CN111560452B

CN111560452B - 小麦TaDEP1基因转录增强顺式作用元件的鉴定及其分子标记和应用

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Publication number: CN111560452B
Application number: CN202010190191.8A
Authority: CN
Inventors: 刘磊; 赵祥祥; 赵红桃; 张国芳; 裔新; 刘福霞
Original assignee: Huaiyin Normal University
Current assignee: Huaiyin Normal University
Priority date: 2020-03-18
Filing date: 2020-03-18
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2040-03-18
Also published as: CN111560452A

Abstract

本发明公开了一种小麦TaDEP1基因转录增强顺式作用元件的鉴定及其分子标记和应用，本发明提供了如SEQ ID No.2所示的小麦TaDEP1基因转录增强顺式作用元件，以及用于鉴定TaDEP1基因转录水平的分子标记，用于特异性PCR扩增该标记的引物序列如SEQ ID No.5‑6所示。利用该转录增强元件能够提高小麦基因转录水平，可用于基因工程遗传改良目的基因转录水平；利用该标记能够方便、快速、准确地鉴定小麦TaDEP1基因转录水平，可用于分子标记辅助育种。

Description

小麦TaDEP1基因转录增强顺式作用元件的鉴定及其分子标记和应用

技术领域：

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及小麦基因转录增强顺式作用元件序列的发现及其鉴定的分子标记与方法。

背景技术：

G蛋白包含Gα、Gβ和Gγ组分。在模式植物拟南芥中，G蛋白信号通路组分参与籽粒大小调控(Xu et al.,2019)。水稻OsDEP1(dense and erect panicle 1)基因编码Gγ亚基，正向调控穗形(Huang et al.,2019)和氮肥高效利用(Sun et al.,2014)。进一步研究表明，过表达(overexpression)DEP1基因导致籽粒变大(Sun et al.,2018)，敲除(knockout)OsDEP1基因导致籽粒变小(Sun et al.,2018)。

小麦TaDEP1基因分别定位于5A，5B和5D染色体上，与水稻OsDEP1基因结构相似(张锴等，2011)。RNAi干涉降低TaDEP1基因转录水平导致小麦小穗密度下降以及小穗数减少(Huang et al.,2009)，表明该基因转录水平直接影响小麦产量。利用普通小麦品种，在TaDEP1基因编码区中开发的分子标记与产量相关性状相关不显著(刘亚男等，2013)，而对启动子区域并没有进行进一步研究。在基因进化过程中，启动子受环境筛选压力较小，存在大量序列变异，并且某些变异会导致该基因转录水平的显著差异(Liu et al.,2019；Wanget al.,2019)。在现有文献中，没有能够在TaDEP1基因启动子区域通过开发分子标记区分其转录水平高、低的报道，限制了利用TaDEP1基因改良小麦重要农艺性状的研究进程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小麦TaDEP1基因转录增强顺式作用元件。

本发明的另一目的在于提供一种与小麦TaDEP1基因转录水平相关的分子标记。

本发明的又一目的在于提供一种用于检测上述的分子标记的引物对和试剂盒。

本发明的又一目的在于提供一种检测上述的分子标记的方法。

本发明的又一目的在于提供一种小麦分子标记辅助育种方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

如SEQ ID No.2所示的小麦TaDEP1基因转录增强顺式作用元件。

GGACGAGGATCCCCTGCCGTGCGGCAGGGTGCCGTTCCGTCGCTGACTCGTGTGCC CGACTGAAACTTGACCCACCTGTCAGTGGCCTAACGGCAGGCGCCGTACGTCAGAGGA GCTTCCTCCGAAGATGAA(SEQ IDNo.2)。

一种与小麦TaDEP1基因转录水平相关的分子标记，所述分子标记表现为SEQ IDNO：2所示核苷酸序列的插入/缺失长度多态性。

上述的分子标记，其具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的小麦表现为TaDEP1基因转录水平高；缺失SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的小麦表现为TaDEP1基因转录水平低。

一种用于检测上述的分子标记的引物对，其具有如SEQ ID NO：5-6所示的核苷酸序列；

F:CATGATGTCTCCCACTGTGGTGTAC(SEQ ID No.5)

