CN111533812B

CN111533812B - 针对sars-cov-2病毒的dna疫苗及其用途

Info

Publication number: CN111533812B
Application number: CN202010570814.4A
Authority: CN
Inventors: 吴炯; 黄勇
Original assignee: Erick Beijing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Erick (Hubei) Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2020-06-22
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2040-06-22
Also published as: WO2021259206A1; CN111533812A

Abstract

本发明涉及疫苗领域，尤其涉及特异性针对SARS‑COV‑2病毒的DNA疫苗。本发明公开了一种融合蛋白，其包含SEQ ID NO:10中14‑1294位的氨基酸序列或SEQ ID NO:9编码的成熟多肽；一种融合蛋白，其包含SEQ ID NO:12中14‑1094位的氨基酸序列或SEQ ID NO:11编码的成熟多肽；以及编码所述融合蛋白的多核苷酸或包含所述多核苷酸序列的核酸分子。本发明还公开了相关的组合物、方法、用途和试剂盒。

Description

针对SARS-COV-2病毒的DNA疫苗及其用途

技术领域

本发明涉及疫苗领域，尤其涉及特异性针对SARS-COV-2病毒的DNA疫苗。

背景技术

2003年的SARS-COV和2012年的MERS-COV在世界范围内感染了众多人群；2019年底爆发的SARS-COV-2群体感染也影响甚大，目前迫切需要开发针对SARS-COV-2的有效疫苗，如DNA疫苗。尽管人们寻求各种增强抗原效力的方式，但在这方面的努力成果仍然是有限且难以预料的。在一些个案中表现出抗原效力增强的方式往往又在另一些个案中表现出难以应用的劣势。例如，曾被试图用于增强抗原效力的Hsp70在自身免疫性疾病模型中引发免疫耐受（Prakken B J, Wendling U, van der Zee R, et al. Induction of IL-10 andinhibition of experimental arthritis are specific features of microbial heatshock proteins that are absent for other evolutionarily conservedimmunodominant proteins[J]. The Journal of Immunology, 2001, 167(8): 4147-4153.），甚至有些情况下Hsp70与肿瘤抗原Her2融合不但降低Her2 DNA疫苗的有效性，而且还促进肿瘤进展（Pakravan N, Soudi S, Hassan Z M. N-terminally fusion of Her2/neu to HSP70 decreases efficiency of Her2/neu DNA vaccine[J]. Cell Stress andChaperones, 2010, 15(5): 631-638.）。而且，当试图把SARS COV-2的功能性亚基S1作为靶抗原用于制备疫苗时，由于该亚基S1的性质与常见抗原不同，例如其大小远超常见抗原，使得通常的抗原增效技术的可用性存疑，例如产生的应答（如有）是否是免疫有用的，产生的抗体（如有）是否是中和性/阻断性的，是否具有保护作用和/或细胞杀伤作用，都是未知的。试图使用辅助序列使抗原增效的努力其结果不但难以预料，而且甚至有可能导致负面效果。可见，增强抗原效力的尝试需要大量的努力和实验验证。另外，从安全性的角度，还需要克服DNA疫苗普遍存在的体内长期存续带来的潜在安全性问题，以及机体针对增效组分产生的不期望的抗体应答（即不期望的免疫原性）的安全性问题。

发明内容

本发明提供了持续、高效地诱导机体产生针对SARS-COV-2的体液免疫应答和细胞免疫应答两者且具有改善的安全性的DNA疫苗，满足了目前对SARS-COV-2病毒疫苗的迫切需要。

因此，在一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含SEQ ID NO: 10中14-1294位的氨基酸序列或SEQ ID NO: 9编码的成熟多肽。

在另一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含SEQ ID NO: 12中14-1094位的氨基酸序列或SEQ ID NO: 11编码的成熟多肽。

在又一个方面，本发明提供了一种编码本文所述的融合蛋白的多核苷酸或包含所述多核苷酸序列的核酸分子。

在又一个方面，本发明提供了一种载体，其包含本文所述的多核苷酸序列。

在又一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含：

（1）本文所述的融合蛋白，或本文所述的多核苷酸，或本文所述的载体；和

（2）药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在又一个方面，本发明提供了本文所述的融合蛋白、或本文所述的多核苷酸、或本文所述的载体、或本文所述的组合物在制备用于在有需要的受试者中治疗或预防SARS-COV-2病毒感染和/或相关疾病的药物中的用途。

在又一个方面，本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗或预防SARS-COV-2病毒感染和/或相关疾病的方法，其包括将本文所述的融合蛋白、或本文所述的多核苷酸、或本文所述的载体、或本文所述的组合物施用于所述受试者。

在又一个方面，本发明提供了一种用于在有需要的受试者中治疗或预防SARS-COV-2病毒感染和/或相关疾病的试剂盒，其包括：

（1）本文所述的融合蛋白、或本文所述的多核苷酸、或本文所述的载体、或本文所述的组合物；和

（2）选自人GM-CSF、IL-2、IFN-γ和/或IL-17中的一种或多种的细胞因子、或编码所述细胞因子的多核苷酸、或包含所述多核苷酸的载体。

在又一个方面，本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗或预防SARS-COV-2病毒感染和/或相关疾病的方法，其包括：

（1）将选自人GM-CSF、IL-2、IFN-γ和/或IL-17中的一种或多种的细胞因子、或编码所述细胞因子的多核苷酸、或包含所述多核苷酸的载体施用于所述受试者；然后

（2）将本文所述的融合蛋白、或本文所述的多核苷酸、或本文所述的载体、或本文所述的组合物施用于所述受试者。

当参考下面的详细描述和附图时，本发明的这些和其他实施方式将变得显而易见。此外，本申请中提到的专利和非专利文献均完整引入本文作为参考。

附图说明

图1：SARS-COV-2 S1-Hsp70融合抗原蛋白及其表达载体的构建。图1A．融合抗原蛋白结构组成示意图；图1B．融合抗原蛋白的分子克隆表达载体构建示意图

图2：SARS-COV-2 S1-Hsp70融合抗原蛋白在293细胞中的表达的检测（WB）。

图3：不同细胞因子DNA表达载体转染293细胞48小时后的细胞因子表达。

图4：转染后的GFP载体的表达的荧光成像图。

图5：用SARS-COV-2 S1-Hsp70 和SARS-COV-2 S1-Hsp70(△200)DNA表达载体免疫小鼠，诱导小鼠产生SARS-COV-2 S1蛋白特异性抗体。

图6： SARS-COV-2 S1-Hsp70 和 SARS- COV-2 S1-Hsp70(Δ200) 融合抗原蛋白诱导产生Hsp70蛋白特异性抗体。

图7：SARS-COV-2 S1-Hsp70 融合抗原蛋白的构建促进其 DNA表达载体在机体内的有效清除。泳道1：pVax1-SARS-COV-2 S1 + pVax1-Hsp70；泳道2：pVax1-SARS-COV-2 S1-Hsp70；泳道3：pVax1-SARS-COV-2 S1；泳道4：pVax1-Hsp70；泳道5：pVax1-SARS-COV-2 S1-Hsp70(Δ200)。

