CN111544355A - 一种鞣花酸酵素及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鞣花酸酵素及其制备方法，鞣花酸酵素的制备方法包括步骤：将含鞣花酸的植物进行预处理后初次发酵得到初次发酵液；将所述初次发酵液、酚酸类化合物、氨基酸类化合物以及辅料混合后进行再次发酵得到鞣花酸酵素发酵液；对所述鞣花酸酵素发酵液进行过滤得到鞣花酸酵素。由于在发酵过程中，氨基酸与鞣花酸、酚酸类化合物等物质可以通过特有的交联反应形成聚集体，进而通过氢键络合等分子间的作用力形成稳定的络合物。不仅能够解决鞣花酸这种溶解和吸收的局限，而且能够利用多组分发酵的产物络合，更好更高效的增强其目标组分的吸收。

Description

一种鞣花酸酵素及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，尤其涉及的是一种鞣花酸酵素及其制备方法。

背景技术

酵素是一种源自天然果蔬自然发酵而成的植物精华原液，它富含维生素、氨基酸、矿物质、有机酸、低聚糖等多种营养成份，可以提供人们身体每日所需的营养物质。除此之外，酵素对人体具有调节作用，它能够促进人体新陈代谢、清理血管中的垃圾、促进正常细胞再生使肌肤富有弹力等多重作用。因此，酵素作为保健品、化妆品备受大家的喜爱。

化妆品领域一直朝着纯天然、绿色健康的方向发展，原料多种多样，特别是天然果蔬植物中存在的天然物质成为化妆品、保健品中的理想成份。但现有技术中有些天然功效成份如鞣花酸等具有良好的美白、抗氧化功效，却受到溶解性不佳等问题的影响导致在化妆品领域利用率低。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种鞣花酸酵素及其制备方法，旨在解决现有技术中鞣花酸溶解性不佳导致吸收差、利用率低的问题。

本发明解决技术问题所采用的技术方案如下：

一种鞣花酸酵素的制备方法，其中，包括步骤：

将含鞣花酸的植物进行预处理后初次发酵得到初次发酵液；

将所述初次发酵液、酚酸类化合物、氨基酸类化合物以及辅料混合后进行再次发酵得到鞣花酸酵素发酵液；

对所述鞣花酸酵素发酵液进行过滤得到鞣花酸酵素。

所述的鞣花酸酵素的制备方法，其中，所述将含鞣花酸的植物进行预处理后初次发酵得到初次发酵液，包括：

将含鞣花酸的植物依次经过洗涤、浸泡、粉碎、研磨、过筛得到浆液；

对所述浆液进行初次发酵得到初次发酵液。

所述的鞣花酸酵素的制备方法，其中，所述酚酸类化合物和所述氨基酸类化合物采用如下步骤得到：

将含酚酸的植物和含氨基酸的植物进行预处理后初次发酵得到所述酚酸类化合物和所述氨基酸类化合物；其中，所述含鞣花酸的植物、所述含酚酸的植物以及所述含氨基酸的植物的质量比为1:0.2-0.8:0.8-1.2。

所述的鞣花酸酵素的制备方法，其中，所述含鞣花酸的植物包括：石榴、黑莓、红莓、胡桃中的一种或多种；所述含酚酸的植物包括：茶叶、漆树、苹果、阿魏中的一种或多种；所述含氨基酸的植物包括：大豆、花生。

所述的鞣花酸酵素的制备方法，其中，所述将含酚酸的植物和含氨基酸的植物进行预处理后进行初次发酵得到所述酚酸类化合物和所述氨基酸类化合物包括：

将含酚酸的植物依次进行干燥、粉碎得到干粉；

将含氨基酸的植物进行提取得到提取物；

将所述干粉以及所述提取物混合后进行初次发酵得到所述酚酸类化合物和所述氨基酸类化合物。

所述的鞣花酸酵素的制备方法，其中，所述初次发酵采用的菌种包括：乳酸杆菌、纤维素酶中的一种或多种；所述初次发酵和所述再次发酵的温度均为35-40℃，所述初次发酵的时间为2-3天，所述再次发酵的时间为3-5天。

所述的鞣花酸酵素的制备方法，其中，所述辅料为谷胱甘肽，所述氨基酸类化合物为碱性氨基酸，所述碱性氨基酸包括：组氨酸、精氨酸、赖氨酸中的一种或多种；所述酚酸类化合物包括：没食子酸、茶多酚、水杨酸、阿魏酸中的一种或多种。

所述的鞣花酸酵素的制备方法，其中，所述对所述鞣花酸酵素发酵液进行过滤得到鞣花酸酵素，包括：

将所述鞣花酸酵素发酵液进行初次压榨过滤得到滤液和滤饼，并将所述滤饼加入甘油水溶液中搅拌分散后再次压榨过滤得到滤液和滤饼；

将各次压榨过滤的滤液进行加热搅拌后抽滤得到鞣花酸酵素。

所述的鞣花酸酵素的制备方法，其中，所述鞣花酸酵素中鞣花酸、酚酸类化合物、氨基酸类化合物的质量比为3-4:1.8-2:1。

一种鞣花酸酵素，其中，采用如上述任意一项所述的鞣花酸酵素的制备方法制备得到。

有益效果：由于在发酵过程中，氨基酸与鞣花酸、酚酸类化合物等物质可以通过特有的相互反应形成聚集体，进而通过氢键络合等分子间的作用力形成稳定的络合物。而这种络合物结构不仅能够解决鞣花酸这种溶解和吸收的局限，而且能够利用多组分发酵的产物络合，更好更高效的增强其目标组分的吸收，提高鞣花酸的利用率。