R:GGATGTTGAGGCGAGTGTTCG(SEQ ID No.6)。

利用上述引物对对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，当扩增出742bp片段为单倍型Ⅰ(具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列)，扩增出610bp片段为单倍型Ⅱ(缺失SEQ ID NO：2所示核苷酸序列)，单倍型Ⅰ比单倍型Ⅱ的扩增产物长132bp，通过琼脂糖凝胶电泳即可区分。

一种用于检测上述分子标记的试剂盒，其包含上述的引物对。

一种检测上述的分子标记的方法，其在于，利用上述的引物对，或者上述的试剂盒，对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增并通过扩增产物判断如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的插入或缺失，进一步判断小麦TaDEP1基因转录水平的高低，具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的小麦表现为TaDEP1基因转录水平高；缺失SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的小麦表现为TaDEP1基因转录水平低。

上述的分子标记、上述的引物对、或者上述的试剂盒在小麦辅助育种中的用途。

一种小麦辅助育种方法，该方法包括检测上述的分子标记的步骤，

任选地，利用上述的引物对，或者上述的试剂盒，进行所述检测；

任选地，所述方法包括：通过上述的方法，检测所述分子标记，以便确定待测小麦的TaDEP1基因转录水平。

本发明的有益效果：本发明公开了一种小麦基因转录增强顺式作用元件的序列及其鉴定的分子标记与方法。本发明提供了小麦TaDEP1基因转录增强顺式作用元件序列如SEQ IDNo.2，以及用于鉴定TaDEP1基因转录水平的分子标记，用于特异性PCR扩增该标记的引物序列如SEQ ID No.5-6所示。利用该转录增强元件能够提高小麦基因转录水平，可用于基因工程遗传改良目的基因转录水平；利用该标记能够方便、快速、准确地鉴定小麦TaDEP1基因转录水平，可用于分子标记辅助育种。

附图说明

图1为小麦TaDEP1启动子在中国春(A)和缺体四体系(B)中的扩增结果。(A)不同温度代表PCR扩增时退火温度；(B)N5AT5D代表缺5A染色体，N5BT5D代表缺5B染色体，N5DT5B代表缺5D染色体。

图2为利用开发的分子标记在小麦微核心种质中15份代表材料中的单倍型分型结果。其中，扩增片段长度为742bp(含有132bp)的为单倍型Ⅰ，扩增出610bp(缺少132bp)片段的为单倍型Ⅱ。

图3为实时荧光定量PCR对小麦微核心种质中15份TaDEP1启动子不同单倍型代表材料TaDEP1基因转录水平的检测结果。TaGADPH为内参对照。

图4为TaDEP1基因启动子两种单倍型转录活性的检测结果。(A)TaDEP1基因启动子转录活性检测所用的载体结构。(B)两种单倍型的TaDEP1基因启动子转录活性检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1

1小麦TaDEP1基因D组启动子扩增及其特异性鉴定

材料：中国春及小麦缺体四体系(N5AT5D，N5BT5D和N5DT5B)材料。

DNA提取方法如下：

1)取新鲜的小麦叶片约100mg，加入液氮充分研磨成粉；

2)将研磨好的粉末迅速转移到液氮预冷的Eppendorf管中，加入350μl 65℃预热的CTAB提取液迅速混匀，置于65℃水浴30min，期间混匀5次；

CTAB提取液的配方为：2％(2g/100ml)CTAB，1.4mol/L的NaCl，20mmol/L EDTA(pH8.0),100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，2％(2g/100ml)PVP-40。

