu Leu Val Ile Arg Val Asn Gln

100 105 110

His Gly Lys Asp Ser Leu Pro Lys Tyr Phe Thr His Ser Thr Gly Phe

115 120 125

Ile Lys Ser Lys Asn Lys Phe Leu Tyr Gly Tyr Phe Glu Ala Glu Cys

130 135 140

Lys Leu Met Asp Ala Pro Trp Val Ser Gly Phe Trp Met Thr Asn Ala

145 150 155 160

Gly Lys Asp Trp Trp Thr Glu Ile Asp Ile Cys Glu Asn Ala Pro Gly

165 170 175

Val Ser Tyr Asn Arg His Asp Leu Asn Ser Asn Ile His Val Phe Lys

180 185 190

Ser Pro Lys Glu Gln Gly Asn Ile Lys Lys His Phe Ser Arg Thr Lys

195 200 205

Lys Tyr Tyr Phe Pro Lys Glu Leu Gln Ala Asp Tyr His Val Trp Gly

210 215 220

Leu Glu Trp Thr Ala Lys Tyr Ile Arg Phe Tyr Ile Asp Gly Val Leu

225 230 235 240

Phe Arg Glu Ala Glu Asn Thr His Trp His Gln Pro Leu Glu Val Asn

245 250 255

Phe Asn Cys Glu Ser Asn Lys Trp Phe Gly Ala Leu Pro Asp Asn Asn

260 265 270

Arg Leu Asp Gly Glu Phe His Val Lys Tyr Phe Arg Ala Trp Lys Leu

275 280 285

Thr Lys

290

<210> 2

<211> 873

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaaacaa aatattttta ttttctcata tttttagtgc ttttatctaa tacaatgttt 60

gcacaagagt taacaattcc tcccaaaaaa tatgtggatt ctgttaaaat tgaatctgca 120

gtaaatagaa taaacaatag ttatccattg tcagatcagc aaaactcaaa aaagtggaaa 180

ttgttaaaag aggtgtcaga tgagtttaat ggggataaat taaatacaat tctatggttt 240

cccaataatc ctaaatggaa aggaaggcca cctacttttt ttcatgactc taatgtaaag 300

atagaaaatg atgaattagt tattcgggta aatcaacatg gtaaagattc tttgccaaaa 360

tattttacac attctacagg gtttataaaa agtaaaaata aattcttata cggttatttt 420

gaagctgaat gtaaattaat ggatgctcct tgggtgtctg gtttttggat gaccaatgca 480

ggtaaagatt ggtggacaga aatagacata tgcgaaaatg caccaggagt atcatacaat 540

cgtcatgatc taaattcaaa tatccatgtt tttaaatctc ctaaagaaca aggaaacata 600

aaaaaacatt tttcacgaac taaaaaatat tattttccaa aggagttaca agcagattat 660

catgtttggg gattggaatg gacagccaaa tacattcgtt tttatattga tggcgtttta 720

tttcgtgagg cagaaaatac ccattggcat cagcctttag aagttaattt taattgtgaa 780

tcaaacaaat ggtttggtgc tttaccagat aacaatcgat tagatggtga atttcacgta 840

aagtatttta gagcttggaa actaacaaaa taa 873

Claims

1.一种容受甲基化半乳糖的紫菜多糖酶在酶解紫菜多糖中的应用：所述紫菜多糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，以内切方式降解紫菜多糖，该酶对于经典的紫菜多糖结构片段以及甲基化的紫菜多糖结构片段均具有高效的催化能力。