附图说明

图1是本发明中鞣花酸酵素和维生素C的超氧阴离子清除率对比图。

图2是本发明中鞣花酸酵素和维生素C的ABTS自由基清除率对比图。

图3是本发明中鞣花酸和鞣花酸酵素的皱纹深度测试实验结果图。

图4是本发明中鞣花酸酵素的制备方法的流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

请同时参阅图1-图4，本发明提供了一种鞣花酸酵素的制备方法的一些实施例。

本发明利用现有的生物技术发酵一种以鞣花酸为主、酚酸类化合物、氨基酸类化合物为辅的酵素。这种酵素是在天然果蔬里面提取功效成份作为化妆品的原料。鞣花酸是一种多酚二内酯，是没食子酸的二聚衍生物，具有很强的清除自由基和抗氧化能力，并且鞣花酸对氧自由基和羟自由基都有清除作用。研究证明鞣花酸能抑制酪氨酸酶活性，阻断黑色素的生成，从而达到美白以及淡斑的效果。除此之外，鞣花酸可有效保护皮肤免于外界伤害，对于关闭阻碍黑色素生成细胞中麦拉林色素生成反应的作用是十分卓越的，并具有抗氧化作用。但是由于鞣花酸的溶解性低，吸收差，导致其在化妆品、保健品中的利用率大大地降低。基于此，本发明提供了一种经过发酵来增加天然原料中有效成分的吸收以及高效提取天然原料中的有效成分和微量成分的方法，并且用这种方法制备一种以鞣花酸为主的酵素。不仅能够解决鞣花酸这种溶解和吸收的局限，而且能够利用多组分发酵的产物络合，更好更高效的增强其目标组分的吸收，这是一种多方位增强目标成分的提取以及增加其它微量有效成分的方法。

氨基酸与鞣花酸、酚酸类化合物等物质可以通过特殊的交联反应形成聚集体，进而通过分子与分子的相互作用形成稳定的络合物。鞣花酸是一种多酚二内酯，是没食子酸的二聚衍生物，具有4个羟基可与氨基酸(如组氨酸、精氨酸)上面的-NH键结合形成O-H···N的氢键。含氮杂环上的氮原子作为氢键的受体，酚羟基上的-OH作为氢键的给体形成氢键O-H···N。鞣花酸既可以与碱性氨基酸如组氨酸、赖氨酸等选择性结合，也可以与其他酚类化合物共同结合碱性氨基酸进而形成稳定的络合物。在不受外力的介入的状态下分子与分子之间能够能够自发的聚集、识别、组织成一定规则结构的分子聚集体从而形成稳定的络合物体系。这种结构经过分子自组装过程和多重作用力的叠加使得鞣花酸与氨基酸之间形成的络合物结构非常稳定；并且当底物分子与受体分子靠近时，两者相互选择结合，最终通过氢键、范德华作用力等分子间作用力形成稳定的次级键。因此，这种络合物结构在低温下与受热的状态下都不易分解、变性，具有比较强的稳定性。且鞣花酸与组氨酸、精氨酸等多种氨基酸形成的络合物结构还明显增大了鞣花酸的溶解度，使酚酸类化合物功效成份与鞣花酸、氨基酸等功效成份在发酵过程中易于被人体吸收。并通过鞣花酸及其他酚酸类化合物等具有类似功效的成分间的协同作用，来增加其美白、淡斑、抗衰老的效果。解决了鞣花酸在化妆品中的添加问题，扩大了鞣花酸在化妆品、保健品领域的应用前景。

如图4所示，本发明的一种鞣花酸酵素的制备方法，包括以下步骤：

步骤S100、将含鞣花酸的植物进行预处理后初次发酵得到初次发酵液。

具体地，所述含鞣花酸的植物包括：石榴、黑莓、红莓、蓝莓、胡桃中的一种或多种。鞣花酸广泛存在于石榴皮中，而我国石榴产量高，石榴皮不能够直接食用，大多被废弃。但石榴皮中富含大量的鞣花酸具有很好的美白、抗氧化功效。石榴皮中的鞣花酸通常以两种形式存在，一种是游离的鞣花酸单体，另一种是以鞣花酸为母核的鞣花单宁类物质，鞣花单宁类物质可水解成鞣花酸。本发明实施例中以石榴皮为例进行说明。

通过将含鞣花酸的植物进行预处理后初次发酵得到初次发酵液，发酵时加入纤维素酶破坏细胞壁结构使鞣花酸从含鞣花酸的植物中发酵出来，在发酵液中大量游离、富集。因此，初次发酵液中存在鞣花酸。当然，由于初次发酵的时间较短导致含鞣花酸的植物中的鞣花酸尚未充分发酵出来。通过将含鞣花酸的植物中的鞣花酸初步发酵，使发酵液中含有鞣花酸便于与氨基酸类化合物形成稳定的络合物结构。