3)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比12：12：1)，混匀；

4)12000rpm室温离心10min，将上清转移至另一新的离心管中；

5)用氯仿/异戊醇(体积比24：1)重复步骤(4)-(6)；

6)加入等体积-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min；

7)12000rpm室温离心10min，弃上清；

8)用-20℃预冷的75％乙醇700μl洗涤沉淀2次，弃上清；

9)沉淀干燥后，加入50μl去离子水溶解DNA，置于-20℃备用。

引物序列：

F:GGCTACTGCGTCTACCTCGGTC(SEQ ID No.3)；

R:CCATGTCTCTCTGTCTCTCACACG(SEQ ID No.4)。

PCR扩增体系：

扩增条件：94℃ 5min；98℃ 10s，57℃ 30s，68℃ 2min，32个循环；68℃ 10min；4℃保温。

结果：以中国春基因组DNA为模板，通过不同退火温度梯度进行PCR扩增，利用上述引物和反应体系均能扩增出TaDEP1基因启动子，其中68℃条件下条带扩增效果最好，片段大小比2kb略大(图1A)。为进一步确认该PCR产物的特异性，我们又以缺体四体系(5A、5B、5D)基因组DNA为模板进行扩增，在缺5D的样本中扩增不到条带(图1B)，表明该引物能特异扩增TaDEP1基因D组启动子。

2“中国春”小麦TaDEP1基因D组启动子的序列分析

将上述PCR产物进行测序，序列如下：

GGCTACTGCGTCTACCTCGGTCCTTCACTCGTCTCGTGGTCGTCCAAGCGACAACCCACCGTTTTGCGCTCTAGCGCGGAGGCTGAGTACCGAGCAGTGGCTAACGCCGTCGCCGAGGGCACCTGGCTACGACAGCTACTTCAGGAGTTGCATCATGATGTCTCCCACTGTGGTGTACCTTTTCGCCAACCCCGTTCATCATCGCCGGACTAAGCACATTGAGCTGGAAATTCACTTTGTGCGTGAGCAGGTAGCCCTTGGATGCATTCGGGTCCTCCATGTTCCGACCGCCCAACAGTTCGCTGATGTAATGACTAAGGGACTGCCGACTTCCACCTTCGAGGAGTTTCGTTCCAGTCTTTGTGTCTCCGGCGCCACTTCGACTGTGGGTGTGTGTTGAATATATTGTGTCTTGGGCCCACCTCCTAGTCCATCTGTATAGTTGATGTTGTGACCTTCCTTTGTACATCATATATATGTGCTTGGTGCATCGATCGTGTGTTGCACATCCTATTCTTCGTCTTCTACAACGAGGACCGGAAGGATCTCGTGTTTATTTGAGTTCTTGATCAGGTGTGGCACTGTATCTAGAGATTCAGGAAAACCTGATCGAATAATCGTTTTATTGTACTGCTACTTGGGGAAGATGAAGGACGAGGATCCCCTGCCGTGCGGC AGGGTGCCGTTCCGTCGCTGACTCGTGTGCCCGACTGAAACTTGACCCACCTGTCAGTGGCCTAACGGCAGGCGCC GTACGTCAGAGGAGCTTCCTCCGAAGATGAAACACAGAAGAGCACACTTGCATTCGGAACGACCCTGGGATGAACAGCGTAGCCCCTGCCCTCGCCCATCCCCAGAGAGGCACCGCCCGAAGCGAACACTCGCCTCAACATCCGATCGCCCTGTCAGTCAGTCCCGGGCGCACGGCGCCGCACATGCGGCGCAGGCGCAGCGGGTGTGCAGGTGCAGCGCAACGCGTGACGGCCATTACTCCGAAATGGAACCACCCCTTCCTTCCTCCCCTCCCTCGTGCGGCATGCCGCAGCAGGCAGGCCCAGAGCGGCAGGCACCGGAGAGGAGAGGAGAGGAGAAGCGGAGAAGCGCGGTGGGGGGAAGGCATTGATTGATCCGGCCTGCCCGTTTCAAATCGGGCAACCCCGGTCGCTGCCACCGCTCTGCCGCGCCGGCCCCCCCCTCGCAAGTGCTACGGGCTACTACTACTACTGCTAGCCAGTAGCGAGCGCGCCCATCTTATGCTGGGCCCCCGGGCGGACGTGGACGCGTCAGTGTGTGTGCGCGCGGATGCGTCTCTGTCCGAGCAAGCCGATCGAGGGCCTCCTTCTGTCCCGTTGCCCCGCGGATGGCTTTTCCGTACGCCCGGCTCCGGCTCGGGGGACGCGCCACCCCGGCCACCGTCACGCTTGTGGTGCTACACGTACGTACTCCTGGTACGTGATGGATCGGTGAGGACGCCGTGCGTGCAATCAATGTGGCCGTCCGTGCGTGGCGGTACTATTCCCCACCCGTCGCTGGCAAACTCAATTCATCACATCACCCTGCAGCAGCCTTTTCCTCCATCAAACTCGGCACTATTTGCAATTGATCGCTCCTACTCCTACTACCAAGTGTTTGAACTCTATAATCATCGCTCCAACATACTTCTGGAGTGGCATTTGTTTCCTTGGCACTACGGGCGGCCGTTGCGCTGGCTCACGGTCACGGCCGCGCTCGCTGCCCAGCCCCCATACCGGGCGGGCGGGCGGACCCATGGCACATCACCGATTCACCGGCACGGACGAGCGCAGAGGCTCATCACAAGTCACGAACCGGCCCGCACAGTCGCCTCCTCCGTCCTCCCTTGATCTTCTTTCTCTCTCATTAAACCCCACTCCACCCCACCCCACCCCTGCGGCTGCACTCGCACTCTCTCTCTCTCTCTAAACCCCACGCGCCCTGCTCCCTCCCTCCCTTTGCTATTATTGCCCGCGCAGCGCGAGCTATATGGAGAGACTCCTCGCCTCCGCCTTCATTTCATTTCCACCACCTGCTCTACTCTGCTCTGCTCCTCCCCAGCCCACGCCCCCGCCCCCGCCCCCGTCCCCCGCCTCCATCTCCTCGCATCGCACGCACGCACGCACGCACGCACTCACCTGCGCTGCTCAGATTCCTTATTACATCACCGCCGGCCAGTGCGCAACCACCGCTCCGCCGCGCCTCCTGCTGCTAGCTGCCGCCCCGCCGCCGGCGCCTAATGCGGGCCGGTGGCTAAGCCTAAGCCCTCCGGGTCCGGGCGTGTGAGAGACAGAGAGAC(SEQ ID No.1)

