CN102154347B - 降低小麦胚乳中PPO和PSY基因表达水平的方法及其专用RNAi载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降低小麦胚乳中PPO和PSY基因表达水平的方法及其专用RNAi载体。本发明提供了由表达盒A和表达盒B串联组成的表达盒C；表达盒A含有启动子A、PPO基因干涉片段的反向互补序列、间隔序列A、PPO基因干涉片段和终止子A；表达盒B含有启动子B、PSY基因干涉片段、间隔序列B、PSY基因干涉片段的反向互补序列和终止子B。本发明将具有干涉PPO和PSY基因功能的发卡结构，分别置于胚乳特异性启动子之下，然后将具有独立干涉PPO和PSY基因的表达盒进行融合，形成具有双干涉功能的RNAi载体。在实际应用中，通过一个基因转化过程，就可实现PPO和PSY基因的同步沉默。为利用基因工程技术改良小麦面粉的白度，提高小麦加工品质提供有力的工具。

Description

降低小麦胚乳中PPO和PSY基因表达水平的方法及其专用RNAi载体

技术领域

本发明涉及一种降低小麦胚乳中PPO和PSY基因表达水平的方法及其专用RNAi载体。

背景技术

我国很多小麦品种的面粉色泽不能满足加工要求，面粉生产及食品加工企业采用向面粉中添加增白剂的方式，增加其产品的白度。过氧化苯甲酰(Bezoyl peroxide，BPO)是一种氧化剂，为当前使用最广泛的面粉增白剂。BPO的分解产物苯甲酸和苯酚均需在肝脏中进行解毒，长期食用BPO超标的面粉及其制品会引起慢性中毒。因此，人们很久以来就期待着无增白剂面制品的问世，高白度小麦品种的培育，将对面制品的加工工艺产生重要影响，无增白剂食品将具有巨大的市场空间和产业化前景。

小麦胚乳中多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)活性和黄色素含量是影响面制品白度的主要因素，其中黄色素的主要成分是类胡萝卜素。八氢番茄红素合成酶(Phytoene synthase，PSY)基因是控制小麦籽粒中类胡萝卜素合成的关键基因。小麦面粉中的PPO活性仅占全籽粒的3％左右，但可以解释面粉及面制品加工和贮存过程中色泽褐变的50-70％。籽粒黄色素含量与面粉及面团黄度的相关系数高达0.8-0.9。因此，培育具有低PPO活性和低黄色素含量的小麦品种是对面制品色泽性状进行改良的重要途径。

小麦籽粒PPO活性主要受位于第二同源群上基因的调控，分别位于2AL和2DL，其中2AL上的QTL的效应较大，贡献率37.9-50.0％；位于2DL上的QTL贡献率为25.0-29.1％(D.J.Sun，Z.H.He，X.C.Xia，L.P.Zhang，C.F.Morris，R.Appels，W.J.Ma，H.Wang.A novel STS marker for polyphenol oxidase activity in breadwheat.Mol Breeding，2005，16：209-218)。利用电子克隆技术克隆2A和2D染色体上小麦籽粒PPO基因的全部编码序列，并利用模式植物对基因的功能进行了初步验证。Ppo-A1、Ppo-D1均包含一个1731bp的读码框(X.Y.He，Z.H.He，L.P.Zhang，D.J.Sun，C.F.Morris，E.P.Furerst，and X.C.Xia.Allelic variation ofpolyphenol oxidase(PPO)genes located on chromosomes 2A and 2D and developmentof functional markers for the PPO genes in common wheat，Theor Appl Genet，2007，115：47-58.)，可编码一条含577个氨基酸的多肽(64kD)，其基因编码区序列相似性达95％以上，这不仅显示了它们的同源进化关系，也为利用RNAi技术同步沉默2A和2D上的PPO基因提供了便利。

控制小麦籽粒黄色素含量的主要基因位于7A和7B染色体上。以玉米八氢番茄红素合成酶(Phytoene synthase，PSY)基因Psy1的mRNA序列为探针，获得了普通小麦7A染色体上Psy1基因Psy-A1的全长序列(X.Y.He，Y.L.Zhang，Z.H.He，Y.P.Wu，Y.G.Xiao，C.X.Ma，X.C.Xia.Characterization of phytoene synthase1 gene(Psy1)located on common wheat chromosome 7A and development of afunctional marker.Theor Appl Genet，2008，116：213-221)。Psy-A1的基因组DNA序列由4175个碱基对组成，包括6个外显子和5个内含子，以及部分5’和3’非翻译区，并含有一个1284bp的开放读码框，编码一段428个氨基酸残基的多肽链。参照Psy-A1的序列特征并结合电子克隆方法，鉴定并克隆了7B染色体Psy-B1和7D染色体Psy-D1基因(X.Y.He，J.W.Wang，K.Ammar，R.J.

X.C.Xia，Z.H.He.Allelic Variants at the Psy-A1 and Psy-B1 Loci in Durum Wheat and TheirAssociations with Grain Yellowness.Crop Sci.，2009a，49：2058-2064.；X.Y.He，Z.H.He，W.Ma，R.Appels，X.C.Xia.Allelic variants of phytoene synthase1(Psy1)genes in Chinese and CIMMYT wheat cultivars and development offunctional markers for flour colour.Mol Breeding，2009b，23：553-563；J.W.Wang，X.Y He，Z.H.He，H.W，X.C.Xia.Cloning and phylogenetic analysis ofphytoene synthase 1(Psy1)genes in common wheat and related species.Hereditas，2009，146：001-049)。Psy-A1、Psy-B1和Psy-D1之间的差别主要表现在内含子区域，而在外显子区域的相似性很高，这一特征也为利用RNAi技术同步沉默上述三个位点的PSY基因提供了便利。

