CN111575230A - 肉苁蓉多糖在促进雌性生殖干细胞增殖分化方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肉苁蓉多糖在促进雌性生殖干细胞增殖分化方面的应用，具体为在体外培养体系中加入肉苁蓉多糖可以促进雌性生殖干细胞的增殖分化，尤其是提升雌性生殖干细胞体外定向分化为卵母细胞的能力，这为研究体内外卵母细胞发生能力提供了新的研究材料，同时为研究生理性不孕带来了新的希望。

Description

肉苁蓉多糖在促进雌性生殖干细胞增殖分化方面的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肉苁蓉多糖在促进雌性生殖干细胞增殖分化方面的应用。

背景技术

雌性生殖干细胞(female germline stem cell,FGSC),又称为卵巢生殖干细胞(ovarian germline stem cell,OGSC),其由原始生殖细胞(primary germ cells，PGCs)转化而来，具有能够定向分化为卵母细胞的能力，可望补充不断消耗的始基卵泡池，是生殖生物学的革命性发现。传统观点认为，哺乳动物出生后卵巢内卵子数目不会再生。女性一生有固定数目的卵子成熟排出，随着卵泡耗竭及卵巢萎缩，女性渐渐由育龄期转入绝经期从而失去生育能力。研究发现，新生小鼠及成年小鼠体内含有可再生卵子的雌性生殖干细胞，随后其存在在女性育龄期、绝经期以及卵巢早衰患者体内也得到验证。雌性生殖干细胞来源于卵巢组织，是表达生殖系标志物，并能够进行有丝分裂，且具有增殖能力的生殖细胞。若能够对其进行具有增殖和分化作用的稳定的体外培养，将对生殖细胞发生发展的基础研究及临床的不孕治疗带来深远影响。但现有技术中并未见有关肉苁蓉多糖在促进雌性生殖干细胞增殖分化方面的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种肉苁蓉多糖在促进雌性生殖干细胞增殖分化方面的应用，可以促进雌性生殖干细胞的增殖分化，尤其是可以提升雌性生殖干细胞体外定向分化为卵母细胞的能力。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种肉苁蓉多糖在促进雌性生殖干细胞增殖分化方面的应用，具体为在体外培养体系中加入肉苁蓉多糖可以促进雌性生殖干细胞的增殖分化，尤其是提升雌性生殖干细胞体外定向分化为卵母细胞的能力。

上述培养体系为常规的雌性生殖干细胞培养体系，如培养体系包括α-MEM培养基+1mM非必需氨基酸+2mM L-谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠+0.1mMβ-ME+10ng/ml LIF+10ng/ml EGF+40ng/ml GDNF+1ng/ml bFGF+10％FBS+15mg/ml青/链霉素。

当向上述培养体系中加入0.25～0.75μg/ml的肉苁蓉多糖，培养12～48h时，对雌性生殖干细胞的增殖分化均有促进作用，尤其是当加入的肉苁蓉多糖浓度为0.5μg/ml，培养时间为24h时，生殖干细胞多能性及生殖性标志基因显著增加，当培养至48h时，显著诱导FGSC的分化。

本发明提供的肉苁蓉多糖在促进雌性生殖干细胞增殖分化方面的应用，具有以下有益效果：

肉苁蓉多糖(Cistanche Deserticol Polysaccharides,CDPs)为植物肉苁蓉主要活性成分之一，是一种包含葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖等单糖缩聚而成的多糖类化合物。肉苁蓉多糖能够促进体外雌性生殖干细胞的增殖分化，即在体外培养体系中添加肉苁蓉多糖可以促进雌性生殖干细胞的增殖分化，尤其是可以提升雌性生殖干细胞体外定向分化为卵母细胞的能力。

本发明通过对肉苁蓉多糖处理后雌性生殖干细胞的转录组测序，发现与细胞增殖与分化相关的信号通路有所变化，并且干细胞生长发育的相关基因功能差异显著。同时在干细胞增殖与分化的功能中，关键基因下调显示细胞自我更新能力下降，分化能力增强。这为研究体内外卵母细胞发生能力提供了新的研究材料，同时为研究生理性不孕带来了新的希望。