通过在不同品种中扩增TaDEP1基因启动子发现，pTaDEP1基因D组启动子存在两种单倍型：单倍型Ⅰ全长2311bp；单倍型Ⅱ全长2179bp，相较于单倍型Ⅰ缺失132bp(下划线序列)。

3开发分子标记

利用132bp差异序列，我们开发了分子标记。利用该分子标记，对小麦微核心种质中随机选取的15份材料进行了鉴定。

DNA提取：方法同上。

引物序列：

F:CATGATGTCTCCCACTGTGGTGTAC(SEQ ID No.5)

R:GGATGTTGAGGCGAGTGTTCG(SEQ ID No.6)

PCR扩增体系：

扩增条件：94℃5min；98℃10s，57℃30s，68℃50s，32个循环；68℃10min；4℃保温。结果：利用该分子标记，单倍型Ⅰ扩增的片段长度为742bp；单倍型Ⅱ扩增的片段长度为610bp(图2)。通过对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，我们可以清晰地区分两种单倍型。其中，红花麦、白花麦和中国春属于单倍型Ⅰ，其余都属于单倍型Ⅱ(图2)。

4两种单倍型TaDEP1转录水平比较

RNA提取：参照RNA iso Plus(DP437)总RNA提取试剂说明书操作：

1)取0.1g冷冻的研磨过的小麦叶片，加入1ml提取试剂，剧烈震荡至彻底混匀；

2)室温放置5min；注意：平放离心管，使表面积最大。

3)4℃12000rpm离心10min，上清转移至新的无RNase离心管；

4)加入0.1ml 5M NaCl，温和混匀；

5)加入0.3ml氯仿，上下颠倒混匀；

6)4℃12000rpm离心10min，取上层水相转入新的无RNase离心管；

7)加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min；

8)4℃12000rpm离心10min，弃上清；

9)加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀；

10)4℃12000rpm离心2min，弃上清；

11)待沉淀干燥，加入50μl无RNase水，充分溶解RNA，置于-70℃待用。

反转录：参照PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)试剂盒说明书(Takara公司)进行反转录，具体操作如下：

