CN111528470A - 一种刺梨酸钙复合物的制备方法及其产品和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种刺梨酸钙复合物的制备方法及其产品和应用，制备方法为：(1)将刺梨果洗净，打浆或榨汁；(2)取刺梨果浆/果汁、白糖和纯化水混合，采用三段式酵素化工艺，依次用酒曲、酵母、醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液进行发酵，得到刺梨发酵液；(3)将步骤(2)所得刺梨发酵液与碳酸钙反应，反应完成后静置，取上清液，过滤，即得；还公开了其产品和应用。本发明制备方法能充分利用刺梨中的有效成分,与钙形成复合钙，得到的刺梨酸钙复合物除含有丰富的蛋白质、维生素等营养物质外，还含有刺梨三萜、黄酮、刺梨多糖等功能性成分，经药效实验表明其增加骨密度效果显著，且能辅助降血糖，为刺梨产业链以及大健康产业链的发展提供了依据。

Description

一种刺梨酸钙复合物的制备方法及其产品和应用
技术领域
本发明涉及植物酸钙复合物的制备及应用，尤其涉及一种刺梨酸钙复合物的制备方法及其产品和应用。
背景技术
刺梨为蔷薇科植物单瓣缫丝花Rosa roxburghii Tratt.f.normalis Rehd.etWils.及缫丝花Rosa roxburghii Tratt.的果实，是贵州苗族特色药材，列入《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003版)。刺梨药用及保健价值较高，被广泛用于中成药、民间验方、医院制剂、保健食品等的配方。目前以刺梨为主要原料生产的中成药有血脂平胶囊、小儿消食开胃颗粒、康艾扶正胶囊等。
刺梨最早记载于《黔书》，其果实、根、叶、花均可入药，分别具有健胃消食、滋养补虚、强身壮体、涩精止泻、清热解暑等不同的功用，现代药理学研究证实，刺梨富含多种化合物质及营养成分，具有延缓衰老、调理自身免疫机能、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、解毒、镇静等多种功效，具有潜在的临床应用前景。钙是骨骼的重要组成成分，人体中有99％的钙存在于骨骼和牙齿之中。机体钙缺乏时，由于缺少构成骨的原材料，且钙由骨组织中游离出来进入血液，导致骨量降低，骨小梁缩小稀疏，骨板变薄，所以钙缺乏会导致佝偻病、骨软化症、骨质疏松症等骨骼疾病。
发明内容
本发明的目的是提供一种刺梨酸钙复合物的制备方法及其产品和应用，充分利用刺梨中的有效成分，与钙形成复合钙，可制备出人体易吸收的钙液，增强人体骨密度，能辅助降血糖，为刺梨的产业链以及大健康产业链的发展提供依据。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种刺梨酸钙复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将刺梨果洗净，打浆或榨汁；
(2)取刺梨果浆/果汁、白糖和纯化水混合，采用三段式酵素化工艺，依次用酒曲、酵母、醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液进行发酵，得到刺梨发酵液；
(3)将步骤(2)所得刺梨发酵液与碳酸钙反应，反应完成后静置，取上清液，过滤，即得。
前述刺梨酸钙复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将刺梨果洗净，以4000-10000r/min转速均匀打浆或榨汁；
(2)以质量份计算，取刺梨果浆或刺梨果汁20-30份，白糖5-10份，纯化水40-90份，其中刺梨与纯化水的质量比为1:2-3；采用三段式酵素化工艺，即依次在18-23℃下用酒曲发酵16-50天、25-30℃下用酵母发酵13-43天、28-32℃下用醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液发酵30-110天，三个温度阶段共发酵2-6个月，得到刺梨发酵液；
(3)步骤(2)所得刺梨发酵液，pH值为2-4，加入碳酸钙，温度20-40℃条件下搅拌反应1h-3h,反应至溶液pH值为6-7，静置，取上清液，过滤，即得。
前述刺梨酸钙复合物的制备方法，所述步骤(1)中，刺梨果打浆的转速为7500r/min。