附图说明

图1为小鼠雌性生殖干细胞体外培养的细胞状态图。

图2为小鼠雌性生殖干细胞体外增殖活力检测图。

图3为琼脂糖凝胶电泳检测结果图。

图4为雌性生殖干细胞免疫荧光检测结果图。

图5为肉苁蓉多糖以不同浓度和不同时间体外处理mFGSC的形态图。

图6为经肉苁蓉多糖处理后的雌性生殖干细胞增殖活力检测结果图。

图7为肉苁蓉多糖处理后的雌性生殖干细胞相关基因表达结果图。

图8为最适肉苁蓉多糖浓度0.5μg/ml浓度下体外分化的mFGSC特征图。

图9为肉苁蓉多糖实验组和Ctrl组体外培养mFGSC的特征图。

图10为mFGSC.vs.mFGSC-CDPs组差异基因功能分析图。

图11为mFGSC.vs.mFGSC-CDPs组差异基因KEGG通路富集分析图。

图12为mFGSC.vs.mFGSC-CDPs组中干细胞分化功能中下调的差异基因及其信号传导图。

具体实施方式

实施例1

1、小鼠雌性生殖干细胞的分离

(1)分离细胞前对超净台进行紫外消毒，然后将3～5天雌性小鼠断颈处死并置于超净台上，用75％酒精棉球消毒小鼠腹部；尽快将小鼠剖腹并取出双侧卵巢，将取出的卵巢置于含500ul的D-Hanks液的玻璃平皿中，平皿放在冰上冰浴；

(2)采用D-Hanks液洗涤一次卵巢后转入另一含有PBS液的平皿中，用剪刀剪碎卵巢组织，以便于下一步的酶消化；

将组织悬液用移液器吸入，用胶原酶D-Hanks液溶液冲洗35mm平皿，并转入离心管，补加胶原酶D-Hanks溶液；

(3)将15ml离心管置于37℃水浴，缓慢摇动消化20分钟至组织分散后，1000rpm离心5分钟，弃去上清；加入PBS液于离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清；

(4)加入含0.05％胰酶D-Hanks液，37℃缓慢摇动消化5分钟(至组织分散)，后加入FBS终止消化，小心移去消化后呈絮状的组织团；1000rpm离心5分钟，尽量弃去上清，不要搅动沉淀；

(5)加新鲜FGSC培养液重悬细胞，加入到铺有饲养层的孔板中，37℃培养箱中培养。

FGSC培养液的成分为：α-MEM培养基+1mM非必需氨基酸(GIBCO)+2mM L-谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠+0.1mMβ-ME+10ng/ml LIF+10ng/ml EGF+40ng/ml GDNF+1ng/ml bFGF+10％FBS+15mg/ml青/链霉素。

2、小鼠雌性生殖干细胞的纯化

采用免疫磁珠法对分离到的小鼠雌性生殖干细胞进行纯化，具体包括以下步骤：

(1)将上述分离到的小鼠雌性生殖干细胞置于1000rpm离心5分钟，弃上清，加入D-Hanks重悬细胞；在一个新的无菌离心管中加入200μl D-Hanks和4μl MVH(0.5μg/μl)一抗，混匀；将液体混匀，于振荡孵育器中以300rpm、37℃作用30分钟；

(2)将步骤(1)所得物于1000rpm离心5分钟，吸去上清液；用D-Hanks液洗一次细胞，1000rpm离心5分钟，吸去上清液，再加2μl二抗磁珠，室温培养30分钟，中途每五分钟轻轻振荡一次使二抗磁珠与一抗尽量结合充分；

(3)将离心管放在磁珠分选架上，室温静置2分钟，然后轻轻吸去所有液体；加200μl D-Hanks液到离心管中，再将离心管放在磁珠分选架上，室温静置2分钟，然后吸去所有液体，从而除去所有未与磁珠结合的细胞；