步骤S100具体包括：

步骤S110、将含鞣花酸的植物依次经过洗涤、浸泡、粉碎、研磨、过筛得到浆液。

具体地，为了便于含鞣花酸的植物的发酵，对含鞣花酸的植物进行预处理，预处理包括以下至少一种：浸泡、粉碎、研磨、过筛。举例说明，石榴皮的预处理：取石榴皮，除去根部，常温无菌水洗涤干净，后泡于25-30℃温无菌水中3-6小时，后取出石榴皮，使用破碎机破碎，然后加入无菌水(无菌水的量为石榴皮质量分数50％，无菌水的温度为35-40℃)，搅拌后使用磨浆机进行研磨，研磨后得到的浆液过10目的筛网，得到石榴皮浆液。其它含鞣花酸的植物也可以采用相同的预处理步骤，例如，取黑莓、红莓或者蓝莓，用常温无菌水洗涤干净，后泡于25-30℃温无菌水中3-6小时，后取出，并使用破碎机破碎，然后加入无菌水(无菌水的量为黑莓、红莓或者蓝莓的质量分数50％，无菌水的温度为35-40℃)，搅拌后使用磨浆机进行研磨，研磨后得到的浆液过10目的筛网，得到黑莓浆液、红莓浆液或者蓝莓浆液。

步骤S120、对所述浆液进行初次发酵得到初次发酵液。

具体地，将浆液进行灭菌处理，得到灭菌浆液，然后采用发酵罐将灭菌浆液进行初次发酵，举例说明，将浆液采用管式灭菌器进行灭菌处理得到灭菌浆液，将灭菌浆液和菌种加入发酵罐中，搅拌均匀，维持发酵温度，并通入无菌空气，并静置发酵预定时间，得到初次发酵液。菌种包括以下至少一种：乳酸杆菌、纤维素酶。初次发酵的温度为35-40℃，初次发酵的时间为2-3天。

具体地，将石榴皮浆液通过管式灭菌器灭菌处理，将滤浆置于发酵罐内，按石榴皮100g/ml加入浓度为1×10¹⁰个/ml的乳酸杆菌、纤维素酶的混合菌种悬液，搅拌至散开混匀，保持温度在35-40℃之间，保持无菌空气的通入，泵入量按发酵液体积的0.5倍左右每小时，静置自然发酵生长2-3天，得到石榴皮的初次发酵液。

步骤S200、将所述初次发酵液、酚酸类化合物、氨基酸类化合物以及辅料混合后进行再次发酵得到鞣花酸酵素发酵液。

具体地，采用发酵罐对初次发酵液、酚酸类化合物、氨基酸类化合物以及辅料进行再次发酵，举例说明，将酚酸类化合物、氨基酸类化合物以及辅料加入装有初次发酵液的发酵罐中，搅拌均匀，维持发酵温度，并通入无菌空气，并静置发酵预定时间，得到鞣花酸酵素发酵液。再次发酵的温度为35-40℃，再次发酵的时间为3-5天。为了提高鞣花酸酵素的抗氧化作用和美白作用，在再次发酵时，加入辅料，本发明中辅料为谷胱甘肽，当然还可以采用其它辅料，如肌肽、胶原三肽。所述氨基酸类化合物为碱性氨基酸，所述碱性氨基酸包括：组氨酸、精氨酸、赖氨酸中的一种或多种；所述酚酸类化合物包括：没食子酸、茶多酚、水杨酸、阿魏酸中的一种或多种。采用碱性氨基酸时，碱性氨基酸更容易与鞣花酸之间发生分子间络合的相互作用，从而提高了络合物体系的稳定性。

具体地，将酚酸类化合物、氨基酸类化合物以及辅料加入装有初次发酵液的发酵罐中，辅料为原料(即酚酸类化合物、氨基酸类化合物以及初次发酵液)总重6wt％的谷胱甘肽。再加入原料总重30wt％的35-40℃的无菌水，搅拌混匀，保持温度在35-40℃之间，保持无菌空气的通入，泵入量按原料体积的0.5倍左右每小时，静置发酵3-5天，即得到鞣花酸酵素发酵液。

本发明采用两步发酵的方式，在初次发酵中得到一部分鞣花酸，鞣花酸与氨基酸类化合物通过特殊的交联反应形成聚集体。在再次发酵过程中，发酵得到另一部分鞣花酸，进一步扩大聚集体，并形成更加稳定的络合物体系。

所述氨基酸类化合物和所述酚酸类化合物可以采用化学合成或提取得到，也可以采用发酵的方法得到。例如，采用组氨酸、精氨酸或赖氨酸等单一组分原料。所述酚酸类化合物和所述氨基酸类化合物采用如下步骤得到：

A1、将含酚酸的植物和含氨基酸的植物进行预处理后初次发酵得到所述酚酸类化合物和所述氨基酸类化合物；其中，所述含鞣花酸的植物、所述含酚酸的植物以及所述含氨基酸的植物的质量比为1:0.2-0.8:0.8-1.2。