1)去除基因组DNA反应

将混合液于PCR仪上42℃ 2min；4℃保温。

2)反转录反应

反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装10μl到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。

将混合液于PCR仪上37℃ 15min；85℃ 5s；4℃保温。

荧光定量参照宝生物(RR820A)反应体系为：

用CFX PCR仪按照仪器操作要求完成实验，qRT-PCR反应程序为：95℃30s；40个循环(95℃ 5s，60℃ 34s)；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。

本研究采用

算法进行目的基因相对表达量的计算。公式中CT值指反应管内荧光信号在达到设定的域值时的循环反应数。△CT指目的基因的CT值与内参基因CT值之差。

目的基因TaDEP1引物序列：

F：CACGTTCCTCAAGGACGAGCTAC(SEQ ID No.7)

R：CAGCCATGAAGCACATATGCACAG(SEQ ID No.8)

内参基因TaGAPDH引物序列：

F：TTAGACTTGCGAAGCCAGCA(SEQ ID No.9)

R：AAATGCCCTTGAGGTTTCCC(SEQ ID No.10)

定量结果：经过RNA提取、反转录，我们利用实时荧光定量PCR对小麦微核心种质中15份TaDEP1启动子不同单倍型材料cDNA中TaDEP1基因转录水平进行了检测，结果表明属于单倍型Ⅰ的红花麦、白花麦和中国春中TaDEP1的转录水平明显高于单倍型Ⅱ的材料，相对转录水平约是单倍型Ⅱ的10倍(图3)。

5 132bp差异序列是TaDEP1基因的转录增强顺式作用元件

选用pGreenⅡ0800-LUC载体，含有萤火虫萤光素酶(firefly luciferase)和萤光素酶(renilla luciferase)两种报告基因，由Andrew C Allan提供(Roger et al.,2005)。设计TaDEP1启动子的引物序列：F：5’-GGGGTACCGGCTACTGCGTCTACCTCGGTC-3’(SEQ IDNo.11)，R：5’-CCCAAGCTTGTCTCTCTGTCTCTCACACG-3’(SEQ ID No.12)对全长2311bp的TaDEP1启动子进行扩增，选用限制性酶切位点KpnⅠ和HindⅢ连入载体(图4A)。

质粒大提：

质粒大量提取的方法参照质粒大量提取纯化试剂盒(威格拉斯)。

1)取过夜培养菌<150ml菌液，装入合适的离心瓶中，4℃，6000g离心10min沉淀菌体，完全弃除上清。

2)加入5ml Buffer I，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。细菌悬液移入50ml离心管中。

3)加入5ml Buffer II，轻轻颠倒离心管6～8次，室温放置5min，使细菌完全裂解，溶液透明。

4)加入5ml Buffer III，立即颠倒离心管6～8次，充分混匀，至白色絮状物产生。冰上放置10～15min。

5)上述裂解液于4℃12000g离心15min，小心吸出上清，移入新的50ml离心管中。

6)加入10ml异丙醇，颠倒离心管，充分混匀。冰上放置10～15min。

7)于4℃，12000g离心10min，小心弃去上清，倒置轻轻沥干残余液体，加入0.5mlBuffer I，完全溶解沉淀团块(可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)。移入新的1.5ml离心管中，室温放置10～20min。

8)质粒粗提物用台式离心机室温高速离心2min，上清移入新的1.5ml离心管中。

9)0.5ml质粒粗提液中加入100μl Buffer IV(杂质清除液A)，轻轻混匀，12000g离心2min，将上清液转移至新的离心管中。

10)再加入100μl Buffer IV(杂质清除液A)，轻轻混匀，12000g离心5min，将上清液转移至新的离心管中。

11)加入70μl Buffer V(杂质清除液B)，轻轻混匀，12000g离心5min，将上清液转移至新的离心管中。

12)加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min。12000g室温离心10min，弃去上清液，用70％乙醇1ml轻轻洗涤，弃去液体，室温倒置凉干5min。