(4)加新鲜FGSC培养液重悬细胞，然后加入到铺有饲养层的孔板中，37℃培养箱中培养；培养几天后，磁珠会自动脱落，通过传代，可得到纯化的细胞。

3、小鼠雌性生殖干细胞的传代培养

(1)用移液器吸去培养板中的培养液；向培养板中加入已预热的PBS润洗细胞后吸去PBS缓冲液；向培养板中加入0.05％胰酶，于37℃细胞培养箱中或者超净台中放置1.5分钟。向培养皿中加入等体积培养液终止胰酶消化；

(2)用移液器缓缓吹打，使细胞从培养板底全部脱落；将液体转移至离心管内，1000rpm离心5分钟；用移液枪吸去管内上清液，加入新鲜的FGSC培养液，吹打管底部的细胞团，使细胞重新悬浮；

(3)用移液器将细胞悬液加入铺有STO细胞饲养层的48孔培养板中，缓慢吹打使细胞均匀分布；将培养板缓缓移入37℃细胞培养箱中培养。

小鼠雌性生殖干细胞体外培养的细胞状态图见图1。图A和图B均为放大400倍的图片，标尺长度分别为50μm和10μm。

4、小鼠雌性生殖干细胞EdU增殖活性检测

(1)选择生长状态密度合适的FGSC细胞铺入带有玻片的24孔板中，爬片4小时；待细胞贴壁后，按照EdU检测试剂盒说明书配置培养基，而后操作实验步骤，得到FGSC细胞增殖检测的免疫荧光玻片；

(2)在凹型载玻片中滴入抗荧光淬灭剂，将免疫荧光玻片倒放在载玻片中央，玻片周围封片剂封片，置于荧光显微镜下观察拍照，结果见图2，图片放大400倍，标尺长度为50μm。

5、小鼠雌性生殖干细胞的鉴定

(1)小鼠雌性生殖干细胞RT-PCR及PCR检测，步骤如下：

①取生长密度为80％左右的FGSC细胞，按照微量RNA提取试剂盒说明书操作，用微量分光光度计检测符合标准的RNA样品，将其编号备用；

②以2000ng/管为体系，将得到的RNA样本按照反转录试剂盒说明书进行反转录，得到cDNA样本；

③以PCR试剂盒说明书为依据，检测生殖干细胞标志基因Oct4，生殖细胞标志基因Mvh/Fragilis/Dazl，干细胞标志基因Stella/Blimp1/Sycp3/Gapdh；

Touchdown PCR程序如下：

④用2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，结果见图3。其中，图3包括生殖系细胞生殖性基因Mvh(228bp)/Fragilis(264bp)/Dazl(328bp)；雌性生殖干细胞基因Oct4(430bp)/Stella(354bp)/Blimp1(483bp)及分化基因Stra8(135bp)/Scp3(437bp)的表达；以及内参Gapdh的表达。泳道从左至右依次为DNA marker，卵巢(阳性对照)，雌性生殖干细胞及STO细胞(阴性对照)。

(2)雌性生殖干细胞免疫荧光检测

①在24孔板中将已爬片后的FGSC细胞玻片用PBS浸洗3次，5min/次；4％多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，5min/次；

②0.5％Triton X-100室温通透10min；吸去Triton，PBS浸洗玻片3次，5min/次；BSA室温封闭1h，不必清洗：24孔板分别加入兔来源一抗Oct4(1:400稀释)和Mvh(1:100稀释)，封口膜4℃孵育过夜；

③PBS浸洗爬片3次，5min/次，避光加入山羊抗兔荧光二抗(1:400稀释)室温湿盒孵育1h，PBS浸洗玻片3次，5min/次；

④复染核：滴加DAPI(1:1000稀释)避光孵育3min(时间随细胞质量而定)，PBS 2次洗去多余的DAPI，5min/次；载玻片上滴入抗荧光淬灭剂，取染色后玻片倒盖在载玻片上后封片，荧光显微镜下观察采集图像，结果见图4。