RNA干涉(RNAi)是由同源性内源或外源dsRNA引起的序列特异性基因沉默现象。目前，RNAi技术已应用在改善作物的油脂和淀粉品质、提高营养物质或降低有害物质含量、提高抗褐化能力、提高果实耐贮性、进行代谢调控以获得目的次生代谢物等方面。作为一种下调表达技术，该技术在研究植物基因功能和改良作物品质等领域有良好的应用前景。在植物中持久表达RNA沉默，首先要构建表达载体，然后通过基因枪转化、PEG介导、电穿孔介导、农杆菌侵染等方法使设计的序列整合到植物基因组中并稳定表达。构建hpRNA高效表达载体用于特定基因沉默是研究热点之一。Wesley等(Wesley SV，Helliwell CA，Smith NA，Wang MB，Rouse DT，Liu Q，Gooding PS  SinghSP，Abbott D，Stoutjesdijk PA，Robinson SP，Gleave AP，Green AQ，WaterhousePM.Construct design for efficient，efective and highthroughput gene silencingin plants.Plant J，2001，27(6)：581-590)系统研究了不同结构的RNA对沉默效率的影响，发现相比于单链正义或反义RNA，双链RNA尤其是发卡式结构的RNA(hpRNA)对RNA沉默的效率有非常显著的提高。如果在发卡结构的反向重复序列间加入一段非编码序列如内含子，在植物体内转录形成含内含子的发卡结构(intronsplicinghpRNA，ihpRNA)，则沉默效果与hpRNA相比可从58％提高到90％。

hpRNA载体设计过程中，靶基因反向重复片段的长度和位置将影响基因沉默的效率。植物中一般采用几百bp的靶基因片段构建载体，Chuang等采用288-409bp的序列片段，都获得良好的抑制基因表达效果，一般认为靶基因序列应选择基因编码区片段(Chuang CF，Meyerowitz EM.Specific and heritable genetic interference bydouble stranded RNA in Arabidopsis thaliana.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(9)：4985-4990)。

选育高白度小麦品种首先要有可用的资源，但是小麦面制品色泽受面粉中多酚氧化酶活性和黄色素含量等多个因素的影响，单一因素的改变对于提高面制品白度的效果不显著。尽管小麦籽粒的PPO和PSY基因存在多个等位变异，而且这些等位变异之间基因表达活性存在差异，但是由于涉及到多个基因位点，很难将这些具有低活性的位点聚合在一起。不仅如此，由于小麦是目前最难转化的作物之一，转基因过程非常繁琐，每一个成功的转化需要大量的后代群体，成本很高。

发明内容

本发明的目的是提供一种降低小麦胚乳中PPO和PSY基因表达水平的方法及其专用RNAi载体。

本发明提供了由表达盒A和表达盒B串联组成的表达盒C；所述表达盒A含有启动子A、PPO基因干涉片段的反向互补序列、间隔序列A、PPO基因干涉片段和终止子A；所述表达盒B含有启动子B、PSY基因干涉片段、间隔序列B、PSY基因干涉片段的反向互补序列和终止子B。

所述表达盒A具体可为如下(1)或(2)：

(1)自上游至下游依次包括如下元件：所述启动子A、所述PPO干涉基因片段的反向互补序列、所述间隔序列A、所述PPO基因干涉片段和所述终止子A；

(2)自上游至下游依次包括如下元件：所述启动子A、所述PPO基因干涉片段、所述间隔序列A、所述PPO基因干涉片段的反向互补序列和所述终止子A；

所述表达盒B具体可为如下(3)或(4)：

(3)自上游至下游依次包括如下元件：所述启动子B、所述PSY基因干涉片段、所述间隔序列B、所述PSY基因干涉片段的反向互补序列和所述终止子B；

(4)自上游至下游依次包括如下元件：所述启动子B、所述PSY基因干涉片段的反向互补序列、所述间隔序列B、所述PSY基因干涉片段和所述终止子B。

所述PPO基因干涉片段的序列可如序列表的序列2自5’端第1至454位核苷酸所示；所述PSY基因干涉片段的序列可如序列表的序列3所示；所述间隔序列A和所述间隔序列B的序列均如序列表的序列1自5’端第12至586位核苷酸所示。

所述启动子A和所述启动子B均可为胚乳特异性启动子(优选序列见序列表的序列4自5’末端第1至1910位核苷酸)；所述终止子A和所述终止子B均可为nos终止子(优选序列表见序列表的序列4自5’末端第3463至3720位核苷酸)。

所述表达盒A具体可如序列表的序列4所示；所述表达盒B具体可如序列表的序列5所示；所述表达盒A位于所述表达盒B的上游；所述表达盒A和所述表达盒B以NotI位点相接。

含有所述表达盒C的重组载体(RNAi载体)也属于本发明的保护范围。

所述重组载体还含有抗性标记基因，如nptII基因。

所述重组载体的核苷酸序列具体可如序列表的序列6所示。

本发明还保护所述重组载体的构建方法，可包括如下步骤：

(1)在质粒pZLBx17casNKEco的多克隆位点插入含有所述间隔序列A的DNA片段，得到pZLBx17casNKEco-intron4-A；在质粒pZLBx17casNKEco的多克隆位点插入含有所述间隔序列B的DNA片段，得到pZLBx17casNKEco-intron4-B；

(2)在pZLBx17casNKEco-intron4-A中的间隔序列A的上游插入所述PPO基因干涉片段的反向互补序列(ippo-2)，间隔序列A的下游插入所述PPO基因干涉片段(ippo-1)，得到pIR-PPO；在pZLBx17casNKEco-intron4-B中的间隔序列B的上游插入所述PSY基因干涉片段(ipsy-1)，间隔序列B的下游插入所述PSY基因干涉片段的反向互补序列(ipsy-2)，得到pIR-PSY；