图8：SARS-COV-2 S1-Hsp70和SARS-COV-2 S1-Hsp70(△200) DNA表达载体免疫小鼠诱导产生的SARS-COV-2 S1特异性抗体对SARS-COV-2 S1蛋白与肺泡上皮细胞结合的抑制作用。

图9：用SARS-COV-2-S1-Hsp70 DNA和SARS-COV-2 S1-Hsp70(△200) DNA表达载体免疫小鼠，刺激SARS-COV-2 S1特异性T细胞产生IL-2和IFN-γ因子。

图10：SARS-COV-2 S1-Hsp70和SARS-COV-2 S1-Hsp70(△200) DNA表达载体免疫小鼠诱导的T细胞对表达SARS-COV-2 S1蛋白的3T3细胞的杀伤作用。

具体实施方式

SARS-COV-2病毒与萨斯（SARS）病毒和中东呼吸综合征（MERS）类似，同属于beta冠状病毒属。目前的研究结果证实，冠状病毒具有表面的刺突蛋白 (Spike 蛋白或S蛋白)、外膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)及核鞘蛋白(N蛋白)4种结构蛋白（Zhou J Y, Wu J X,Cheng L Q, et al. Expression of immunogenic S1 glycoprotein of infectiousbronchitis virus in transgenic potatoes[J]. Journal of virology, 2003, 77(16): 9090-9093）。SARS-COV-2病毒遗传编码序列的21563-25384区段为S蛋白的编码序列。S蛋白含有两个功能性亚基：S1和S2。

本发明人已经出人意料地发现，介导新冠病毒进入宿主细胞的S蛋白所包含的、负责与宿主细胞受体结合的功能性亚基S1与抗原辅助序列融合而成的融合抗原蛋白的编码DNA序列发挥出优异的DNA疫苗免疫作用，包括体液免疫（参见实施例5和8）和细胞免疫（参见实施例9和10）两方面。本发明人还已经出人意料地发现，采用本发明的特定融合抗原架构，实现了编码该特定融合抗原架构的DNA疫苗在宿主体内的及时清除，改善了DNA疫苗的安全性（参见实施例7）。本发明人还已经出人意料地发现，采用本发明的特定截短融合抗原架构，极大地减小了融合抗原蛋白中的抗原辅助部分导致的不期望的免疫原性，使得机体免疫能力进一步聚焦于融合抗原蛋白的S1部分，提高了机体免疫系统资源的利用率，也改善了融合DNA疫苗的安全性（参见实施例6）。

因此，在一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含SEQ ID NO: 10中14-1294位的氨基酸序列或SEQ ID NO: 9编码的成熟多肽或与其具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述融合蛋白可以由SEQ ID NO: 10的氨基酸序列或SEQ IDNO: 10的14-1294位的氨基酸序列或SEQ ID NO: 9编码的成熟多肽或与其具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性的氨基酸序列组成。

在一些实施方式中，所述融合蛋白中SEQ ID NO: 10中14-667位的氨基酸序列可以与671-1294位的氨基酸序列的位置互换。

在另一个方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含SEQ ID NO: 12中14-1094位的氨基酸序列或SEQ ID NO: 11编码的成熟多肽或与其具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述融合蛋白可以由SEQ ID NO: 12的氨基酸序列或SEQ IDNO: 12的14-1094位的氨基酸序列或SEQ ID NO: 11编码的成熟多肽或与其具有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性的氨基酸序列组成。

在一些实施方式中，所述融合蛋白中SEQ ID NO: 12中14-667位的氨基酸序列可以与671-1094位的氨基酸序列的位置互换。

在一些实施方式中，所述多核苷酸可以由SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11组成。

在又一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含：

（2）药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在一些实施方式中，所述治疗或预防还可以包括在向所述受试者施用所述药物之前，向所述受试者施用选自人GM-CSF、IL-2、IFN-γ和/或IL-17中的一种或多种的细胞因子、或编码所述细胞因子的多核苷酸、或包含所述多核苷酸的载体。

在一些实施方式中，所述方法可以还包括在向所述受试者施用所述药物之前，向所述受试者施用选自人GM-CSF、IL-2、IFN-γ和/或IL-17中的一种或多种的细胞因子、或编码所述细胞因子的多核苷酸、或包含所述多核苷酸的载体。

在一些实施方式中，所述组合物可以是免疫组合物。

在一些实施方式中，所述相关疾病可以是COVID-19。

在一些实施方式中，所述相关疾病可以是由SARS-COV-2病毒和/或其突变体引起。

在一些实施方式中，本文所述的融合蛋白可以包含一个或多个保守氨基酸置换。

在一些实施方式中，本文所述的载体可以是适用于真核细胞的载体。

在一些实施方式中，本文所述的载体可以是病毒载体。

在一些实施方式中，本文所述的载体可以包含与所述多核苷酸可操作地连接的调节元件，如启动子、增强子。

在一些实施方式中，本文所述的多核苷酸或核酸分子或载体可以被密码子优化。

在一些实施方式中，本文所述的多核苷酸或核酸分子或载体可以是其简并版本。

在一些实施方式中，选自人GM-CSF、IL-2、IFN-γ和/或IL-17中的一种或多种的细胞因子可以是选自人GM-CSF、IL-2、IFN-γ和/或IL-17中的一种、两种、三种或四种的细胞因子。

在一些实施方式中，本文所述的融合蛋白、或本文所述的多核苷酸、或本文所述的载体、或本文所述的组合物、或本文所述的细胞因子、或编码所述细胞因子的多核苷酸、或包含所述多核苷酸的载体可以经肠、肠胃外、经皮、肌肉内、经粘膜、经鼻和吸入等合适的途径施用于需要的受试者。

在一些实施方式中，本文所述的细胞因子、或编码所述细胞因子的多核苷酸、或包含所述多核苷酸的载体可以在施用本文所述的融合蛋白、或本文所述的多核苷酸、或本文所述的载体、或本文所述的组合物之前1天、2天、3天、4天或5天施用于有需要的受试者，优选2天。

本文中使用的术语“融合抗原蛋白”表示这样的线性单链蛋白：其包括基于一种或多种亲本蛋白、多肽或其片段(例如，抗原性肽)的多肽组分，且其不天然地存在于宿主细胞中。融合抗原蛋白可以含有两种或更多种天然存在的氨基酸序列，所述氨基酸序列以不会天然存在的方式连接在一起。例如，融合抗原蛋白可以具有来自相同蛋白或其片段(例如，抗原性片段)的两个或更多个部分，所述部分以在细胞或蛋白中不常见的方式连接，或融合抗原蛋白可以具有来自2种、3种、4种、5或更多种不同蛋白的部分(例如，抗原性部分)，所述部分以在细胞中不常见的方式连接。并且，融合抗原蛋白可以具有蛋白或其片段(例如，抗原性片段)的相同部分的两个或更多个拷贝。融合抗原蛋白可以由核酸分子编码，其中编码一个蛋白或其部分(例如，抗原)的多核苷酸序列与编码一个或多个蛋白或其部分(例如，相同的或不同的抗原)的核酸分子在框架内附接，所述两个或更多个蛋白或其部分任选地被编码接头、间隔区、切割位点、连接氨基酸或它们的组合的核苷酸隔开。