图4中为雌性生殖干细胞细胞Oct4和Mvh的表达，Oct4和Mvh为绿色，图片放大400倍，标尺长度为50μm。

6、肉苁蓉多糖处理雌性生殖干细胞

(1)取生长状态良好的FGSC细胞于80％～90％密度左右进行传代培养，待细胞过夜贴壁后，分别加入不同浓度肉苁蓉多糖(CDPs，购买自上海源叶生物科技公司，分析标准品，纯度大于98％)培养液(实验组)及正常FGSC培养液(对照组)，肉苁蓉多糖筛选浓度1分别为：50μg/ml，5μg/ml，0.5μg/ml；

肉苁蓉多糖培养液筛选浓度1的成分为：在FGSC培养液中加入50μg/ml CDPs(或5μg/ml CDPs或0.5μg/ml CDPs)；

(2)经过上述实验验证后确定筛选浓度1中最低浓度0.5μg/ml效果最佳，因而在此浓度基础上缩小浓度差异进一步验证，则肉苁蓉多糖筛选浓度2分别为：0.75μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml；

肉苁蓉多糖筛选浓度2的成分为：在FGSC培养液中加入0.75μg/ml CDPs(或5μg/mlCDPs或0.25μg/ml CDPs)；

(3)在肉苁蓉多糖培养液中分别培养12h，24h，36h，48h时进行相关实验检测数据，而后统计学分析。

肉苁蓉多糖以不同浓度和不同时间体外处理mFGSC的形态图见图5，图片放大100倍，标尺长度为100μm；其中图5-1为采用肉苁蓉多糖培养液筛选浓度1处理过的mFGSC的形态图；图5-2为采用肉苁蓉多糖培养液筛选浓度2处理过的mFGSC的形态图。

7、CCK8检测处理后雌性生殖干细胞增殖活力

(1)取生长状态合适的FGSC铺于96孔板中，每组细胞设置4个副孔，待细胞过夜贴壁；按照CCK8检测试剂盒说明书步骤操作，于肉苁蓉多糖处理12h，24h，36h，48h时检测OD值；

(2)得到数据后采用Graphpad prism软件进行分析和制图，结果见图6。

其中，图6-1是以从高浓度肉苁蓉多糖A到低浓度C分别处理细胞0h，12h，24h，36h和48h后的雌性生殖干细胞增殖活力结果，A组肉苁蓉浓度为50μg/ml CDPs，B组为5μg/mlCDPs，C组为0.5μg/ml CDPs，Ctrl组为对照组。由图6-1可知，C组细胞活力接近Ctrl组，A组和B组低于Ctrl组。

其中，图6-2中A组肉苁蓉浓度为0.75μg/ml CDPs，B组为0.5μg/ml CDPs，C组为0.25μg/ml CDPs，Ctrl组为对照组。

其中，A，B，C中的数据是三个实验的平均值±标准差，使用方差分析处理数据。*表示P<0.05，**表示P<0.01。

8、荧光定量PCR检测处理后雌性生殖干细胞相关基因表达

(1)取肉苁蓉多糖处理后的FGSC和正常培养的FGSC，即实验组和对照组，于培养的12h，24h，36h，48h时消化细胞后编号收集，按照微量RNA提取试剂盒说明书操作，用微量分光光度计检测符合标准的RNA样品，将其编号备用；

(2)以200ng/管为体系，将编号的RNA样本按照反转录试剂盒说明书进行反转录，得到相应的cDNA样本；

(3)按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行实验检测生殖干细胞相关基因的表达情况；得到数据后输入Graphpad prism软件分析和制图，结果见图7，其中每组柱状图从左到右分别为Ctrl组、A组、B组和C组。

图7-1为以不同肉苁蓉多糖浓度和时间处理雌性生殖干细胞后基因Oct4(A)/Ddx4(B)/Sycp3(C)的相对表达。A组肉苁蓉浓度为50μg/ml CDPs，B组为5μg/ml CDPs，C组为0.5μg/ml CDPs，Ctrl组为对照组。