所述含酚酸的植物包括：茶叶、漆树、苹果、阿魏中的一种或多种；所述含氨基酸的植物包括：大豆、花生。

含酚酸的植物和含氨基酸的植物采用不同的预处理方式，具体地，步骤A1包括：

A11、将含酚酸的植物依次进行干燥、粉碎得到干粉。

举例说明，以茶叶为例，将茶叶进行干燥和粉碎，得到茶叶干粉。干燥方式可以采用加热或者晒干。

A12、将含氨基酸的植物进行提取得到提取物。

将含氨基酸的植物粉碎后，加入溶剂后加热回流，并经过干燥、粉碎、过筛得到提取物。

举例说明，以大豆为例，大豆胚芽或豆粕经粉碎，装罐，80％乙醇-水为溶剂，加热回流提取三次，每次2小时，合并三次提取液，回收乙醇至无醇，继续蒸发水至比重d＝1.20的浸膏，浸膏放凉，以水饱和正丁醇萃取三次，合并正丁醇项，回收正丁醇至无醇，浸膏经干燥，粉碎，过筛即得大豆的提取物，提取物呈粉末状。

A13、将所述干粉以及所述提取物混合后进行初次发酵得到所述酚酸类化合物和所述氨基酸类化合物。

具体地，对所述干粉以及所述提取物进行灭菌处理，然后进行发酵，采用无氧发酵的方式，加入菌种后搅拌均匀，维持发酵温度，不通入无菌空气，无氧静置发酵2-3天，得到所述酚酸类化合物和所述氨基酸类化合物。初次发酵液所采用的菌种、所述酚酸类化合物和所述氨基酸类化合物所采用的菌种是相同的菌种，所述菌种包括：乳酸杆菌、纤维素酶中的一种或多种。需要说明的是，采用发酵发得到的酚酸类化合物和氨基酸类化合物，还包括其它物质，这些物质可以无需分离，可以一起与初次发酵液进行再次发酵。

举例说明，将茶叶的干粉和大豆的提取物通过高压蒸汽灭菌法灭菌，然后加入菌种，搅拌均匀，保持温度35-40℃之间，无氧静置发酵2-3天，得到所述酚酸类化合物和所述氨基酸类化合物。

步骤S300、对所述鞣花酸酵素发酵液进行过滤得到鞣花酸酵素。

具体地，对所述鞣花酸酵素发酵液进行过滤，得到的滤液即为鞣花酸酵素。过滤方式可以采用压榨过滤，抽滤等方式。为了充分过滤鞣花酸酵素发酵液中的鞣花酸酵素，可以采用多次过滤的方式，即加入溶剂反复过滤。

具体地，步骤S300包括：

步骤S310、将所述鞣花酸酵素发酵液进行初次压榨过滤得到滤液和滤饼，并将所述滤饼加入甘油水溶液中搅拌分散后再次压榨过滤得到滤液和滤饼。

具体地，将鞣花酸酵素发酵液放入压榨过滤机，通过压榨过滤机对鞣花酸酵素发酵液得到滤液和滤饼，然后将滤饼加入甘油水溶液中搅拌分散后再次压榨过滤得到滤液和滤饼，也就是说，对滤饼反复多次压榨过滤，压榨过滤的次数可以根据需要设置。甘油水溶液包括：无菌水和甘油，无菌水的重量为滤饼的重量的40wt％，甘油的重量为滤饼的重量的60wt％。当然还可以在甘油水溶液中加入1,2-戊二醇，甘油、1,2-戊二醇起到了保护作用、减缓变质的作用，使得有效成分间的协同作用增强。

步骤S320、将各次压榨过滤的滤液进行加热搅拌后抽滤得到鞣花酸酵素。

具体地，将各次压榨过滤的滤液加热搅拌后抽滤得到鞣花酸酵素，其中，加热温度为25-35℃，例如，加热温度采用30℃。搅拌时间可以是20-60分钟，例如，搅拌时间采用30分钟。在抽滤时，采用快速滤纸，按照孔隙的大小，滤纸可分为快速、中速以及慢速3种，孔径分别大约是80-120微米、30-50微米、1-3微米。快速滤纸孔隙最大，慢速滤纸孔隙最小。

具体地，鞣花酸酵素，颜色为琥珀色，PH适宜(PH为4.2-4.6)，有效目标成分的含量高：所述鞣花酸酵素中鞣花酸、酚酸类化合物、氨基酸类化合物的质量比为3-4:1.8-2:1。鞣花酸的成分能达到18-25％以上，茶提取物能达到15％以上，水解大豆提取物能达到7％以上。

本发明提供的以鞣花酸为主的酵素还具有明显地抗氧化作用。主要是以石榴皮、茶叶、水解大豆提取物为发酵原料，同时加入谷胱甘肽、甘油、水进行发酵。在制备酵素的发酵过程中，我们添加谷胱甘肽，让其与石榴皮中的维生素C结合，发生协同作用，保证体内多种维生素免受氧化。谷胱甘肽是含有γ-酰胺键和巯基的三肽，维生素C够维持巯基-SH处于还原状态而保持酶的活性；维生素C可以使氧化型谷胱甘肽转变为还原型谷胱甘肽，使得机体代谢的过氧化氢还原，也可保护多种维生素不被氧化，谷胱甘肽还可以保护血红蛋白不受过氧化氢、自由基等氧化从而使它持续正常发挥运输氧的能力。二者的联合使用能够增强其协同作用，增强其抗氧化的效果。利用现代微生物发酵和复合氨基酸复配这两种的方式来提高鞣花酸和茶叶中多酚类有效成分的吸收，并通过鞣花酸以及酚酸等具有类似功效的成分间的协同作用，来增加其美白、淡斑、抗衰老的效果，得到的鞣花酸酵素，具有美白、淡斑、抗衰老等功效，其与其他化妆品原料做配方，可以做成具有美容养颜抗衰老的护肤品。