(3)通过限制性内切酶酶切pIR-PPO，回收含有所述启动子A、所述PPO基因干涉片段的反向互补序列、所述间隔序列A、所述PPO基因干涉片段和所述终止子A的DNA片段；通过限制性内切酶酶切pIR-PSY，回收含有所述启动子B、所述PSY基因干涉片段、所述间隔序列B、所述PSY基因干涉片段的反向互补序列和所述终止子B的DNA片段；将回收的两个所述DNA片段连接，得到所述重组载体。

含有所述表达盒C或所述重组载体的转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述表达盒C或所述重组载体可应用于降低小麦胚乳中PPO和PSY基因表达水平。

所述PPO基因可为GENBANK ACCESSION NUMBER：EF070147(VERSION EF070147.1，GI：118136325)所示的DNA；所述PSY基因可为GENBANK ACCESSION NUMBER：EF600063(VERSION EF600063.1，GI：154550142)所示的DNA。

所述表达盒C或所述重组载体可应用于小麦面粉色泽改良中。

所述表达盒C或所述重组载体可应用于培育转基因小麦中的应用；与转基因前小麦相比，所述转基因小麦所产面粉的黄色素含量降低和/或白度增加。

本发明还保护如下DNA片段：DNA片段Ⅰ，DNA片段Ⅱ，序列2所示的PPO基因片段，序列3所示的PSY基因片段或序列1所示的间隔序列DNA。

DNA片段Ⅰ，由PPO基因干涉片段的反向互补序列、间隔序列A和正向PPO基因干涉片段组成；所述PPO基因干涉片段的序列如序列表的序列2自5’端第1至454位核苷酸所示，所述间隔序列A如序列表的序列1自5’端第12至586位核苷酸所示。所述DNA片段Ⅰ的序列具体可如序列表的序列6自5’端第1977至3459位核苷酸所示。

DNA片段Ⅱ，由PSY基因干涉片段、间隔序列B、PSY基因干涉片段的反向互补序列组成；所述PSY基因干涉片段的序列如序列表的序列3所示，所述间隔序列B的序列均如序列表的序列1自5’端第12至586位核苷酸所示。所述DNA片段Ⅱ的序列具体可如序列表的序列6自5’端第5727至7222位核苷酸所示。

利用Ppo-A1、Ppo-D1基因间高度同源性，结合RNAi技术的原理，可以做到将位于2A和2D染色体上的Ppo-A1、Ppo-D1同步沉默，显著降低面粉的褐化程度。同样，利用Psy-A1、Psy-B1和Psy-D1之间的差别主要表现在内含子区域，而在外显子区域相似性很高的特性，利用RNAi技术，可以实现上述三个基因的同步沉默。

本发明构建得到了具有双RNA干涉功能的表达载体pIRPPO-PSY，可以同时降低胚乳中PPO和PSY基因的表达的水平。pIRPPO-PSY同时含有两个具有RNA干涉功能的发卡结构，亦即含有干涉PPO和PSY基因功能的发卡结构各一个，这两个发卡结构以串联的形式融合在一起，每个发卡结构有独立的启动子和终止子序列，构成独立的表达盒，其中的启动子为胚乳特异性启动子，来源于小麦高分子量麦谷蛋白亚基的启动子Bx17。每个发卡结构中包含一段来源于PSY基因的内含子序列intron4，作为发卡结构形成的间隔序列。整个载体共用一个选择克隆的KanR标记。具有干涉PPO基因功能的表达盒位于具有干涉PSY基因功能的表达盒的上游，两者以NotI位点相衔接。

本发明将具有干涉PPO和PSY基因功能的发卡结构，分别置于胚乳特异性启动子之下，然后将具有独立干涉PPO和PSY基因的表达盒进行融合，形成具有双干涉功能的RNAi载体。在实际应用中，通过一个基因转化过程，就可实现PPO和PSY基因的同步沉默。为利用基因工程技术改良小麦面粉的白度，提高小麦加工品质提供有力的工具。

附图说明

图1为pIRPPO-PSY的构建流程示意图。

图2为pZLBX17casNKEco-intron4构建过程中的电泳图；1：marker；2：KpnI和BamHI双酶切pZLBX17casNKEco(约5700bp)；4：PCR扩增产物(约804bp)。

图3为pZLBX17casNKEco-intron4的PCR鉴定电泳图；1，3：marker；4：PCR扩增产物(约804bp)。

图4为PCR扩增ippo-1和ippo-2电泳图；1，2：ippo-1；3，4：ippo-2。

图5为pIR-PPO-1双酶切鉴定电泳图；M：DL15000；1-3：Asu II/BamH I双酶切pIR-PPO-1；4：PMD-19T-PPO NheI/KpnI双酶切。

图6为pIR-PPO的PCR鉴定电泳图；M：Marker DL2000；1-4：pIR-PPO PCR扩增产物。

图7为pIR-PPO的酶切鉴定电泳图；1：Marker DL15000；2：质粒对照CK；3：KpnI/BamH I双酶切pIR-PPO；4：Sma I单酶切pIR-PPO；5：Marker DL2000。

图8为PCR扩增ipsy-1和ipsy-2电泳图；1，2：ipsy-1；3：ipsy-2；M：DL2000。

图9为pIR-PSY-1的酶切鉴定电泳图；1：BamH I/Asu II双酶切pIR-PSY-1；2：pZL-intron4；M：DL 2000。

图10为pIR-PSY的PCR鉴定电泳图；M：DL2000；1-6：pIR-PSY-1的PCR扩增产物。

图11为pIR-PSY的酶切鉴定电泳图；M：DL15000；1：质粒对照CK1；2：KpnI/BamHI双酶切pIR-PSY；3：Bgl II单酶切pIR-PSY；4：质粒对照CK2；5：KpnI/BamH I双酶切pIR-PSY；6：Bgl II单酶切pIR-PSY。