本文中使用的术语“连接氨基酸”或“连接氨基酸残基”表示这样的一个或多个(例如，约2-10个)氨基酸残基：其在多肽的两个邻近的基序、区域或结构域之间，诸如在抗原性肽之间或在抗原性肽和由多重翻译前导序列编码的邻近肽之间，或在抗原性肽和间隔区或切割位点之间。连接氨基酸可以源自融合抗原蛋白的构建体设计(例如，在构建编码融合抗原蛋白的核酸分子的过程中由限制性酶位点的使用引起的氨基酸残基)。

本文中使用的术语“保守氨基酸置换”在本领域中被公认为将一个氨基酸置换为另一个具有类似性能的氨基酸。示例性的保守置换是本领域众所周知的(参见，例如，WO97/09433，第10页，1997年3月13日公开；Lehninger，Biochemistry，第2版；WorthPublishers，Inc.NY：NY(1975)，第71-77页)。

本文中使用的术语“抗原、“抗原性肽”或其变体表示可以刺激细胞产生免疫应答的多肽。本文中使用的术语“核酸分子疫苗”或“DNA疫苗”表示在本文定义的核酸分子免疫接种中使用的、编码一种或多种抗原或抗原性表位的核酸分子。

本文中使用的术语“免疫组合物”表示可以刺激或引起免疫应答的组合物。优选地，所述免疫应答是细胞和体液免疫应答，诸如由T-细胞(例如，CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞)介导的适应性免疫应答。在某些实施方式中，免疫组合物是药物制剂。在其它实施方式中，免疫组合物是抗原性肽免疫组合物、核酸免疫组合物、细胞免疫组合物或它们的组合。

本文中使用的术语“抗原免疫组合物”或“肽免疫组合物”表示包括一种或多种抗原的免疫组合物，所述抗原能够促进或刺激细胞和体液免疫应答。

本文中使用的术语“核酸免疫组合物”表示包括核酸分子的免疫组合物，所述核酸分子编码一种或多种抗原或抗原性表位且其可以被包含在载体(例如，质粒、病毒)中。可以将核酸免疫组合物引入离体或体内宿主细胞中用于在受试者中表达一种或多种抗原性肽。

本文中使用的术语“核酸”或“核酸分子”表示，例如通过聚合酶链式反应(PCR)或通过体外翻译产生的脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、片段中的任一种，和通过连接、切割、内切核酸酶作用或外切核酸酶作用中的任意一种或多种产生的片段。在某些实施方式中，本发明内容的核酸通过PCR产生。核酸可以由单体组成，所述单体是天然存在的核苷酸(诸如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)、天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的α-对映异构形式)或它们的组合。修饰的核苷酸可以具有在糖部分、或嘧啶或嘌呤碱基部分中或替代糖部分、或嘧啶或嘌呤碱基部分的修饰。核酸单体可以通过磷酸二酯键或这样的键的类似物而连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、phosphoranilidate、氨基磷酸酯、吗啉代等。术语“核酸分子”也包括“肽核酸”(PNAs)，其包含与聚酰胺主链连接的天然存在的或经修饰的核酸碱基。核酸分子可以是单链的或双链的。

本文中使用的术语“构建体”表示含有重组核酸的任何多核苷酸。构建体可以存在于载体(例如，细菌载体、病毒载体)中，或可以整合进基因组中。“载体”是能够运输另一种核酸的核酸分子。载体可以是，例如，质粒、粘粒、病毒、RNA载体或线性或圆形DNA或RNA分子，其可以包括染色体、非染色体、半合成的或合成的核酸。示例性的载体是能够自主复制(附加型载体)和/或表达它们所连接的核酸(表达载体)的那些载体。

本文中使用的载体如病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如，腺伴随病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒诸如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如，麻疹和仙台)、正链RNA病毒诸如小RNA病毒和甲病毒，和双链DNA病毒，所述双链DNA病毒包括腺病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒1和2型、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘、鸡痘和金丝雀痘)。其它病毒包括例如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多泡病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的例子包括禽造白细胞组织增生-肉瘤、哺乳动物C-型、B-型病毒、D-型病毒、HTLV-BLV集合、慢病毒、泡沫病毒(Coffin，J.M.，Retroviridae：The viruses and theirreplication，In FundamentalVirology，第三版，B.N.Fields，等人，编，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，1996)。

本文中使用的术语“慢病毒载体”是指基于HIV的慢病毒载体，其因为它们的相对大的包装能力、降低的免疫原性和它们以高效率稳定地转导大范围的不同细胞类型的能力而可用于基因递送。慢病毒载体经常在三种或更多种质粒(例如，包装、包膜和转移)向生产细胞中的瞬时转染以后产生。象HIV一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面上的受体的相互作用而进入靶细胞中。在进入后，病毒RNA经历反转录，其由病毒的逆转录酶复合物介导。反转录的产物是双链线性病毒DNA，其为受感染的细胞的DNA中的病毒整合的底物。

本文中使用的术语“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用并且是指可以连接在本文阐述的蛋白质的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常在从细胞分泌后从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白质)切割下来。信号肽/前导序列连接在所述蛋白质的N端，长度为约9至200个核苷酸(3至60个核酸)。本发明使用的信号肽可以是SARS-COV-2病毒S蛋白的信号肽序列或来自其它真核/病毒蛋白的信号肽序列。

本文中使用的术语“启动子”可以意指能够在细胞中赋予、激活或增强核酸表达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特异性转录调控序列以进一步增强其表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，其可以位于距转录起始位点多达几千个碱基对处。启动子可以源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子相对于其中发生表达的细胞、组织或器官，相对于发生表达时所处的发育阶段或响应于外部刺激诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂，可以组成性地或差异性地调控基因构件的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子以及CMV IE启动子。

本文中使用的术语“可操作地连接”意指基因的表达处于在空间上与之连接的启动子的控制之下。启动子可以定位在处于其控制之下的基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可与在该启动子所源自的基因中该启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如本领域所已知，该距离的变化可以在不失去启动子功能的情况下进行调节。

本文中使用的术语“表达载体”表示含有与合适的控制序列可操作地连接的核酸分子的DNA构建体，所述控制序列能够实现所述核酸分子在合适的宿主中的表达。这样的控制序列包括用于实现转录的启动子、任选的用于控制这样的转录的操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译的终止的序列。所述载体可以是质粒、噬菌体颗粒、病毒，或简单地是潜在基因组插入物。病毒载体可以是基于DNA(例如，腺病毒或痘苗病毒)或RNA的，包括溶瘤病毒载体(例如，VSV)，能复制的或不能复制的。一旦转化进合适的宿主中，所述载体可以独立于宿主基因组而复制和起作用，或在某些情况下，可以整合进基因组本身中。在本说明书中，“质粒”、“表达质粒”、“病毒”和“载体”经常互换使用。