13)0.5ml TE溶解沉淀(可在37℃水浴中振荡或用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解)。

14)加入200μl Buffer VI(杂质清除液C)，混匀后冰上放置10～30min，12000g室温离心10min，弃去上清液，轻轻加入1ml 70％乙醇洗涤两次，室温倒置凉干5～10min使乙醇完全蒸发。

15)根据起始菌量加适量TE(200～500μl)溶解沉淀(可在37℃水浴中振荡辅助溶解)。

原生质体制备：

1)25℃光照培养箱播种小麦，培养条件为光照正常培养3d(16h光/8h暗)，暗培养4d，光照培养3d。

2)将配好的酶解液进行抽滤灭菌。

3)剪取中部生长良好的叶片用吉列刀片切成0.5mm宽的叶条，将切好的叶条放入0.6M的Mannitol中暗处理10min。

4)将暗处理浸泡过的叶条转入预先配置好的酶解液中，并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。

5)用铝箔纸包裹，真空泵于黑暗中抽真空30min。

6)在室温中(22-26℃)静置继续黑暗条件下酶解至少3h，转速60rpm。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来(此时预冷一定量W5溶液)。

7)在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。

8)先用W5溶液润湿200目的尼龙网，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。过滤时，由枪头导流，转到50ml的圆底离心管中，并且用W5冲洗一下尼龙膜上未充分酶解的叶条。

9)室温，100g，5min(水平转头)离心沉淀原生质体，除去酶解液，然后先用1ml冰上预冷的W5溶液(需抽滤灭菌)轻柔重悬原生质体。

10)之后，再加入9ml预冷的W5溶液，在冰上静置原生质体30min。

11)室温，100g离心5min使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液(1M)重悬原生质体。

12)显微镜下检查溶液中的原生质体，观察原生质体完整性并使之最终浓度在2X10⁵个/ml，准备后续转化实验。

试剂配置：

1)酶解液(20ml)

1.5％ Cellulase RS 0.3g

0.75％ Macerozyme R10 0.15g

0.6M Mannitol 2.148g

10mM,pH 5.7MES 400μL(0.5M的母液)

10mM CaCl₂ 40μL(5M的母液)

65℃水浴10min，充分溶解后加入BSA 0.02g至终浓度为0.1％(g/100ml)，KOH调pH到5.6。

2)W5溶液(500ml):

154mM NaCl 4.5g

125Mm CaCl₂ 12.5ml(5M的母液)

2mM MES 2ml(0.5M的母液)

5mM Glucose 0.451g

5mM KCl 0.186g

KOH调pH到5.6。4℃保存(染菌勿用)。

3)MMG溶液(100ml):

0.4M Mannitol 7.28g

15mM MgCl₂ 0.1425g

4mM MES 800μl(0.5M的母液)

KOH调pH到5.6。4℃保存(染菌勿用)。

原生质体转化:

①先加入15μg(每管不宜超过20μl)质粒至2ml离心管底部，再加入200μl原生质体，轻柔旋转混匀原生质体。

②将枪头伸到原生质体溶液上方加入等体积PEG4000溶液，迅速先旋转混匀，再一边手指轻弹管壁，一边让液体沿管壁缓慢流动，再迅速立起回流，旋转操作此步骤。

③室温黑暗放置诱导转化混合物5-10min(转化时间视实验情况而定，要表达量更高需要更高转化时间)。

④室温下用800μl W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。

⑤室温下用台式离心机100g离心5min然后去除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心5min去上清。

⑥用1ml WI溶液轻柔重悬原生质体，室温下(22-25℃)避光培养原生质体12-16h。

试剂配置：

1)PEG溶液(50ml):

40％ PEG4000 20g

0.4M Mannitol 3.64g

0.1M CaCl₂ 1ml(5M的母液)

KOH调pH到7.5-8.0(加热溶解，pH调节较慢)，现用现配。

2)WI溶液(100ml):

0.5M Mannitol 9.1085g

20mM KCl 800μl(2.5M的母液)

4mM MES 800μl(0.5M的母液)