图12为利用Northern杂交分析转基因后代的基因表达量；内参基因为小麦Actin；A：转pIRPPO-PSY的株系与转化对照质粒的PPO基因表达量分析；B：转pIRPPO-PSY的株系与转化对照质粒的PSY基因表达量分析。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。PCR扩增所需的高保真酶、DNA片段连接所需的T4连接酶、酶切片段回收所需的凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒均购自大连宝生物公司。质粒提取试剂盒购自天根生物，培养基配制所需的无机盐购自国药集团，维生素和抗生素以及激素Gus染色所需的药品购自Sigma公司。金粉及基因枪转化过程中所需的耗材均购自伯乐公司。

所使用的引物由上海生工合成，序列如下：

P1：5’-GCGAGGTACCGTAAGCCACTCACTCACTACCAATAC-3’(KpnI)；

P2：5’-GCGCGGATCCCTGGGAAATTATTCGAAACACC-3’(BamHI)。

P3：5’-GACGTTCGAATGATTTCGAACGCGAAGAAG-3’(AsuII)；

P4：5’-AATTGGATCCGTACCGGTGGTGGCGGG-3’(BamHI)。

P5：5’-GAGTGCTAGCTGATTTCGAACGCGAAGAAG-3’(NheI)；

P6：3’-GCGAGGTACCGTACCGGTGGTGGCGGG-5’(KpnI)

P7：5’-ATTAGGATCCATGGCCACCACCGTCACG-3’(BamHI)；

P8：5’-GTGCTTCGAACGAGGTAGAAGGTCTTGGCGTA-3’(AsuII)。

P9：5’-ATTAGGTACCATGGCCACCACCGTCACG-3’(KpnI)；

P10：5’-GCGCGCTAGCCGAGGTAGAAGGTCTTGGCGTA-3’(NheI)。

下划线部分为添加的酶切位点的DNA序列，酶切位点的前面添加保护碱基。

小麦品种K35是山东省农科院作物所自行选育的具有良好花药培养能力的新种质，该材料曾在2007年第1期的山东农业科学上有过详细的介绍，公众可从山东省农业科学院作物研究所获得；参考文献：隋新霞，黄承彦，楚秀生，李根英，樊庆琦.易花药培养的早熟小麦心种质K35.山东农业科学，2007，1，116-117。

质粒pZLBx17casNKEco如序列表的序列7所示(5644bp)，由上海生工合成；公众可从山东省农业科学院作物研究所获得；参考文献：黄冰艳，李忠谊，吉万全，海燕，Fleming.J，Morell.M，Rahman.农业生物技术学报，2007，15(1)：71-75)。

实施例1、双干涉载体pIRPPO-PSY的构建

pIRPPO-PSY的构建流程示意图见图1。

一、中间载体pZLBx17casNKEco-intron4的构建

Psy-A1a第4内含子的2502位到3305位共804bp，见序列表的序列1。序列1所示DNA，在219-224bp处有一个NheI位点，在788793bp处有一个AsuII位点，可以用于后续的干涉片段的插入。

1、以小麦品种K35的基因组DNA为模板，通过引物P1和P2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，将PCR扩增产物用KpnI和BamHI双酶切(37℃酶切5个小时)，回收800bp左右目的基因片段(intron4)；

PCR扩增体系50(μl)：10×buffer 5μl；MgSO₄(50mM)1.5μl；dNTP(10mM，Takara)1μl；引物P1(10μM)1μl；引物P2(10μM)1μl；模板DNA 1μl；PlatinumHigh fidelity Taq酶(5U/μl，Takara)0.2μl；ddH₂O 39.3μl。

PCR反应程序：94℃，3min；94℃，30sec；58℃，30sec，72℃，1min，35 Cycles；72℃，1min。

2、将质粒pZLBx17casNKEco用KpnI和BamHI双酶切(37℃酶切5个小时)，回收载体骨架。

3、将步骤1回收的目的基因片段和步骤2回收的载体骨架连接，得到连接产物。

4、将连接产物进行PCR鉴定(引物P1和P2)和测序。

构建过程中的电泳图见图2。pZLBx17casNKEco-intron4的PCR鉴定电泳图见图3。

测序结果表明得到了中间载体pZLBx17casNKEco-intron4；pZLBx17casNKEco-intron4的骨架载体为pZLBx17casNKEco，在骨架载体的BamHI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列1所示DNA的反向互补序列。

二、PPO基因RNA干涉载体pIR-PPO的构建

植物RNA干涉的目的片段长度通常在200到800bp之间，干涉的目的片段最好位于一个外显子中，目的片段位于基因的中央其干涉效率更高。对Ppo-A1基因(GenBank：EF070147；VERSION：EF070147.1；GI：118136325)的3个外显子(27-622；725-986；1112-1987)进行分析，第二外显子长度不够，443bp和1566处有KpnI切点，748bp处有BamHI切点，无NheI切点。因此，共有3段序列可以满足本实验的要求：27-443(416bp)，1112-1565(454bp)，1567-1987(420bp)，考虑到目的片段位于基因的中央其干涉效率更高，选定1112-1565段进行干涉载体构建。序列2自5’末端第1至454位核苷酸所示的DNA即PPO基因的1112位到1565位，为PPO干涉基因片段。

1、人工合成序列表的序列2所示的DNA，将其作为模板，以引物P3和P4进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2、用AsuII和BamHI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收450bp左右的目的片段(图4)。