本文中使用的术语“表达”表示基于基因的核酸序列而生产多肽的过程。所述过程包括转录和翻译。翻译可以开始于非常规起始密码子，诸如CUG密码子，或翻译可以开始于几种起始密码子(标准的AUG和非常规的)以产生比产生的mRNA更多的蛋白(基于每摩尔量)。

在将核酸序列插入细胞中的背景下，本文中使用的术语“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，且包括对核酸序列向真核或原核细胞中的整合的提及，其中所述核酸序列可以整合进细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体的DNA)中，转化成自主复制子，或短暂地表达(例如，转染的mRNA)。

用于在细胞中表达外源或异源核酸的重组方法是本领域众所周知的。这样的方法可以参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，ColdSpring Harbor Laboratory，New York(2001)；和Ausubel等人，Current ProtocolsinMolecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1999)。对编码融合抗原蛋白的核酸分子的遗传修饰可以给从它的天然存在状态改变的重组或非天然细胞赋予生化或代谢能力。

本文中使用的术语“抗原特异性的T-细胞应答”表示由针对表达特定抗原的细胞的T-细胞介导的免疫应答。在某些实施方式中，所述T-细胞应答是CD8⁺T-细胞应答、CD4⁺T-细胞应答或它们的组合。

本文中使用的术语“核酸分子免疫接种”或“DNA免疫接种”表示将编码一种或多种抗原的核酸分子引入宿主或宿主细胞中以便在体内表达所述一种或多种抗原。核酸分子免疫接种可以是通过直接施用进宿主中，诸如通过标准注射(例如，肌肉内、真皮内)、透皮颗粒递送、吸入、局部地、口服地、鼻内地或粘膜地。可替换地，可以将核酸分子离体引入宿主细胞(例如，宿主细胞或来自与宿主匹配的供体HLA的细胞)中，并可以将转染的宿主细胞施用进宿主中，使得可以引起针对由所述核酸分子编码的一种或多种抗原的免疫应答。

本文中使用的术语“佐剂”指通过增强巨噬细胞活性促进机体Ｔ细胞或Ｂ细胞的反应，参与半抗原或抗原免疫应答的天然的或合成的物质。细胞因子作为新型分子佐剂能增强疫苗的特异性免疫反应。可与本发明的免疫组合物共同施用的分子佐剂包括但不限于干扰素（IFN）、TNF-α、TNF-β、趋化因子如CCL21、嗜酸性粒细胞趋化因子、HMGB1、SA100-8α、GCSF、GMCSF、颗粒溶素、乳铁蛋白、卵白蛋白、CD-40L、CD28激动剂、PD-1、可溶性PD1、L1或L2、或白介素，如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-21、IL-23、IL-15、IL-17和IL-18。

本文中使用的术语“治疗”或“改善”表示受试者(例如，患者)的疾病、障碍或病症的医学管理，其可以是治疗性的、预防性的/防止性的或它们的联合治疗。治疗可以改善或减轻疾病的至少一种征状的严重程度，延迟疾病的恶化或进展，或延迟或阻止另外相关疾病的发作。“减小发生疾病的风险”表示预防或延迟疾病(例如，癌症)的发作或疾病的一种或多种征状的复发。

本文中使用的术语化合物或组合物的“治疗有效量(或剂量)”或“有效量(或剂量)”表示，足以以统计上显著的方式导致正在治疗的疾病的一种或多种征状的改善的化合物的量。精确量取决于众多因素，例如，组合物的活性、采用的递送的方法、组合物的免疫刺激能力、预期的患者和患者考虑因素等，且可以由本领域普通技术人员容易地确定。治疗效果可以直接地或间接地包括疾病的一种或多种征状的减轻，治疗效果还可以直接地或间接地包括细胞免疫应答的刺激。

本文中使用的术语“受试者”可以是能够发生细胞免疫应答的任何生物体，诸如人类、宠物、家畜、展示动物、动物园样本或其它动物。例如，受试者可以是人、非人灵长类动物、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、马、牛、绵羊、山羊、猪等。需要施用如本文中所述的治疗剂的受试者包括已被SARS-COV-2病毒感染甚至已经出现病毒感染相关疾病，或者处于SARS-COV-2病毒感染风险中的受试者。

本文中使用的术语“有需要的受试者”表示处于疾病、障碍或病症的高危中或遭受疾病、障碍或病症的受试者，所述疾病、障碍或病症适合用本文所提供的化合物或其组合物治疗或改善。在某些实施方式中，有需要的受试者是人。

对于包含如本文中所述的核酸分子的免疫组合物，期望的结果是能够以最小副作用诱导持久保护性免疫的安全产品，并且与其它策略(例如，完整活的或减毒的病原体)相比，廉价地生产，使已经在其它方面(通常)与完整的或减毒的病毒免疫组合物的应用相关联的禁忌最小化或消除，具有延长的贮存期限(因为它是以核酸和/或合成肽为基础的)。对传染性疾病紧急事件(天然爆发、大范围流行或生物恐怖主义)快速响应的能力是本文公开的实施方式的有效应用的一个益处，无论在生物防御还是免疫疗法或技术的背景下。

与常规的基于多肽的疫苗不同，DNA疫苗可以包含质粒形式的核酸(Li等人，J.Biotechnol.162：171，2012)或掺入用于递送的病毒载体的核酸中。如本领域普通技术人员会理解的，所述质粒DNA包括驱动本文所述的一个或多个转录单元的表达的启动子。通过例如肌肉内注射、皮下地、鼻内地、经粘膜呈递、静脉内地或通过真皮内或皮下施用，可以施用基于核酸的疫苗。

以下将对有关SARS-COV-2病毒的DNA疫苗发明通过具体实施的方式，对其进行举例说明。但应当理解这些实施例不以任何形式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：将SARS-COV-2 S1蛋白与抗原辅助序列的编码序列连接构建表达SARS-COV-2 S1-Hsp70融合抗原蛋白表达DNA载体

SARS-COV-2 S1-Hsp70融合抗原蛋白序列SEQ ID NO: 10的N端序列来源于SARS-COV-2 S1蛋白质的1-667位氨基酸序列，其中第1-13位氨基酸序列为该S蛋白质的信号肽序列。然后将S1蛋白通过三个甘氨酸组成的连接物（linker）与抗原辅助序列Hsp70的第2-625位氨基酸序列连接在一起（参见图1）。融合抗原蛋白的前体总长度为1294氨基酸残基，其中1-13位氨基酸残基组成的信号肽序列在成熟的融合抗原蛋白中被切除。