过滤灭菌，室温储存。

LUC活性检测：

用Dual-

Reporter Assay System reagents(Promega，Madison，WI)检测萤火虫萤光素酶(firefly luciferase，LUC)和海参萤光素酶(renilla luciferase，RLUC)活性。室温100g离心5min，收集原生质体，加入50μL的1×Passive Lysis Buffer。

吸取10μL上清分别加40μL of Luciferase Assay Buffer和40μL of Stop andGlow^TM buffer用Centro LB 960Microplate Luminometer检测。程序为2s延时和10s测量。

结果：通过将TaDEP1两种单倍型启动子构建至pGreenⅡ0800-LUC载体(图4A)，比较132bp片段的有无对启动子转录活性的影响，结果表明含有132bp的单倍型Ⅰ启动子活性明显高于缺失132bp片段的单倍型Ⅱ启动子，相对转录活性约是单倍型Ⅱ的3倍(图4B)，说明132bp差异序列是TaDEP1基因的转录增强顺式作用元件。

文献引用：

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张锴，李爱丽，张兰，等.TaDEP1基因在普通六倍体小麦及其供体种中的保守与分化[J].植物遗传资源学报,2011,(6):957-964.

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Xu,R.,Li,N.,and Li,Y.(2019).Control of grain size by G proteinsignaling in rice.Journal of inte grative plant biology 61,533-540。

序列表

<110> 淮阴师范学院

<120> 小麦TaDEP1基因转录增强顺式作用元件的鉴定及其分子标记和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2311