3、用AsuII和BamHI双酶切中间载体pZLBx17casNKEco-intron4，回收载体骨架。

4、将步骤2回收的目的片段和步骤3回收的载体骨架连接，得到连接产物。

5、将连接产物进行酶切鉴定(AsuII和BamHI)和测序。

酶切鉴定电泳图见图5。

测序结果表明得到了中间载体pIR-PPO-1；pIR-PPO-1的骨架载体为pZLBx17casNKEco-intron4，在骨架载体的BamHI和AsuII酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第1至454位核苷酸所示的DNA所示DNA的反向互补序列。

6、人工合成序列表的序列2所示的DNA，将其作为模板，以引物P5和P6进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

7、用NheI/KpnI双酶切步骤6的PCR扩增产物，回收450bp左右的目的片段(图4)。

8、用NheI/KpnI双酶切中间载体pIR-PPO-1，回收载体骨架。

9、将步骤7回收的目的片段和步骤8回收的载体骨架连接，得到连接产物。

10、将连接产物进行PCR鉴定，酶切鉴定(Kpn I/BamH I)和测序。

PCR鉴定电泳图见图6。酶切鉴定电泳图见图7。

测序结果表明得到了pIR-PPO；pIR-PPO的骨架载体为pIR-PPO-1，在骨架载体的NheI/KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第1至454位核苷酸所示的DNA。pIR-PPO的两个NotI酶切位点之间含有表达盒A。

所述表达盒A的核苷酸序列如序列表的序列4所示；其中，自5’末端第1至1910位核苷酸为胚乳特异性启动子Bx17，第1917至2370位核苷酸为PPO干涉基因片段的反向互补序列(ippo-2)，第2371至2945位核苷酸为间隔序列A，第2946至3399位核苷酸为PPO干涉基因片段(ippo-1)，第3463至3720位核苷酸为nos终止子。

三、PSY基因RNA干涉载体pIR-PSY的构建

对PSY基因(GenBank：EF600063；VERSION：EF600063.1；GI：154550142)的6个外显子(222-681；800-850；1442-1614；2267-2502；3307-3499；3699-3872)进行分析，第2、3、4、5、6外显子长度不够。第一外显子(222-681，460bp)中不含有KpnI、NheI、AsuII和BamHI位点，为克隆这段序列提供了方便。

1、人工合成序列表的序列3所示的DNA，将其作为模板，以引物P7和P8进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2、用AsuII和BamHI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收460bp左右的目的片段(图8)。

3、用AsuII和BamHI双酶切中间载体pZLBx17casNKEco-intron4，回收载体骨架。

4、将步骤2回收的目的片段和步骤3回收的载体骨架连接，得到连接产物。

5、将连接产物进行酶切鉴定(AsuII和BamHI)和测序。

酶切鉴定电泳图见图9。

测序结果表明得到了中间载体pIRPSY-1；pIRPSY-1的骨架载体为pZLBx17casNKEco-intron4，在骨架载体的BamHI和AsuII酶切位点之间插入了序列表的序列3所示DNA。

6、人工合成序列表的序列3所示的DNA，将其作为模板，以引物P9和P10进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

7、用NheI/KpnI双酶切步骤6的PCR扩增产物，回收460bp左右的目的片段(图8)。

8、用NheI/KpnI双酶切中间载体pIRPSY-1，回收载体骨架。

9、将步骤7回收的目的片段和步骤8回收的载体骨架连接，得到连接产物。

10、将连接产物进行PCR鉴定(引物P7和P8)，酶切鉴定(KpnI/BamHI)和测序。

PCR鉴定电泳图见图10。酶切鉴定电泳图见图11。

测序结果表明得到了pIR-PSY；pIR-PSY的骨架载体为pIRPSY-1，在骨架载体的NheI/KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列3所示DNA的反向互补序列。pIR-PSY的两个NotI酶切位点之间含有表达盒B。

表达盒B的核苷酸序列如序列表的序列5所示；其中，自5’末端第1至1910位核苷酸为胚乳特异性启动子Bx17，第1917至2376位核苷酸为PSY干涉基因片段(ipsy-1)，第2377至2951位核苷酸为间隔序列B，第2952至3411位核苷酸为PSY干涉基因片段的反向互补序列(ipsy-2)，第3475至3732位核苷酸为nos终止子。

四、可以同时降低PPO和PSY基因的表达RNA干涉载体pIRPPO-PSY的构建

用NotI完全酶切pIR-PPO，回收含有表达盒A的片段F1(约3700bp)，回收包含Kana抗性基因的片段F2(约2200bp)。用NotI完全酶切pIR-PSY，回收包含表达盒B的DNA片段F3(约3700bp)。

将片段F1和片段F3连接，得到连接产物甲；将连接产物甲与F2连接，得到连接产物乙，即为重组质粒pIRPPO-PSY。重组质粒pIRPPO-PSY的核苷酸序列如序列表的序列6所示；其中，自5’末端第61至3780位核苷酸为表达盒A，第3812至7543位核苷酸为表达盒B；5’末端第61至1970位核苷酸为胚乳特异性启动子Bx17，第1977至2430位核苷酸为PPO干涉基因片段的反向互补序列(ippo-2)，第2431至3005位核苷酸为间隔序列A，第3006至3459位核苷酸为PPO干涉基因片段(ippo-1)，第3523至3780位核苷酸为nos终止子，第3812至5721位核苷酸为胚乳特异性启动子Bx17，第5728至6187位核苷酸为PSY干涉基因片段(ipsy-1)，第6188至6762位核苷酸为间隔序列B，第6763至7222位核苷酸为PSY干涉基因片段的反向互补序列(ipsy-2)，第7286至7543位核苷酸为nos终止子。pIRPPO-PSY为融合了PSY基因和PPO基因双发卡结构的RNA干涉载体。