此款以鞣花酸为主的酵素的优点：

1.此款以鞣花酸为主的酵素的原料是从天然的植物如石榴皮、茶叶、水解大豆提取物中发酵萃取出来的功效成份，是对皮肤温和无刺激的天然植物精华原液。它富含维生素、氨基酸、矿物质、有机酸、低聚糖等多种营养成份，可以提供人们身体每日所需的营养物质。除此之外，酵素对人体具有调节作用，它能够促进人体新陈代谢、清理血管中的垃圾、促进正常细胞再生使肌肤富有弹力等多重作用。

2.此款以鞣花酸为主的酵素具有很强的抗氧化性和美白淡斑的效果。此款酵素不仅鞣花酸具有强大的抗氧化能力，而且发酵中添加的谷胱甘肽可与石榴皮中的维生素C结合，谷胱甘肽是含有γ-酰胺键和巯基的三肽，维生素C够维持巯基-SH处于还原状态而保持酶的活性；维生素C可以使氧化型谷胱甘肽转变为还原型谷胱甘肽，使得机体代谢的过氧化氢还原，与鞣花酸协同增加其抗氧化的能力，强化美白淡斑的效果。

3.此款以鞣花酸为主的酵素发酵液中的氨基酸与鞣花酸、茶多酚等物质可以通过特殊的交联反应形成聚集体，进而通过分子间作用力形成稳定的络合物结构；并且络合物与络合物之间相互结合最终形成稳定的络合物体系。这种结构非常稳定，在低温下与受热的状态下都不易分解、变性，具有比较强的稳定性。且鞣花酸与组氨酸、精氨酸等多种氨基酸形成的络合物结构还明显增大了鞣花酸的溶解度，使得茶叶中的多酚类功效成份与鞣花酸、氨基酸等功效成份在发酵过程中易于被人体吸收。并通过鞣花酸及其他酚酸等具有类似功效的成分间的协同作用，来增加其美白、淡斑、抗衰老的效果。

此款以鞣花酸为主要功效成分，谷胱甘肽为辅料，甘油为补水保湿剂，发酵而成的天然植物酵素有良好的补水保湿功效。甘油本身就是天然的保湿剂，它可以形成一层甘油薄膜将皮肤内的水分锁住，使其不散失。结合鞣花酸、茶多酚和各类氨基酸功效成分的补水作用，甘油可以在皮肤的表层形成甘油薄膜保护皮肤中的水分不散失。以鞣花酸为主的酵素与甘油结合，增强了补水保湿的效果。

具体实施例1

1.石榴皮的预处理：取石榴皮200g，除去根部，常温无菌水洗涤干净，后泡于25-30℃温无菌水中3-6小时，后取出石榴皮，使用破碎机破碎，然后加入100g的35-40℃的无菌水，搅拌后使用磨浆机进行研磨，研磨后得到的浆液过10目的筛网，得到石榴皮浆液。

2.石榴皮浆液灭菌：将石榴皮浆液通过管式灭菌器灭菌处理。

3.石榴皮浆液初次发酵：将滤浆置于发酵罐内，加入2ml浓度为1×10¹⁰个/ml的乳酸杆菌、酿酒酵母、纤维素酶的混合菌种悬液，搅拌至散开混匀，保持温度在35-40℃之间，保持无菌空气的通入，泵入量按发酵液体积的0.5倍左右每小时，静置自然发酵生长48-72小时。

4.茶叶和水解大豆提取物预处理：将茶叶进行干燥和粉碎，得到茶叶干粉，按下表取水解大豆提取物与茶叶干粉混合，再加入葡萄糖、无菌水混合搅拌均匀，得混合料液。

茶叶干粉	水解大豆提取物	葡萄糖	无菌水
				100g	200g	3-6g	150g

5.混合料液的灭菌：将茶叶和水解大豆提取物的混合料液通过高压蒸汽灭菌法灭菌。

6.混合料液的发酵：向混合料液中加入1ml浓度为1×10¹⁰个/ml乳酸杆菌、纤维素酶的混合菌种，搅拌均匀，保持温度35-40℃之间，无氧静置发酵48-72小时。

7.配料与混合复配发酵：将无氧发酵后的混合料液加入到石榴皮发酵罐中，加入30g谷胱甘肽、35-40℃的无菌水150g，搅拌混匀，保持温度在35-40℃之间，保持无菌空气的通入，泵入量按发酵液体积的0.5倍左右每小时，静置发酵3-5天，即得到鞣花酸酵素发酵液。

8.鞣花酸酵素发酵液的初过滤：将鞣花酸酵素发酵液进行压榨过滤，分2-3次使用200g的35-40℃的无菌水和300g的甘油混合溶液将滤饼搅拌分散，压榨过滤，即得到压榨过滤的滤液。