图7-2为以不同浓度和时间处理雌性生殖干细胞后基因Oct4(A)/Ddx4(B)/Stra8(C)/Sycp3(D)的相对表达。A组肉苁蓉浓度为0.75μg/ml CDPs，B组为0.5μg/ml CDPs，C组为0.25μg/ml CDPs，Ctrl组为对照组。

A，B，C中的数据是三个实验的平均值±标准差，使用方差分析处理数据。*表示P<0.05，**表示P<0.01。

9、免疫荧光检测处理后雌性生殖干细胞相关蛋白表达

(1)取苁蓉多糖处理后的FGSC和正常培养的FGSC，即实验组和对照组，于培养的12h，24h，36h，48h时在24孔板中将已爬片后的FGSC细胞玻片用PBS浸洗3次，5min/次；4％多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，5min/次；

(2)0.5％Triton X-100室温通透10min；吸去Triton，PBS浸洗玻片3次，5min/次；BSA室温封闭1h，不必清洗：24孔板分别加入兔来源一抗Oct4(1:400稀释)和Mvh(1:100稀释)，封口膜4℃孵育过夜；

(3)PBS浸洗爬片3次，5min/次，避光加入山羊抗兔荧光二抗(1:400稀释)室温湿盒孵育1h,PBS浸洗玻片3次，5min/次；

(4)复染核：滴加DAPI(1:1000稀释)避光孵育3min(时间随细胞质量而定)，PBS 2次洗去多余的DAPI，5min/次；载玻片上滴入抗荧光淬灭剂，取染色后玻片倒盖在载玻片上后封片，荧光显微镜下观察采集图像。

最适肉苁蓉多糖浓度0.5μg/ml浓度下体外分化的mFGSC特征见图8；其中图8-1为雌性生殖干细胞48小时的代表性形态特征，标尺长度为50μm和10μm；图8-2为比较对照组和实验组在12h，24h，36h和48h药物处理后的细胞直径。

数据为四个实验的平均值±SEM，使用t检验分析数据，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

肉苁蓉多糖实验组和Ctrl组体外培养mFGSC的特征图见图9。其中，图9-1为免疫荧光检测肉苁蓉多糖处理48小时后FGSC细胞Oct4、Mvh和Sycp3(绿色)的表达结果图，图片放大400倍，标尺长度为50μm；图9-2为免疫荧光检测Ctrl组48小时细胞Oct4、Mvh和Sycp3(绿色)的表达，图片放大400倍，标尺长度为50μm。

本发明还通过对雌性生殖干细胞对照组及实验组的转录组测序，我们发现mFGSC对照组和mFGSC-CDPs实验组的差异基因还在细胞分化、细胞增殖、BMP信号通路、Nocth信号通路、Wnt信号通路、细胞迁移等方面具有不同的表达。同时干细胞对类固醇激素的反应及生长因子的调节具有显著变化，说明在mFGSC的发育阶段以上相关基因具有重要作用，见图10。同时，与生殖细胞发育密切相关的Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路和PI3K-Akt信号通路发生变化。同时在TGF-β家族和TNF家族中均存在与卵巢生殖细胞调节的细胞因子，见图11。

在影响干细胞分化的差异基因中有若干基因的下调，见图12-1，我们发现了两个影响雌性生殖干细胞自我更新的关键基因，Lif(Leukemia inhibitory factor)和Gdnf(Glial cell line-derived neurotrophic factor)。在PI3K/Stat3信号通路中，Lif的下调将减弱干细胞的增殖而促进其进行分化，见图12-2；同样在GDNF信号网络中，Gdnf的下调会使生殖干细胞微环境耗竭，而分化的生殖细胞则会增多，如图12-3。

上述实验过程中的结果均采用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。各组间采用方差分析或t检验分析比较。P<0.05为差异有统计学意义。