采用人体细胞优先表达密码子设计一编码全长1294氨基酸残基的DNA序列，然后人工合成3882bp长的cDNA片段，并在其5’和3’端分别加上KpnI和BamHI酶切位点。按照《Molecular Cloning: A laboratory manual》(ed by J. Sambrook & D.W. Russel,CSHLP出版， 4th edition) 进行分子克隆操作。用KpnI和BamHI内切酶（New EnglandBiolabs）分别对合成DNA片段(2μg)和pVax1载体(2μg)置37℃消化2小时。然后在琼脂糖凝胶电泳分离消化的DNA片段，将分离获得的DNA片段纯化。进一步将纯化的SARS-COV-2 S1-Hsp70 DNA片段与pVax1质粒片段进行DNA连接反应。标准连接反应中的总DNA约为100ng，载体质粒与插入片段比例约为1：3。连接后进行转化感受态大肠杆菌（1-2μl的连接反应液加入到100μl感受态大肠细胞DH5 alpha TOP10中）。 42℃热休克60秒，放入冰水中3分钟。吸取10μl在kanamycin琼脂糖平板上涂板，37℃过夜，选择菌斑培养，用QIAGEN公司生产的质粒纯化试剂药盒提取质粒DNA并进行酶切验证。这样得到3882bp长的SARS-COV-2 S1-Hsp70融合抗原蛋白编码cDNA片段克隆到真核表达载体pVax1中得目的表达载体。进一步将pVax1- SARS -COV-2 S1-Hsp70表达载体转染人293细胞系。将细胞裂解产物进行WesternBlot分析，结果如图2所示。用抗SARS -COV-2 S蛋白抗体可以检测到分子量为180 KDa左右的SARS-COV-2 S1-Hsp70融合抗原蛋白，这与设计结果相一致。

实施例2：将SARS-COV-2 S1蛋白与截短的抗原辅助序列Hsp70（Δ200）的编码序列连接构建表达SARS-COV-2 S1-Hsp70（Δ200）融合抗原蛋白的DNA表达载体

使用与实施例1相同的方法制备并检测了SARS-COV-2 S1与Hsp70（Δ200）（与前述融合抗原蛋白中包含的抗原辅助序列Hsp70相比，缺少N端200个氨基酸残基）的融合抗原蛋白SARS-COV-2 S1- Hsp70（Δ200）（参见SEQ ID NO: 12），所得结果同样与设计一致（图中未示出）。

实施例3：构建人IL-2、GM-CSF、IL-17和IFN-γ真核表达载体

按照实施例1中的常规分子克隆方法将编码人IL-2、GM-CSF、IL-17和IFN-γ的cDNA序列（所有这些cDNA序列均可自GenBank （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）获得，例如人IL-2 cDNA GenBank编号为NM_000586，人GM-CSF cDNA GenBank编号为M11220，人IFN-γ cDNA GenBank编号为NM_000619，人IL-17 cDNA GenBank编号为U32659）克隆到p_CDNA-3.1真核表达载体中，得到p_CDNA-3.1-IL-2、 p_CDNA-3.1-GM-CSF、p_CDNA-3.1-IL-17和 p_CDNA-3.1-IFN-γ表达载体质粒。用QIAGEN公司生产的质粒大量制备纯化试剂盒分别制备各种细胞因子表达载体10 mg备用。将上述细胞因子表达质粒分别转染293细胞系，48小时后收集各自的细胞培养上清液，用R&D Systems公司的人IL-2、GM-CSF、IL-17和IFN-γ细胞因子ELISA检测试剂盒检测细胞培养上清的细胞因子表达情况。结果如图3所示，这些细胞因子表达载体都可以在人源293细胞中分别介导合成相应的特异性细胞因子蛋白。

实施例4：DNA免疫

用QIAGEN公司生产的试剂盒大规模制备高度纯化的高质量的DNA表达载体，在免疫前将DNA溶于经优化的DNA细胞导入缓冲液（见表1）中，调节DNA浓度为1 μg/μl。在免疫pVax1- SARS -COV-2 S1-Hsp70和SARS-COV-2 S1- Hsp70（Δ200）表达质粒前两天先给Balb/c小鼠注射IL-2、GM-CSF、IL-17和IFN-γ DNA表达载体。在小鼠肌肉或皮下注射免疫DNA溶液，体积为30 μl。然后将30 μg/30μl SARS-COV-2 S1-Hsp70和SARS-COV-2 S1-Hsp70（Δ200）融合抗原表达质粒进行同一肌肉或皮下注射免疫。每2周免疫小鼠一次，共免疫三次后，抽取小鼠外周血，分离淋巴细胞和制备血清，以测定免疫小鼠对SARS-COV-2 S1蛋白质的细胞和体液免疫应答。

作为验证，如图4所示，使用本发明优化的DNA免疫方法非常有效地将绿色荧光蛋白（GFP）DNA表达载体介导进入小鼠肌肉细胞中表达。

表1.化学分子DNA细胞导入缓冲液(pH6.7)

*购自MedKoo Biosciences公司（CAT#555350），先用酒精溶解DLin-KC2-DMA 制备成储存液50mg/ml, 用前加入到缓冲液中。

实施例5：SARS-COV-2 S1-Hsp70和SARS-COV-2 S1- Hsp70（Δ200）融合抗原表达载体在小鼠中诱导SARS-COV-2 S1特异性抗体产生

将实施例4中经SARS-COV-2 S1-Hsp70 和SARS-COV-2 S1- Hsp70（Δ200）表达载体进行DNA免疫以及首次免疫后5周后的小鼠经尾静脉取血制备血清。同时用SARS-COV-2S1蛋白表达载体按相同DNA免疫程序免疫小鼠作为对照，也分别制备其免疫前和首次DNA免疫5周后的血清。然后根据《Antibody：A Laboratory Manual， Second edition， CSHLPress》标准酶联免疫检测（ELISA）方法测定小鼠血清中的S1特异性抗体滴度。将SARS-COV-2 S1蛋白（Sino Biological）1 μg/ml配置于pH9.6的碳酸盐缓冲液中包被于96孔酶标板上（100 μl/孔），置4℃过夜。次日移去包被液，用洗涤缓冲液（PBS含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。再用含10% BSA 和0.05%吐温-20的PBS缓冲液封闭37 ℃1小时。用洗涤缓冲液（PBS含0.05%吐温-20）洗1次。接着将小鼠血清于PBS缓冲液中按不同比例稀释加入酶标板中（100μl/孔）与S1蛋白进行反应，37℃作用1小时。然后用洗涤缓冲液（PBS含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。再加入用稀释缓冲液稀释的抗小鼠IgG-HRP标记的二抗（CellSignaling Technology， Inc）（100μl/孔）检测酶标板中的小鼠IgG，37℃作用1小时。再用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。加入底物溶液(OPD)（100μl/孔），室温作用30分钟。每孔加2M H₂SO₄ 50 μl。用酶标比色计测定（492nm）OD值。结果如图5和表2所示，SARS-COV-2 S1-Hsp70和SARS-COV-2 S1- Hsp70（Δ200）DNA表达载体免疫诱导产生S1蛋白特异性抗体量显著高于SARS-COV-2 S1蛋白DNA表达载体免疫所诱导的抗体量，在各稀释滴度都几乎达到非融合抗原蛋白的两倍。通过与抗原辅助序列Hsp70蛋白融合而针对S1抗原显著增强的体液免疫效应令人惊讶。同时，预料不到的是，相比SARS-COV-2 S1-Hsp70，截短了长达200个氨基酸残基的SARS-COV-2 S1- Hsp70（Δ200），其DNA表达载体免疫诱导产生的S1蛋白特异性抗体的量与SARS-COV-2 S1-Hsp70的DNA表达载体相当。