鞣花酸酵素发酵液的二次过滤：将压榨过滤的滤液于30℃下搅拌30分钟，用快速滤纸进行抽滤，得到鞣花酸酵素。

具体实施例2

为证明发酵后鞣花酸酵素液有效成分含量高于直接添加单一成分的量，通过高效液相色谱进行成分含量测定，测定方法如下：

鞣花酸含量测试方法：

标准溶液的配制：精密称取鞣花酸5mg，用甲醇溶于50mL容量瓶中，定容，得鞣花酸标准溶液。

样品溶液的配制：称取鞣花酸酵素，用甲醇精准稀释100倍，超声30分钟，使用滤膜过滤，备用。

色谱柱：C18色谱柱；

流动相：0.1％的磷酸：甲醇＝60：40；

流动相流速：1mL/min；

检测波长：254nm；

色谱柱柱温：30℃；

计算结果：鞣花酸含量21.8％。

根据实验结果，鞣花酸酵素中鞣花酸的含量为21.8％，而鞣花酸单体在水中的溶解度只有0.00038％或3.8mg/L，严重制约其作为功效成分所起到的作用。这是由于通过发酵得到的鞣花酸酵素中鞣花酸以稳定的络合物的形式存在，大幅度提高了鞣花酸的水溶性。与直接添加单一成分的鞣花酸到水中相比，鞣花酸酵素中鞣花酸的量要高出10⁵倍，因此，可以将具有高含量鞣花酸的鞣花酸酵素进行应用，扩宽了鞣花酸的应用范围。

具体实施例3

稳定性测试：

试验方法：将鞣花酸酵素分为四组，每组多个排除特例，一组常温放置，一组加热，一组冷藏，一组光照，测定不同条件下产品的稳定性，结果如下表：

	常温	45℃热稳定	2-8℃冷稳定	光照
					7天	无沉淀、无变色	无沉淀、无变色	无沉淀、无变色	无沉淀、无变色
15天	无沉淀、无变色	无沉淀、无变色	无沉淀、无变色	无沉淀、无变色
					30天	无沉淀、无变色	无沉淀、无变色	无沉淀、无变色	无沉淀、无变色
60天	无沉淀、无变色	无沉淀、微变色	无沉淀、无变色	无沉淀、无变色

根据实验结果，证明本发明制成的鞣花酸酵素在2-8℃冷藏的条件下稳定性很好，常温和光照下依然能够稳定，其稳定性受热影响较大。对产生沉淀以及有变色情况的鞣花酸酵素使用实施例3中的方法通过高效液相色谱测试各组分含量，结果表明，鞣花酸酵素中鞣花酸的含量有所降低。

具体实施例4

清除自由基的测试：

为证明本发明鞣花酸酵素具有清除自由基的效果，通过对比实验，将鞣花酸酵素和VC(维生素C)的清除自由基的能力进行比较。由于自由基不太稳定，所以很难直接用于抗氧化评估实验。ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)自由基清除法是最常见的用于评价药用植物或纯化合物的抗氧化活性的一种方法，因为，ABTS+·自由基较稳定，稳定的ABTS+·自由基的甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在734nm范围有最大吸收峰。当向ABTS自由基溶液中加入鞣花酸酵素、VC时，成单被配对，ABTS自由基溶液褪色，734nm波长处的吸收值降低。利用公式计算自由基清除率：自由基清除率D＝(A对照-A样品)/(A对照-A空白)。

试剂的制备：

ABTS储备液的制备(7.4mmoL/L，0.4mL)：取ABTS 101.51mg，用蒸馏水定容到25mL(MV＝548.7)。

K₂S₂O₈储备液的制备(2.6mmoL/L，1.43mL)：取K₂S₂O₈ 70.28mg，用蒸馏水定容到100mL(MV＝270.3)。

ABTS工作母液的制备：分别量取25mL的ABTS储备液和25mL的K₂S₂O₈储备液混合均匀。室温避光12-16小时后，将该工作母液用无水乙醇稀释45倍。室温避光半小时后，在734nm处测定其吸光度为0.705±0.02。

对照组为VC稀释液，样品组为添加不同鞣花酸酵素含量的精华液：样1-6添加量分别为100、200、300、400、500、600微克/毫升的鞣花酸酵素精华液样品和对照相同浓度的VC稀释液。

实验方法：将配置好的各浓度的实验对照组和样品组的遮光静置半小时备用。采用配比为0.2mL样品+0.4mL ABTS工作母液的配比，分别进行测试不同浓度下的34nm波长处的吸收值。所得实验结果，如图1和图2所示。

通过ABTS自由基清除实验，可以看出鞣花酸酵素在不同浓度下的自由基清除率均高于同浓度的VC的自由基清除率。尤其在样品浓度为80毫克/毫升时，鞣花酸酵素的自由基清除率约为同浓度下的VC溶液的2倍。对于超氧阴离子的自由基清除率也比同浓度下的VC溶液高。通过此实验可以看出，本发明鞣花酸酵素具有良好的自由基清除效果，具有较好的抗氧化活性。