结论：

通过对雌性生殖干细胞的分离纯化和培养，该体系可以得到生长状态稳定、增殖活力良好的细胞作为后续肉苁蓉多糖处理的种子细胞，RT-PCR及PCR检测生殖干细胞多能性和生殖性标志基因Oct4，生殖系细胞生殖性标志基因Mvh/Fragilis/Dazl，以及干细胞系细胞多能性标志基因Stella/Blimp1/Sycp3，Gapdh为内参基因，均有相应阳性表达，证明该细胞生殖性和多能性的稳定；EdU免疫荧光检测FGSC细胞为阳性表达，说明该细胞增殖活力较好。通过采用不同浓度肉苁蓉多糖处理FGSC后，CCK8法检测细胞增殖显示肉苁蓉多糖筛选浓度1中0.5μg/ml组为最佳浓度，该实验组细胞增殖活力接近对照组，而浓度50μg/ml组和5μg/ml组细胞增殖活力均低于对照组；荧光定量PCR检测相关基因时显示，生殖干细胞多能性及生殖性标志基因Oct4与生殖系生殖性标志基因Mvh在肉苁蓉多糖处理12小时及36小时后显著增加，干细胞多能性标志物Sycp3在肉苁蓉多糖处理后12小时及36小时显著增加，其中综合比较以0.5μg/ml组最为显著且差异具有统计学意义。通过肉苁蓉多糖筛选浓度1的初步筛选后，以最佳浓度0.5μg/ml为基准再次设定浓度进一步对FGSC进行处理，则得到肉苁蓉多糖筛选浓度2：0.75μg/ml组，0.5μg/ml组，0.25μg/ml组，CCK8法检测实验组细胞增殖活力与对照组均有差异但数值相对接近，与上述实验结果吻合；荧光定量PCR检测结果显示生殖干细胞多能性及生殖性标志基因Oct4与生殖系生殖性标志基因Mvh在肉苁蓉多糖处理24小时后显著增加，干细胞多能性标志物Stra8和Sycp3在肉苁蓉多糖处理后24小时显著增加，其中综合比较仍以0.5μg/ml组最为显著且差异具有统计学意义；通过上述实验得到肉苁蓉多糖处理FGSC最佳浓度0.5μg/ml，则以此浓度进一步培养，于处理48小时得到已有分化的FGSC,其体外培养形态图显示FGSC直径及形态变化，免疫荧光检测干细胞多能性标志蛋白Sycp3均有阳性表达。至此，研究结果表明肉苁蓉多糖可在浓度为0.5μg/ml时，能够明显诱导FGSC的分化。细胞RNA-sequence测序显示mFGSC增殖与分化相关信号通路和干细胞生长发育差异基因功能具有显著差异，在干细胞增殖与分化功能中，关键基因Lif和Gdnf的下调表示细胞自我更新能力的下降，分化能力的提高。肉苁蓉多糖对细胞的影响将对构建体外诱导分化雌性生殖干细胞体系具有意义。

Claims (10)

1.肉苁蓉多糖在促进雌性生殖干细胞增殖分化方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在体外培养体系中加入肉苁蓉多糖以促进雌性生殖干细胞的增殖分化。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，培养体系包括：α-MEM培养基+1mM非必需氨基酸+2mM L-谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠+0.1mMβ-ME+10ng/ml LIF+10ng/ml EGF+40ng/mlGDNF+1ng/ml bFGF+10％FBS+15mg/ml青/链霉素。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，向培养体系中加入0.25～0.75μg/ml的肉苁蓉多糖，然后对雌性生殖干细胞进行培养。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，培养时间为12～48h。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，肉苁蓉多糖的加入量为0.5μg/ml，培养时间为24～48h。

7.一种促进雌性生殖干细胞增殖分化的体外培养体系，其特征在于，包括肉苁蓉多糖。

8.根据权利要求7所述的促进雌性生殖干细胞增殖分化的体外培养体系，其特征在于，肉苁蓉多糖的加入量为0.25～0.75μg/ml。

9.一种促进雌性生殖干细胞增殖分化的制剂，其特征在于，包括肉苁蓉多糖。

10.根据权利要求9所述的促进雌性生殖干细胞增殖分化的制剂，其特征在于，肉苁蓉多糖的加入量为0.25～0.75μg/ml。

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