表2：融合抗原表达载体诱导产生的S1蛋白特异性抗体量

实施例6：除去抗原辅助序列Hsp70蛋白的N端的200个氨基酸残基减少了融合抗原蛋白诱导的Hsp70特异性抗体生成。

用pVax1-SARS-COV-2 S1-Hsp70和pVax1-SARS-COV-2 S1-Hsp70（Δ200）表达载体免疫小鼠5周后自尾静脉取血制备血清。作为对照也制备其免疫前的血清。然后根据《Antibody：A Laboratory Manual，Second edition，CSHL Press》标准酶联免疫检测（ELISA）方法测定小鼠血清中的Hsp70特异性抗体滴度。将Hsp70蛋白（Creative Biomart）1μg/ml配置于pH9.6的碳酸盐缓冲液中包被于96孔酶标板上（100 μl/孔），置4 ℃过夜。次日移去包被液，用洗涤缓冲液（PBS含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。再用含10% BSA 和0.05%吐温-20的PBS缓冲液封闭37℃ 1小时。用洗涤缓冲液（PBS含0.05%吐温-20）洗1次。接着将小鼠血清于PBS缓冲液中按不同比例稀释加入酶标板中（100μl/孔）与S1蛋白进行反应，37℃作用1小时。然后用洗涤缓冲液（PBS含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。再加入用稀释缓冲液稀释的抗小鼠IgG-HRP标记的二抗（Cell Signaling Technology，Inc）（100μl/孔）检测酶标板中的小鼠IgG，37℃作用1小时。再用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。加入底物溶液(OPD)（100μl/孔），室温作用30分钟。每孔加2M H₂SO₄ 50 μl。用酶标比色计测定（492nm）OD值。结果如图6和表3所示，SARS-COV-2 S1-HSP70 (Δ200) DNA表达载体免疫诱导产生的Hsp70蛋白特异性抗体量明显低于SARS-COV-2 S1-Hsp70 DNA表达载体免疫所诱导的抗体量，证实采用本发明的特定截短融合抗原架构，极大地减小了融合抗原蛋白中的抗原辅助部分导致的不期望的免疫原性，使得机体免疫能力进一步聚焦于融合抗原蛋白的S1部分，提高了机体免疫系统资源的利用率。如此，SARS-COV-2 S1-HSP70 (Δ200) 在基本保持其诱导产生中和抗体能力的同时，还大幅降低了不期望的免疫原性，在安全性方面显示了令人惊讶的优势。

表3：融合抗原表达载体诱导产生的Hsp70蛋白特异性抗体量

实施例7： SARS-COV-2 S1-Hsp70 和SARS-COV-2 S1-Hsp70（Δ200）融合抗原蛋白的构建促进其 pVax1 DNA 表达载体在机体内的清除。

按实施例 4 的方法用 pVAX1-SARS-COV-2 S1-Hsp70 和pVAX1-SARS-COV-2 S1-Hsp70 （Δ200）DNA 表达载体免疫Balb /c 小鼠一次，5 周后取小鼠免疫部位的肌肉组织制备其细胞裂解物，用 PCR 方法测定其中存在的 pVax1 表达载体。 PCR 实验操作如文献所述（Green, M.R: Molecular cloning, A Laboratory Manual (4th) , Cold SpringHarbour Press, 2012）。合成一对寡聚核苷酸引物：(1) 5’GGAGGATTGGGAAG 3’； (2) 5’CCACCGCTGGTAG3’。引物1对应的是 pVax1 质粒 1001-1014 位核苷酸序列，引物2对应的是pVax1质粒 2401-2413 位核苷酸序列。以上述细胞裂解物为检测样本，进行如下 PCR 反应（反应混合物如下）：

反应前将反应物置 94℃、5 分钟。 PCR 反应环境为 94℃、1 分钟； 55℃、1 分钟； 72℃、1 分钟。反应为 35 个循环。最后一个循环置 72℃、10 分钟。然后取 1μl PCR反应产物于 1% 琼脂糖电泳胶中进行电泳分析，结果如图7所示，可见一 1.4 kb 大小的 DNA 条带，这与对应于前述引物对的扩增产物序列大小相符。

PCR 检测发现，免疫后五周，pVAX1-SARS-COV-2 S1-Hsp70 （泳道2）和pVAX1-SARS-COV-2 S1-Hsp70 （Δ200）（泳道5）DNA 表达载体均完全从小鼠免疫部位的组织中消失，这意味着含有该DNA表达载体的细胞都完全被清除。相比之下，pVAX1-SARS-COV-2 S1（泳道3）、pVAX1-Hsp70（泳道4）或二者的混合（泳道1）均未诱导其相应pVAX1 表达载体从机体细胞清除（图 7）。这证明 SARS-COV-2 S1-Hsp70 和SARS-COV-2 S1-Hsp70 （Δ200）融合抗原蛋白疫苗的设计在刺激产生有效的机体保护性免疫应答的同时，还避免了外源DNA载体在体内的长期驻留，由此消除了长期驻留可能引发的不良反应如毒副作用，增强了疫苗安全性。

实施例8：SARS-COV-2 S1-Hsp70和SARS-COV-2 S1-Hsp70（Δ200）融合抗原蛋白表达载体诱导产生的S1特异性中和抗体对S1蛋白质与人肺上皮细胞结合的阻断作用

将人原代肺泡上皮细胞（HPAEpiC）（美国ACCEGEN Biotechnology）以100 μl（含20000细胞）/孔接种于96孔培养板中，培养基为该公司提供的HPAEPiC完全培养基。将细胞置37℃ 5% CO₂培养箱中培养24小时后，除去培养基，用PBS洗两次。再用4% Formaldehyde（100μl/孔）室温固定20分钟。用含0.05%吐温-20的PBS缓冲液洗三次。然后加入含1% H₂O₂的PBS缓冲液（100/孔）置室温25分钟。用含0.05%吐温-20的PBS缓冲液洗三次。接着用含10%FBS和0.05%吐温-20的PBS缓冲液封闭37℃ 1小时。然后去除封闭缓冲液。用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20的PBS）洗1次。同时将实施例5中的小鼠抗血清按照不同比例于PBS中稀释，然后将稀释的小鼠抗血清1:1与生物素化的SARS-COV-2 S1蛋白溶液（10 μg/ml in PBS）混合，置37℃孵育30分钟。然后加入到细胞培养板中去（100μl /孔），置37℃孵育1小时。然后用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20的PBS）洗3次，每次5分钟。再加入用稀释缓冲液稀释的HRP标记的Avidin（Cell Signaling Technology， Inc）（100μl/孔）到细胞培养板中，置37℃作用1小时。再用洗涤缓冲液（PBS含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。加入底物溶液(OPD)（100μl/孔），室温作用30分钟。每孔加2M H₂SO₄50 μl。用酶标比色计测定（492nm）OD值。结果如图8所示，分别用SARS-COV-2 S1-Hsp70 DNA表达载体、SARS-COV-2 S1- Hsp70（Δ200）DNA表达载体和SARS-COV-2 S1 DNA表达载体免疫的小鼠中和抗体血清均显著抑制S1蛋白与人肺泡上皮细胞的结合，由此确认各自诱导产生的S1蛋白特异性抗体是针对人细胞系有效的中和性抗体。然而出乎意料的是，发现SARS-COV-2 S1-Hsp70 和SARS-COV-2 S1-Hsp70（Δ200）DNA疫苗的抑制效应明显高于非融合的SARS-COV-2 S1 DNA疫苗。而且，相比SARS-COV-2 S1-Hsp70 DNA表达载体，用其中抗原辅助序列Hsp70被截短多达200个氨基酸的SARS-COV-2 S1-Hsp70（Δ200）DNA表达载体免疫的小鼠中和抗体血清在阻止S1蛋白与人肺泡上皮细胞的结合能力方面并未明显下降。未免疫的小鼠血清无此中和作用（参见图8和表4）。