具体实施例5

发酵方式及最佳时间的测试：

为寻找最佳的发酵时间以降低成本增加产能，本发明对功效成份鞣花酸等先进行单独发酵，然后加入水解大豆提取物、茶叶干粉复配发酵。并对两次发酵时间进行了预设，测定发酵后鞣花酸的质量分数，其含量得下表：

通过实验结果和发酵成本综合考虑，先后经过单独发酵和混合发酵两次发酵，这些功效成份需要先单独发酵2-3天，然后再复配混合发酵3-5天最合适。发酵液中所富含的鞣花酸含量较高，且成本相对较低。

具体实施例6

美白效果测试：

鞣花酸能抑制酪氨酸酶活性，阻断黑色素的生成，从而达到美白以及淡斑的效果。使用鞣花酸酵素制作鞣花酸面膜，与不加鞣花酸酵素的面膜对照，测定皮肤黑色素含量，基础配方如下，对照组为基础配方，样品组为基础配方再加入3％的鞣花酸酵素。

丁二醇1份

精氨酸15份

透明质酸钠20份

优质矿泉水30份

氨基酸4份

透明质酸5份

海藻酸钠5份

聚乙烯醇5份

柠檬汁5份

甘油10份

1、实验人群

随机选取50名年龄段为20-40岁的志愿者，平均分成两组，每组25名。

2、实验仪器

德国CK多探头皮肤测试系统MPA9，黑色素和血红素测试探头(Mexamter MX18)。

3、实验方法

在测试前，需要志愿者用清无菌水清洁面部，并用面巾纸擦拭干净，在恒温恒湿实验室中静坐30分钟后开始测量，取左右脸部各三个位置，每个位置测量三次黑色素含量，取平均值，作为测试前皮肤的黑色素含量。

之后，两组人员一组使用添加鞣花酸酵素的面膜，一组使用对照面膜，每两天于晚上洁面后敷一片面膜，15分钟，连续使用四周，于第二周后和四周后使用与之前方法相同的测试方法再次进行测试。

4、评价方法

通过仪器测试皮肤黑色素含量，含量比之前有所减少并比对照组减少的多则说明有效，含量与之前不变、增多或者与对照组相比不变则说明无效。

5、涂抹产品后皮肤黑色素随时间变化实验数据表格

	样1	样2	样3	样4	样5	对1	对2	对3	对4	对5
											最初	135	142	138	143	136	138	144	142	141	136
2周后	127	129	128	132	117	133	136	134	135	132
											4周后	115	114	114	118	115	127	128	128	128	126
总减少	20	28	24	25	21	11	16	14	13	10

实验结果表明：添加鞣花酸的面膜使用两周后脸部黑色素含量就有明显的减少，并且使用时间延长至四周，黑色素含量仍然持续降低，且美白效果比较持久，长期使用能够有效提亮肤色。

具体实施例7

补水保湿效果实验

此种以鞣花酸为主的酵素是以乳酸杆菌、纤维素酶为混合发酵菌种，以石榴皮、水解大豆提取物、茶叶为主要原料，谷胱甘肽为辅料，甘油为补水保湿剂，发酵而成。其中，以鞣花酸为主的酵素和甘油结合，增强其补水保湿的效果。能够舒缓肌肤的敏感等症状，持久保持肌肤的水分。

现通过豚鼠局部受损皮肤模型模拟敏后失水的情况，评估天然植物组合物发酵提取物所制备的此款以鞣花酸为主的酵素的敏后修复、保持湿润的功效。试验用以鞣花酸为主的酵素和甘油等有效成份的复配物以1％、5％质量浓度的组合物涂抹于豚鼠的部分破损皮肤上，测试水分流失量的变化。

水分流失量计算公式：水分保湿率％＝(Ta-Tn)/(Ta-Tc)*100％

其中Ta为模型对照组，具体以去离子水为对照样品采集水分散失率。Tn为样品对照组，具体以鞣花酸酵素为样品采集水分散失率，Tc为空白对照组(在豚鼠正常皮肤未脱水的情况下，以去离子水为对照样品采集水分散失率)。水分散失保护率越高，说明保湿效果越好。

实验结果如下表所示：

从上述实验结果可以看出添加1％质量浓度的市售竞品与1％质量浓度的以鞣花酸为主的酵素复配面膜液的效果差异，以鞣花酸为主的酵素结合甘油的复配面膜液的保湿效果明显好于市竞售品的保湿效果，并且以鞣花酸为主的酵素结合甘油的复配面膜液的水分散失保护率约是市竞售品的水分散失保护率的2倍。5％质量浓度的以鞣花酸为主的酵素复配面膜液的水分散失保护效果更佳。豚鼠敏后失水的受损皮肤的水分散失保护的实验证明了本发明以鞣花酸为主要功效成分，谷胱甘肽为辅料，甘油为补水保湿剂，发酵而成的天然植物酵素具有良好的补水保湿作用。

具体实施例8

皱纹深度测试实验

实验设定样品组和对照组，其中，样品组为含有2％的鞣花酸酵素的面霜；对照组为含有2％的鞣花酸单体的面霜。测试同一志愿者使用两组产品在初次使用前的皱纹深度和使用45天后的皮肤皱纹深度。通过测试仪器Visioline VL 650测试志愿者皮肤的皱纹深度。