五、对照质粒的构建

用NotI完全酶切pZLBx17casNKEco，回收小片段D1(约2300bp)；用NotI完全酶切pZLBx17casNKEco，回收大片段D2(约3400bp)和小片段D3(约2300bp)。将片段D1和片段D3连接，得到连接产物甲；将连接产物甲与D2连接，得到连接产物乙，即为对照质粒pCK。对照质粒与重组质粒pIRPPO-PSY的差别仅在于没有表达盒A和表达盒B。

实施例2、pIRPPO-PSY在小麦面粉色泽改良中的应用

0.3M甘露醇预处理液：称取54.65克分析纯甘露醇，溶于1000ml超纯水中，高压灭菌后，每升加入头孢霉素200mg(已抽滤灭菌)。

栽培基质：将Klasmann泥炭装入10*10cm的花盆中，浇透水备用。

花药愈伤诱导培养基：每升诱导培养基(配方见表1)加入200mg头孢霉素(已抽滤灭菌)，提前三天倒板，倒在3.5mm培养皿中，检查培养基平板有无污染。

诱导培养基和再生培养基的配方见表1。

表1每升诱导培养基与每升再生培养基各组分含量(pH 5.8)

一、转基因植物的制备

1、花药的分离与预处理

花药供体为小麦品种K35，在显微镜下观察花药发育时期，取单核靠边期的花药(此时手摸穗部顶端离旗叶叶耳约10cm)，放入盛有0.3M甘露醇预处理液的培养皿中，每皿放置花药500粒，4℃放置约16小时。在倒好花药愈伤诱导培养基的培养皿下边放上画有基因枪轰击圈的白纸，将浸泡完全的花药转移到轰击圈上的培养基上，每皿放500粒花药，准备基因枪转化。

2、子弹制备

(1)金粉母液的制备

取0.6mm的金粉10mg，用70％乙醇洗3次，每次10000rpm离心1分钟，加1ml灭菌水振荡2分钟，制成终浓度10ug/ul的金粉贮藏液。

(2)子弹制备

将金粉贮藏液充分涡旋，从中取100ul，放入硅化的1.5ml离心管中，14000rpm离心30秒，弃上清。加入50ul的水将金粉悬浮，在震荡器上边轻微震荡边往里加入1ug/ul的质粒(重组质粒pIRPPO-PSY或对照质粒pCK)10ul，再加入新配制的20ul的0.1M亚精胺，再加入50ul 2.5M的CaCl₂，高速蜗旋3分钟，将离心管放在冰上约2分钟让金粉自动沉淀，10000rpm离心10秒，去掉上清，加无水乙醇750ul，高速蜗旋，然后将离心管放在冰上约2分钟让金粉自动沉淀，10000rpm离心10秒，去掉上清，用100ul无水乙醇悬浮，放入-20℃冰箱暂时保存，准备打枪。每管子弹可打10枪。

3、转化花药

将步骤2制备的子弹用基因枪轰击(枪膛压力达到28)至步骤1处理后的花药中。

4、花药恢复培养与再生苗的筛选及染色体加倍

(1)于无菌操作台中将轰击结束的花药转移到花药愈伤诱导培养基上，32℃暗培养3天，然后28℃暗培养约4周，获得胚状体；转移1-2mm左右的胚状体到再生培养基(配方见表1)，25℃进行再生培养(每天光照16小时，光照强度5000lux)。

(2)再生苗壮苗培养与染色体加倍

将苗高5cm左右的再生苗移栽到装有栽培基质的花盆中，用打孔的废弃矿泉水瓶子罩住小苗，昼夜温度保持14℃，每天光照14小时，有2-3个分蘖时，将苗子从花盆中取出，流水洗净根部，从根部3cm处剪掉过长根系，并修剪叶子使叶长3cm左右。

(3)染色体加倍

加倍液：先配制0.4％(质量百分比)的秋水仙素母液；取母液40ml，加1ml的二甲基亚砜(DMSO)，加水定容到80ml，此时秋水仙碱浓度为0.2％(质量百分比)。

将修剪好的苗子根部完全浸入加倍液中，18℃恒温培养5小时，利用普通鱼缸通氧机给浸入加倍液中的小麦根部持续通气。

(4)将加倍处理完毕的幼苗，用流水冲洗根部3小时，移栽到装有栽培基质的花盆中，用打孔的废弃矿泉水瓶子罩住小苗，昼夜温度保持14℃，每天14小时光照，待新蘖产生时，转移到17℃-25℃的环境，直至成熟收获，即为T₀代植株。

5、PCR鉴定

将T₀代植株进行PCR鉴定。

转重组质粒pIRPPO-PSY的T₀代植株所用的PCR引物对如下(靶序列为约860bp)：正向引物5’-AGTTGGGCTGCCTTGGGTC-3’；反向引物5’-AGTTGGGCTGCCTTGGGTC-3’。获得14株阳性植株。因为使用的受体是花药，所以阳性植株即为纯合的T₀代转pIRPPO-PSY植株。

转对照质粒pCK的T₀代植株所用的PCR引物对如下(靶序列约为550bp)：正向引物5’-CTTCACAATCTCATCATCACCC-3’；反向引物5’-CCCAGGCTTTACACTTTATGCT-3’。获得2株阳性植株。因为使用的受体是花药，所以阳性植株即为纯合的T₀代转pCK植株。

二、转基因植物的鉴定

将T₀代转pIRPPO-PSY植株(14个株系，2009T1-01至2009T1-14)自交产生的籽粒(T₁代种子)、T₁代转pCK植株(2个株系，2009CK-01和2009CK-02)自交产生的籽粒(T₁代种子)和小麦品种K35的籽粒分别进行各项分析。