表4：融合抗原表达载体诱导产生的抗体血清阻止S1蛋白与人肺泡上皮细胞的结合

实施例9: SARS-COV-2 S1-Hsp70和SARS-COV-2 S1- Hsp70（Δ200）DNA疫苗免疫诱导小鼠T细胞免疫应答。

将实施例5中经SARS-COV-2 S1-Hsp70、SARS-COV-2 S1- Hsp70（Δ200）和SARS-COV-2 S1 DNA表达载体分别免疫的小鼠，在首次免疫5周后取其脾脏在10%血清的RPMI1640培养基中制成细胞悬液。然后采用尼龙毛柱法分离T淋巴细胞。将日本WAKO公司生产的尼龙毛1克填装于10 ml的一次性注射器针筒中，灭菌消毒后，用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基平衡尼龙毛柱。将小鼠脾脏细胞悬液2 ml（含5x10⁸个脾细胞）加入柱中，置37℃孵育30分钟。然后用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基洗脱下T淋巴细胞。将T细胞用该培养基洗涤一次，然后在含10%胎牛血清RPMI 1640培养基中调节细胞密度为5X10⁶/ml，以200μl细胞悬液/孔将T细胞加入到96孔细胞培养板中培养。该培养板已预先含有1 x10⁴/孔小鼠脾脏粘附细胞。小鼠脾脏粘附细胞按常规方法分离制得（Rosenwasser, L.J. & Rosenthal,A.S. : J. Immunol. 120:1991, 1978）。然后加入1 ng/孔SARS-COV-2 S1蛋白刺激T细胞，置37℃ CO₂培养箱中培养。24小时后取培养上清，用R&D Systems公司的小鼠IL-2和IFN-γELISA试剂盒测定其中IL-2和IFN-γ的生成情况。结果如图9和表5所示，分别用SARS-COV-2S1-Hsp70 和SARS-COV-2 S1- Hsp70（Δ200）DNA载体免疫的小鼠T细胞比用SARS-COV-2 S1DNA载体免疫的小鼠T细胞产生的IL-2和IFN-γ水平显著增高大约100%且两者相当，而未经免疫的小鼠T细胞产生极低水平的IL-2和IFN-γ。

表5：融合DNA疫苗免疫的小鼠T细胞产生的细胞因子的量

实施例10：SARS-COV-2 S1-Hsp70和SARS-COV-2 S1- Hsp70（Δ200）DNA疫苗免疫的小鼠T细胞对表达SARS-COV-2 S1蛋白的小鼠3T3细胞的杀伤作用。

首先用表达全长SARS-COV-2 S1蛋白的pcDNA3.1质粒转染小鼠3T3细胞。将转染的细胞按常规方法进行⁵¹Cr标记（Nelson, D.L. et al: Current Protocols inImmunology, 1993. https://doi.org/10.1002/0471142735.im0727s08 ）。将标记后的细胞于含10%胎牛血清DMEM培养基中加入到96孔细胞培养板中（5x10⁴细胞/孔），置37℃ 5%CO₂培养箱中培养4小时后，加入实施例9中分离的T淋巴细胞（同一含10%胎牛血清DMEM培养基，1x10⁶细胞/孔）。在CO₂培养箱中连续培养6小时后，1000g离心培养板10分钟。每孔吸取100μl上清液在液闪计数仪上测定CPM值。细胞杀伤活性按照以下公式计算：T细胞杀伤活性（%）=[（实验组CPM-自发释放CPM）/（最大释放CPM-自发释放CPM）] x100%。结果如图10和表6所示：分别用SARS-COV-2 S1-Hsp70和SARS-COV-2 S1- Hsp70（Δ200）DNA疫苗免疫的小鼠T细胞对表达SARS-COV-2 S1蛋白的3T3细胞的杀伤作用相当，且与用SARS-COV-2 S1 DNA表达载体免疫的小鼠T细胞相比显著增强大约100%。没有免疫的小鼠T细胞对该SARS-COV-2 S1表达载体转染的3T3细胞无杀伤作用。

表6：融合DNA疫苗免疫的小鼠T细胞对3T3细胞的杀伤活性

在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所描述的产品、方法和用途的各种修改和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的。尽管已经结合具体实施方式描述了本发明，但是应当理解，要求保护的本发明能够作进一步修改，并且不应当不适当地受限于这样的特定实施方式。实际上，对于本领域技术人员显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的各种修改是旨在落入本发明的范围内。本申请旨在涵盖总体遵循本发明的原理且包括从本公开到本发明所属领域内的已知惯用实践内并且可以应用于本文前文说明的必要特征的这样的偏离的本发明的任何变化、用途或改编。

序列表

<110> 艾立克（北京）生物科技有限公司

<120> 针对SARS-COV-2病毒的DNA疫苗及其用途

<130> 20200612

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1962

<212> DNA

<213> 冠状病毒(coronavirus)