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 1

ggctactgcg tctacctcgg tccttcactc gtctcgtggt cgtccaagcg acaacccacc 60

gttttgcgct ctagcgcgga ggctgagtac cgagcagtgg ctaacgccgt cgccgagggc 120

acctggctac gacagctact tcaggagttg catcatgatg tctcccactg tggtgtacct 180

tttcgccaac cccgttcatc atcgccggac taagcacatt gagctggaaa ttcactttgt 240

gcgtgagcag gtagcccttg gatgcattcg ggtcctccat gttccgaccg cccaacagtt 300

cgctgatgta atgactaagg gactgccgac ttccaccttc gaggagtttc gttccagtct 360

ttgtgtctcc ggcgccactt cgactgtggg tgtgtgttga atatattgtg tcttgggccc 420

acctcctagt ccatctgtat agttgatgtt gtgaccttcc tttgtacatc atatatatgt 480

gcttggtgca tcgatcgtgt gttgcacatc ctattcttcg tcttctacaa cgaggaccgg 540

aaggatctcg tgtttatttg agttcttgat caggtgtggc actgtatcta gagattcagg 600

aaaacctgat cgaataatcg ttttattgta ctgctacttg gggaagatga aggacgagga 660

tcccctgccg tgcggcaggg tgccgttccg tcgctgactc gtgtgcccga ctgaaacttg 720

acccacctgt cagtggccta acggcaggcg ccgtacgtca gaggagcttc ctccgaagat 780

gaaacacaga agagcacact tgcattcgga acgaccctgg gatgaacagc gtagcccctg 840

ccctcgccca tccccagaga ggcaccgccc gaagcgaaca ctcgcctcaa catccgatcg 900

ccctgtcagt cagtcccggg cgcacggcgc cgcacatgcg gcgcaggcgc agcgggtgtg 960

caggtgcagc gcaacgcgtg acggccatta ctccgaaatg gaaccacccc ttccttcctc 1020

ccctccctcg tgcggcatgc cgcagcaggc aggcccagag cggcaggcac cggagaggag 1080

aggagaggag aagcggagaa gcgcggtggg gggaaggcat tgattgatcc ggcctgcccg 1140

tttcaaatcg ggcaaccccg gtcgctgcca ccgctctgcc gcgccggccc ccccctcgca 1200

agtgctacgg gctactacta ctactgctag ccagtagcga gcgcgcccat cttatgctgg 1260

gcccccgggc ggacgtggac gcgtcagtgt gtgtgcgcgc ggatgcgtct ctgtccgagc 1320

aagccgatcg agggcctcct tctgtcccgt tgccccgcgg atggcttttc cgtacgcccg 1380

gctccggctc gggggacgcg ccaccccggc caccgtcacg cttgtggtgc tacacgtacg 1440

tactcctggt acgtgatgga tcggtgagga cgccgtgcgt gcaatcaatg tggccgtccg 1500

tgcgtggcgg tactattccc cacccgtcgc tggcaaactc aattcatcac atcaccctgc 1560

agcagccttt tcctccatca aactcggcac tatttgcaat tgatcgctcc tactcctact 1620

accaagtgtt tgaactctat aatcatcgct ccaacatact tctggagtgg catttgtttc 1680

cttggcacta cgggcggccg ttgcgctggc tcacggtcac ggccgcgctc gctgcccagc 1740

ccccataccg ggcgggcggg cggacccatg gcacatcacc gattcaccgg cacggacgag 1800

cgcagaggct catcacaagt cacgaaccgg cccgcacagt cgcctcctcc gtcctccctt 1860

gatcttcttt ctctctcatt aaaccccact ccaccccacc ccacccctgc ggctgcactc 1920

gcactctctc tctctctcta aaccccacgc gccctgctcc ctccctccct ttgctattat 1980

tgcccgcgca gcgcgagcta tatggagaga ctcctcgcct ccgccttcat ttcatttcca 2040

ccacctgctc tactctgctc tgctcctccc cagcccacgc ccccgccccc gcccccgtcc 2100

cccgcctcca tctcctcgca tcgcacgcac gcacgcacgc acgcactcac ctgcgctgct 2160

cagattcctt attacatcac cgccggccag tgcgcaacca ccgctccgcc gcgcctcctg 2220

ctgctagctg ccgccccgcc gccggcgcct aatgcgggcc ggtggctaag cctaagccct 2280

ccgggtccgg gcgtgtgaga gacagagaga c 2311

<210> 2

<211> 132

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 2

ggacgaggat cccctgccgt gcggcagggt gccgttccgt cgctgactcg tgtgcccgac 60

tgaaacttga cccacctgtc agtggcctaa cggcaggcgc cgtacgtcag aggagcttcc 120

tccgaagatg aa 132

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggctactgcg tctacctcgg tc 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccatgtctct ctgtctctca cacg 24

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catgatgtct cccactgtgg tgtac 25

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggatgttgag gcgagtgttc g 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cacgttcctc aaggacgagc tac 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagccatgaa gcacatatgc acag 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttagacttgc gaagccagca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaatgccctt gaggtttccc 20

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggggtaccgg ctactgcgtc tacctcggtc 30

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cccaagcttg tctctctgtc tctcacacg 29

Claims

1.如SEQ ID NO：2所示的小麦TaDEP1基因转录增强顺式作用元件。

2.一种用于检测与小麦TaDEP1基因转录水平相关的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5-6所示；所述的与小麦TaDEP1基因转录水平相关的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，利用所述引物对对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，当扩增出742bp片段时为单倍型Ⅰ，表现为TaDEP1基因转录水平高；当扩增出610bp片段时为单倍型Ⅱ，表现为TaDEP1基因转录水平低。

4.一种用于检测与小麦TaDEP1基因转录水平相关的分子标记的试剂盒，其特征在于，包含：权利要求2或3所述的引物对，所述的与小麦TaDEP1基因转录水平相关的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.一种检测与小麦TaDEP1基因转录水平相关的分子标记的方法，其特征在于，利用权利要求2或3所述的引物对，或者权利要求4所述的试剂盒，所述的与小麦TaDEP1基因转录水平相关的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

6.权利要求2或3所述的引物对、或者权利要求4所述的试剂盒在小麦辅助育种中的用途。

7.一种小麦辅助育种方法，其特征在于，所述方法为利用权利要求2或3所述的引物对，或者权利要求4所述的试剂盒检测与小麦TaDEP1基因转录水平相关的分子标记，以便确定待测小麦的TaDEP1基因转录水平；所述的与小麦TaDEP1基因转录水平相关的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的小麦表现为TaDEP1基因转录水平高；缺失SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的小麦表现为TaDEP1基因转录水平低。