1、PPO活性测定

利用AACC 22-85标准(AACC即Approved Methods of the American Associationof Cereal Chemists，9th ed.MN，St.Paul，USA，1995))所描述的方法分析籽粒的PPO活性，具体如下：

MOPS(50mM pH＝6.5)：由水和MOPS(3-[N-morpholino]propanesulfonic acid)组成，MOPS的浓度为1.0465g/100ml。

L-DOPA/MOPS反应试剂：由MOPS(50mM pH＝6.5)和L-DOPA(L-3，4-dihydroxyphenylalanine)组成，L-DOPA的浓度为0.1972g/100ml。

①称取15粒籽粒放入约20ml玻璃瓶内，加入4.5ml L-DOPA/MOPS反应试剂，放在混旋器上混合，使样品充分湿润；

②把样品瓶放在往复振荡摇床上振荡30min，确保样品瓶不盖盖，使样品充分暴露在空气中；

③在混旋器上迅速混匀，使样品反应液颜色一致；

④马上将样品放在冰块上终止反应；

⑤用分光光度计测定上清液475nm的吸光值A(1.0cm比色皿)，以L-DOPA/MOPS反应试剂为空白比色对照。

PPO活性(A475nm/min·g^-1×10³)＝吸光值A/(30min×15粒种子克数)×10³。

进行两次重复实验，结果见表2。OD值1和样品重1为第一次实验的原始数据，OD值2和样品重2为第二次实验的原始数据。

表2不同株系籽粒的PPO活性分析结果

株系编号	OD值1	OD值2	平均值	样品重1	样品重2	平均重g	PPO活性
								小麦品种K35	0.266	0.264	0.265	0.54	0.568	0.554	15.945
2009CK-01	0.264	0.263	0.2635	0.54	0.568	0.554	15.854
								2009CK-02	0.262	0.261	0.2615	0.532	0.575	0.5535	15.748
2009T1-01	0.264	0.263	0.2635	0.543	0.577	0.56	15.685
								2009T1-02	0.081	0.079	0.08	0.683	0.673	0.678	3.933
2009T1-03	0.076	0.12	0.098	0.712	0.755	0.7335	4.454
								2009T1-04	0.189	0.189	0.189	0.602	0.676	0.639	9.859
2009T1-05	0.065	0.05	0.0575	0.696	0.623	0.6595	2.906
								2009T1-06	0.311	0.286	0.2985	0.708	0.681	0.6945	14.327
2009T1-07	0.233	0.258	0.2455	0.556	0.576	0.566	14.458
								2009T1-08	0.066	0.07	0.068	0.597	0.697	0.647	3.503
2009T1-09	0.235	0.259	0.247	0.513	0.557	0.535	15.389
								2009T1-10	0.264	0.263	0.2635	0.543	0.577	0.56	15.685
2009T1-11	0.335	0.288	0.3115	0.671	0.653	0.662	15.685
								2009T1-12	0.353	0.245	0.299	0.624	0.642	0.633	15.745
2009T1-13	0.323	0.297	0.31	0.573	0.724	0.6485	15.934
								2009T1-14	0.301	0.257	0.279	0.648	0.635	0.6415	14.497

2009T1-02、2009T1-03、2009T1-04、2009T1-05和2009T1-08的PPO活性比野生型植株和转pCK植株显著降低。

2、面粉白度分析和黄色素含量分析

每个株系取200粒饱满籽粒，用Junior简易实验磨粉机进行粉碎，收集面粉。用日本Minolta公司的CR2310白度仪测定面粉白度，进行二次重复实验，结果取平均值。白度测试完成的面粉进行回收，用于黄色素含量分析(称取3克面粉，参照AACC14215标准描述的方法检测籽粒黄色素含量，即用水饱和正丁醇提取后，用紫外分光光度计测定籽粒的黄色素含量)，每个株系进行二次重复实验，结果取平均值，OD值1和样品重1为第一次实验的原始数据，OD值2和样品重2为第二次实验的原始数据。结果见表3。

表3不同株系籽粒的黄色素含量分析结果和面粉白度分析结果

株系号	OD值1	OD值2	平均值	样品重g	黄色素含量	面粉白度
							小麦品种K35	0.108	0.12	0.114	3	3.431	70.4
2009CK-01	0.101	0.109	0.105	3	3.161	70.8
							2009CK-02	0.16	0.104	0.132	3	3.973	70.6
2009T1-01	0.113	0.112	0.1125	3	3.386	71
							2009T1-02	0.099	0.095	0.097	3	2.920	79.8
2009T1-03	0.086	0.086	0.086	3	2.589	75.4
							2009T1-04	0.096	0.097	0.0965	3	2.905	73
2009T1-05	0.034	0.037	0.0355	3	1.069	83.6
							2009T1-06	0.097	0.098	0.0975	3	2.935	73.2
2009T1-07	0.085	0.085	0.085	3	2.559	73.6
							2009T1-08	0.04	0.038	0.039	3	1.174	82.3
2009T1-09	0.11	0.114	0.112	3	3.371	72
							2009T1-10	0.102	0.104	0.103	3	3.100	71.2
2009T1-11	0.103	0.106	0.1045	3	3.145	71.4
							2009T1-12	0.106	0.109	0.1075	3	3.236	69.8
2009T1-13	0.102	0.103	0.1025	3	3.085	70.8
							2009T1-14	0.101	0.111	0.106	3	3.191	72.2

在14个转pIRPPO-PSY株系中，面粉白度比野生型植株和转pCK植株有明显提高的有4个(2009T1-02、2009T1-03、2009T1-05、2009T1-08)，均为步骤1中PPO活性降低的株系。对照2009CK-01和2009CK-02的面粉白度平均值为70.7，而转基因株系2009T1-5的白度值为83.6，2009T1-08的白度值为82。