<400> 1

agcgatctgg atcgctgcac cacctttgat gatgtgcagg cgccgaacta tacccagcat 60

accagcagca tgcgcggcgt gtattatccg gatgaaattt ttcgcagcga taccctgtat 120

ctgacccagg atctgtttct gccgttttat agcaacgtga ccggctttca taccattaac 180

catacctttg gcaacccggt gattccgttt aaagatggca tttattttgc ggcgaccgaa 240

aaaagcaacg tggtgcgcgg ctgggtgttt ggcagcacca tgaacaacaa aagccagagc 300

gtgattatta ttaacaacag caccaacgtg gtgattcgcg cgtgcaactt tgaactgtgc 360

gataacccgt tttttgcggt gagcaaaccg atgggcaccc agacccatac catgattttt 420

gataacgcgt ttaactgcac ctttgaatat attagcgatg cgtttagcct ggatgtgagc 480

gaaaaaagcg gcaactttaa acatctgcgc gaatttgtgt ttaaaaacaa agatggcttt 540

ctgtatgtgt ataaaggcta tcagccgatt gatgtggtgc gcgatctgcc gagcggcttt 600

aacaccctga aaccgatttt taaactgccg ctgggcatta acattaccaa ctttcgcgcg 660

attctgaccg cgtttagccc ggcgcaggat atttggggca ccagcgcggc ggcgtatttt 720

gtgggctatc tgaaaccgac cacctttatg ctgaaatatg atgaaaacgg caccattacc 780

gatgcggtgg attgcagcca gaacccgctg gcggaactga aatgcagcgt gaaaagcttt 840

gaaattgata aaggcattta tcagaccagc aactttcgcg tggtgccgag cggcgatgtg 900

gtgcgctttc cgaacattac caacctgtgc ccgtttggcg aagtgtttaa cgcgaccaaa 960

tttccgagcg tgtatgcgtg ggaacgcaaa aaaattagca actgcgtggc ggattatagc 1020

gtgctgtata acagcacctt ttttagcacc tttaaatgct atggcgtgag cgcgaccaaa 1080

ctgaacgatc tgtgctttag caacgtgtat gcggatagct ttgtggtgaa aggcgatgat 1140

gtgcgccaga ttgcgccggg ccagaccggc gtgattgcgg attataacta taaactgccg 1200

gatgatttta tgggctgcgt gctggcgtgg aacacccgca acattgatgc gaccagcacc 1260

ggcaactata actataaata tcgctatctg cgccatggca aactgcgccc gtttgaacgc 1320

gatattagca acgtgccgtt tagcccggat ggcaaaccgt gcaccccgcc ggcgctgaac 1380

tgctattggc cgctgaacga ttatggcttt tataccacca ccggcattgg ctatcagccg 1440

tatcgcgtgg tggtgctgag ctttgaactg ctgaacgcgc cggcgaccgt gtgcggcccg 1500

aaactgagca ccgatctgat taaaaaccag tgcgtgaact ttaactttaa cggcctgacc 1560

ggcaccggcg tgctgacccc gagcagcaaa cgctttcagc cgtttcagca gtttggccgc 1620

gatgtgagcg attttaccga tagcgtgcgc gatccgaaaa ccagcgaaat tctggatatt 1680

agcccgtgca gctttggcgg cgtgagcgtg attaccccgg gcaccaacgc gagcagcgaa 1740

gtggcggtgc tgtatcagga tgtgaactgc accgatgtga gcaccgcgat tcatgcggat 1800

cagctgaccc cggcgtggcg catttatagc accggcaaca acgtgtttca gacccaggcg 1860

ggctgcctga ttggcgcgga acatgtggat accagctatg aatgcgatat tccgattggc 1920

gcgggcattt gcgcgagcta tcataccgtg agcctgctgc gc 1962

<210> 2

<211> 654

<212> PRT

<213> 冠状病毒(coronavirus)

<400> 2

Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn

1 5 10 15

Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu

20 25 30

Ile Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro

35 40 45

Phe Tyr Ser Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly

50 55 60

Asn Pro Val Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu

65 70 75 80

Lys Ser Asn Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn

85 90 95

Lys Ser Gln Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile

100 105 110

Arg Ala Cys Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser

115 120 125

Lys Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe

130 135 140

Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser

145 150 155 160

Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn

165 170 175

Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val

180 185 190

Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys

195 200 205

Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala

210 215 220

Phe Ser Pro Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe

225 230 235 240

Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn

245 250 255

Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu

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Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln

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Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro

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Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys

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Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val

325 330 335

Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys

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Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn

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Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile

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Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp

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Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His

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Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser

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Pro Asp Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro

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Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr

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Val Cys Gly Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val

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Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser

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Ser Lys Arg Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp

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Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile

545 550 555 560

Ser Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn

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Ala Ser Ser Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp

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Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile

595 600 605

Tyr Ser Thr Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile

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Gly Ala Glu His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly

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Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr

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Ser Thr Arg Met Pro Ala Val Thr Asp Leu Val Lys Glu Leu Thr Gly

785 790 795 800

Gly Lys Glu Pro Asn Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val

805 810 815

Gly Ala Ala Leu Gln Ala Gly Val Leu Lys Gly Glu Val Lys Asp Val

820 825 830

Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Lys Gly

835 840 845

Gly Val Met Thr Arg Leu Ile Glu Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys

850 855 860

Arg Ser Glu Thr Phe Thr Thr Ala Asp Asp Asn Gln Pro Ser Val Gln

865 870 875 880

Ile Gln Val Tyr Gln Gly Glu Arg Glu Ile Ala Ala His Asn Lys Leu

885 890 895

Leu Gly Ser Phe Glu Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Ile

900 905 910

Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His

915 920 925

Val Thr Ala Lys Asp Lys Gly Thr Gly Lys Glu Asn Thr Ile Arg Ile

930 935 940

Gln Glu Gly Ser Gly Leu Ser Lys Glu Asp Ile Asp Arg Met Ile Lys

945 950 955 960

Asp Ala Glu Ala His Ala Glu Glu Asp Arg Lys Arg Arg Glu Glu Ala

965 970 975

Asp Val Arg Asn Gln Ala Glu Thr Leu Val Tyr Gln Thr Glu Lys Phe

980 985 990

Val Lys Glu Gln Arg Glu Ala Glu Gly Gly Ser Lys Val Pro Glu Asp

995 1000 1005

Thr Leu Asn Lys Val Asp Ala Ala Val Ala Glu Ala Lys Ala Ala Leu

1010 1015 1020

Gly Gly Ser Asp Ile Ser Ala Ile Lys Ser Ala Met Glu Lys Leu Gly

1025 1030 1035 1040

Gln Glu Ser Gln Ala Leu Gly Gln Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Gln Ala

1045 1050 1055

Ala Ser Gln Ala Thr Gly Ala Ala His Pro Gly Gly Glu Pro Gly Gly

1060 1065 1070

Ala His Pro Gly Ser Ala Asp Asp Val Val Asp Ala Glu Val Val Asp

1075 1080 1085

Asp Gly Arg Glu Ala Lys

1090

Claims

1.一种融合蛋白，其由SEQ ID NO: 10的氨基酸序列或SEQ ID NO:10的14-1294位的氨基酸序列组成。

2.一种融合蛋白，其由SEQ ID NO: 12的氨基酸序列或SEQ ID NO:12的14-1094位的氨基酸序列组成。

3.一种编码权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:11组成。

5.一种载体，其包含权利要求4所述的多核苷酸序列。

6.一种组合物，其包含：

（1）权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白，或权利要求3或4所述的多核苷酸序列，或权利要求5所述的载体；和

（2）药学上可接受的载体和/或赋形剂。

7.权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白、或权利要求3或4所述的多核苷酸序列、或权利要求5所述的载体、或权利要求6所述的组合物在制备用于在有需要的受试者中治疗或预防SARS-COV-2病毒感染和/或相关疾病的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，所述治疗或预防还包括在向所述受试者施用所述药物之前，向所述受试者施用选自人GM-CSF、IL-2、IFN-γ和/或IL-17中的一种或多种的细胞因子、或编码所述细胞因子的多核苷酸、或包含所述多核苷酸的载体。

9.一种用于在有需要的受试者中治疗或预防SARS-COV-2病毒感染和/或相关疾病的试剂盒，其包括：

（1）权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白、或权利要求3或4所述的多核苷酸序列、或权利要求5所述的载体、或权利要求6所述的组合物；和