实验过程：

使用前，分别在志愿者的左眼和右眼眼尾的皱纹做测试。测试前先用测试仪器Visioline VL 650测试志愿者使用抗皱产品前皮肤的皱纹深度，将硅胶皱纹膜贴在眼角周围的皮肤上，5分钟后取下。将取下的硅胶皱纹膜放在该仪器的主机平台上测试原始皱纹深度并做记录。

取等质量的对照组含2％的鞣花酸的面霜涂于左边眼尾；取等质量的样品组组含2％的鞣花酸酵素的面霜涂于右边眼尾；坚持使用45天。

使用45天后，分别在志愿者的左眼和右眼眼尾的皱纹做测试。测试前先用测试仪器Visioline VL 650测试志愿者使用抗皱产品45天后皮肤的皱纹深度，将硅胶皱纹膜贴在眼角周围的皮肤上，5分钟后取下。将取下的硅胶皱纹膜放在该仪器的主机平台上测试使用面霜后的皱纹深度并做记录。

实验结果表明:如图3所示，在使用前志愿者的左眼和右眼的眼尾皱纹有轻微差别。其中，左眼的眼部皱纹比右眼眼部皱纹略深，但在使用了45天的含有2％的鞣花酸的面霜和2％的鞣花酸酵素面霜后测试眼尾皱纹深度，数据显示使用2％的鞣花酸的面霜和2％的鞣花酸酵素面霜都不同程度上减轻了皱纹的深度，但含2％的鞣花酸酵素的面霜除皱效果更好，抗衰老效果更加显著。

本发明还提供了一种鞣花酸酵素的较佳实施例：

本发明实施例的鞣花酸酵素，采用如上述任意一实施例所述的鞣花酸酵素的制备方法制备得到。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种鞣花酸酵素的制备方法，其特征在于，包括步骤：

将含鞣花酸的植物进行预处理后初次发酵得到初次发酵液；

将所述初次发酵液、酚酸类化合物、氨基酸类化合物以及辅料混合后进行再次发酵得到鞣花酸酵素发酵液；

对所述鞣花酸酵素发酵液进行过滤得到鞣花酸酵素。

2.根据权利要求1所述的鞣花酸酵素的制备方法，其特征在于，所述将含鞣花酸的植物进行预处理后初次发酵得到初次发酵液，包括：

将含鞣花酸的植物依次经过洗涤、浸泡、粉碎、研磨、过筛得到浆液；

对所述浆液进行初次发酵得到初次发酵液。

3.根据权利要求2所述的鞣花酸酵素的制备方法，其特征在于，所述酚酸类化合物和所述氨基酸类化合物采用如下步骤得到：

将含酚酸的植物和含氨基酸的植物进行预处理后初次发酵得到所述酚酸类化合物和所述氨基酸类化合物；其中，所述含鞣花酸的植物、所述含酚酸的植物以及所述含氨基酸的植物的质量比为1:0.2-0.8:0.8-1.2。

4.根据权利要求3所述的鞣花酸酵素的制备方法，其特征在于，所述含鞣花酸的植物包括：石榴、黑莓、红莓、胡桃中的一种或多种；所述含酚酸的植物包括：茶叶、漆树、苹果、阿魏中的一种或多种；所述含氨基酸的植物包括：大豆、花生。

5.根据权利要求3所述的鞣花酸酵素的制备方法，其特征在于，所述将含酚酸的植物和含氨基酸的植物进行预处理后进行初次发酵得到所述酚酸类化合物和所述氨基酸类化合物包括：

将含酚酸的植物依次进行干燥、粉碎得到干粉；

将含氨基酸的植物进行提取得到提取物；

将所述干粉以及所述提取物混合后进行初次发酵得到所述酚酸类化合物和所述氨基酸类化合物。

6.根据权利要求1所述的鞣花酸酵素的制备方法，其特征在于，所述初次发酵采用的菌种包括：乳酸杆菌、纤维素酶中的一种或多种；所述初次发酵和所述再次发酵的温度均为35-40℃，所述初次发酵的时间为2-3天，所述再次发酵的时间为3-5天。

7.根据权利要求1所述的鞣花酸酵素的制备方法，其特征在于，所述辅料为谷胱甘肽，所述氨基酸类化合物为碱性氨基酸，所述碱性氨基酸包括：组氨酸、精氨酸、赖氨酸中的一种或多种；所述酚酸类化合物包括：没食子酸、茶多酚、水杨酸、阿魏酸中的一种或多种。

8.根据权利要求1所述的鞣花酸酵素的制备方法，其特征在于，所述对所述鞣花酸酵素发酵液进行过滤得到鞣花酸酵素，包括：

将所述鞣花酸酵素发酵液进行初次压榨过滤得到滤液和滤饼，并将所述滤饼加入甘油水溶液中搅拌分散后再次压榨过滤得到滤液和滤饼；

将各次压榨过滤的滤液进行加热搅拌后抽滤得到鞣花酸酵素。

9.根据权利要求1所述的鞣花酸酵素的制备方法，其特征在于，所述鞣花酸酵素中鞣花酸、酚酸类化合物、氨基酸类化合物的质量比为3-4:1.8-2:1。

10.一种鞣花酸酵素，其特征在于，采用如权利要求1-9任意一项所述的鞣花酸酵素的制备方法制备得到。

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