3、Northern杂交

为了进一步验证面粉白度与基因表达的关系，将面粉白度增加最大的两个株系2009T1-05和2009T1-08进行northern blot鉴定(将2009CK-01作为对照)。

取开花后两周的小麦籽粒，提取RNA进行northern blot鉴定，检测PPO基因的探针为序列表的序列6自5’末端第3006至3459位核苷酸所示的DNA片段，检测PSY基因的探针为序列表的序列6自5’末端第5728bp至6187bp的DNA片段。

结果见图12。与对照株系相比，2009T1-05和2009T1-8籽粒中PPO基因表达量和PSY基因表达量明显降低。说明转化pIRPPO-PSY后，同时降低了PPO和PSY基因的表达效率。

Claims (9)

1.由表达盒A和表达盒B串联组成的表达盒C；所述表达盒A含有启动子A、PPO基因干涉片段的反向互补序列、间隔序列A、PPO基因干涉片段和终止子A；所述表达盒B含有启动子B、PSY基因干涉片段、间隔序列B、PSY基因干涉片段的反向互补序列和终止子B；

所述表达盒A为如下(1)或(2)：

(1)自上游至下游依次包括如下元件：所述启动子A、所述PPO干涉基因片段的反向互补序列、所述间隔序列A、所述PPO基因干涉片段和所述终止子A；

(2)自上游至下游依次包括如下元件：所述启动子A、所述PPO基因干涉片段、所述间隔序列A、所述PPO基因干涉片段的反向互补序列和所述终止子A；

所述表达盒B为如下(3)或(4)：

(3)自上游至下游依次包括如下元件：所述启动子B、所述PSY基因干涉片段、所述间隔序列B、所述PSY基因干涉片段的反向互补序列和所述终止子B；

(4)自上游至下游依次包括如下元件：所述启动子B、所述PSY基因干涉片段的反向互补序列、所述间隔序列B、所述PSY基因干涉片段和所述终止子B；

所述PPO基因干涉片段的序列如序列表的序列2自5’末端第1至454位核苷酸所示；所述PSY基因干涉片段的序列如序列表的序列3所示；所述间隔序列A和所述间隔序列B的序列均如序列表的序列1自5’末端第12至586位核苷酸所示；

所述启动子A和所述启动子B均为序列表的序列4自5’末端第1至1910位核苷酸所示；所述终止子A和所述终止子B均为序列表的序列4自5’末端第3463至3720位核苷酸所示。

2.如权利要求1所述的表达盒C，其特征在于：所述表达盒A如序列表的序列4所示；所述表达盒B如序列表的序列5所示；所述表达盒A位于所述表达盒B的上游；所述表达盒A和所述表达盒B以NotI位点相接。

3.含有权利要求1或2所述表达盒C的重组载体或重组菌。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体还含有抗性标记基因，所述抗性标记基因为nptII基因。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体的核苷酸序列如序列表的序列6所示。

6.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体的构建方法包括如下步骤：

(1)在质粒pZLBx17casNKEco的多克隆位点插入含有所述间隔序列A的DNA片段，得到pZLBx17casNKEco-intron4-A；在质粒pZLBx17casNKEco的多克隆位点插入含有所述间隔序列B的DNA片段，得到pZLBx17casNKEco-intron4-B；

(2)在pZLBx17casNKEco-intron4-A中的间隔序列A的上游插入所述PPO基因干涉片段的反向互补序列，间隔序列A的下游插入所述PPO基因干涉片段，得到pIR-PPO；在pZLBx17casNKEco-intron4-B中的间隔序列B的上游插入所述PSY基因干涉片段，间隔序列B的下游插入所述PSY基因干涉片段的反向互补序列，得到pIR-PSY；

(3)通过限制性内切酶酶切pIR-PPO，回收含有所述启动子A、所述PPO基因干涉片段的反向互补序列、所述间隔序列A、所述PPO基因干涉片段和所述终止子A的DNA片段；通过限制性内切酶酶切pIR-PSY，回收含有所述启动子B、所述PSY基因干涉片段、所述间隔序列B、所述PSY基因干涉片段的反向互补序列和所述终止子B的DNA片段；将回收的两个所述DNA片段连接，得到所述重组载体；

其中，质粒pZLBx17casNKEco的序列如序列表的序列7所示。

7.权利要求1或2所述表达盒C或权利要求3至6中任一所述重组载体在降低小麦胚乳中PPO和PSY基因表达水平中的应用；所述PPO基因为GENBANK ACCESSIONNUMBER：EF070147所示的DNA；所述PSY基因为GENBANK ACCESSION NUMBER：EF600063所示的DNA。

8.权利要求1或2所述表达盒C或权利要求3至6中任一所述重组载体在培育转基因小麦中的应用；与转基因前小麦相比，所述转基因小麦所产面粉的黄色素含量降低和/或白度增加。

9.如下DNA片段中的任意一种：

DNA片段I，由PPO基因干涉片段的反向互补序列、间隔序列A和正向PPO基因干涉片段组成；所述PPO基因干涉片段的序列如序列表的序列2自5’末端第1至454位核苷酸所示，所述间隔序列A如序列表的序列1自5’末端第12至586位核苷酸所示；

DNA片段II，由PSY基因干涉片段、间隔序列B、PSY基因干涉片段的反向互补序列组成；所述PSY基因干涉片段的序列如序列表的序列3所示，所述间隔序列B的序列均如序列表的序列1自5’末端第12至586位核苷酸所示；

序列2自5’末端第1至454位核苷酸所示的PPO基因干涉片段；

序列3所示的PSY基因干涉片段；

所述DNA片段I为序列表的序列6自5’末端第1977至3459位核苷酸所示的DNA；

所述DNA片段II为序列表的序列6自5’末端第5727至7222位核苷酸所示的DNA。

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