前述刺梨酸钙复合物的制备方法，所述步骤(2)具体为：取刺梨25份，白糖8份，纯化水75份，采用三段式酵素化工艺，先加入酒曲在21℃发酵16天后，再加入酵母在27℃发酵14天，然后加入醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液30℃下发酵30天，三个温度阶段共发酵2个月，得到刺梨发酵液。
前述刺梨酸钙复合物的制备方法，所述步骤(3)具体为：步骤(2)所得刺梨发酵液，pH值为2.5-2.9，按照刺梨发酵液：碳酸钙＝20:7-9的质量比例加入含量≥98％的碳酸钙，温度30℃条件下搅拌反应1.5h，反应至溶液pH值为6.6，静置，取上清液，过滤，即得。
前述刺梨酸钙复合物的制备方法，步骤(1)所述刺梨果为刺梨鲜果，先剔除杂物和烂果，然后用水洗净。
前述制备方法制得的刺梨酸钙复合物，其钙含量为6-8mg/mL。
前述刺梨酸钙复合物在制备预防骨质疏松、增加骨密度保健品中的应用。
前述刺梨酸钙复合物在制备降血糖保健品中的应用。
发明人在研究过程中发现刺梨酸钙复合物增加骨密度效果显著，且能辅助降血糖。为了保证本发明提供的刺梨酸钙复合物制备方法及其产品和应用的科学、合理、有效，发明人通过以下试验进行研究和确认，最终确定了本发明的技术方案。
一、增加骨密度实验(参照增加骨密度功能评价方法动物实验)
实验动物分组按照小鼠体重随机分为5组，即正常对照组、低钙组、碳酸钙组、低剂量和高剂量刺梨酸钙组，每组12只。除正常对照组外，其余4组喂词低钙基础饲料。灌胃剂量参考人体(成年人体质量60kg)每日需摄入钙量800mg，即13.3mg Ga/kg/D，低、高剂量刺梨酸钙复合物组分别设定为人体剂量的3倍和9倍，即39.9mg Ga/kg/D和119.7mg Ga/kg/D；碳酸钙组灌胃剂量同高剂量刺梨酸钙复合物组，即119.7mg Ga/kg/D。正常对照组和低钙组灌胃等体积去离子水。灌胃30天，采用下列方法测定血清钙、骨钙含量和检查骨密度。
1.小鼠血清Ca的测定采用试剂盒(甲基百里香酚蓝法，MTB法)进行测定：
1.1 眼眶取血，置4℃冰箱3h，取血浆样品待用。
1.2 配置钙显色剂：取Ca Assay Buffer和MTB显色液等量混合，即为Ca显色工作液。
1.3 Ca加样：取用经稀盐酸处理及去离子水清洁的96孔板，按照下表进行加样，设置平行组。
加入物(μL) 空白孔 标准孔 测定孔
ddH<sub>2</sub>O 2.5 - -
钙标准 - 2.5 -
待测样品 - - 2.5
Ca显色工作液 200 200 200
1.4 测定：室内静止10min,以空白孔调零，酶标仪610nm测定。
2.骨钙含量测定参照食品安全国家标准食品中钙的测定(标准编号：GB5009.92—2016)
2.1 钙标准储备液:500μg/mL，称取在100℃烘干至恒重的钙标准物质0.1248g于100mL烧杯中，加入去离子水10mL，然后缓慢加入50％盐酸3-4mL，使其完全溶解后，与电热炉上煮沸赶去二氧化碳，冷却至室温后，将烧杯中剩余的液体转移至100mL容量瓶中，使用去离子水冲洗烧杯内壁3-4次，定容至100mL。
2.2 钙标准使用液:100μg/mL，取钙标准储备液10mL，去离子水定容于50mL容量瓶中。
2.3 取0.1g样品，完全硝化稀释待测样品，待用。
2.4 检测条件：Agilent 240FS火焰原子吸收；阴极灯：Ca灯，灯电流10mA,波长422.7nm；狭缝：0.5nm；火焰：空气/乙炔。
经小鼠血清Ca的测定及骨钙含量测定，测定结果见表1
表1大鼠灌胃刺梨酸钙复合物后血清钙及骨钙含量
Figure BDA0002472210180000031
跟模型组相比较p*＜0.05,p**＜0.001。
结论:刺梨酸钙复合物组具有较好的补钙功效。
3.骨密度检查
取大鼠左侧股骨，于骨密度检测仪下检测(医院骨密度仪拍摄)，检查结果见图1。
结论：低钙饮食大鼠灌胃刺梨酸钙后骨密度跟低钙饮食模型组相比有明显的补钙功效。
二、降血糖实验(参照辅助降血糖保健食品功能评价方法动物实验)
1.II型糖尿病小鼠模型
1.1 C57BL/6J T2DM小鼠模型
采用高脂喂养C57BL/6J小鼠并联合小剂量STZ注射诱导，建立化学诱导型T2DM小鼠模型，对刺梨进行体内降糖活性评价。将3周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠适应饲养1周后，随机分为正常组(NC)与造模组，NC组喂养普通饲料，造模组喂养60％高脂饲料4周后，连续腹腔注射STZ(40mg/kg/day)1周，注射结束后监测FBG 3周，待血糖稳定升高且FBG>11.1mmol/L时造模成功，造模成功率为95.74070，造模成功后进入药效评价阶段。
1.2 C57BL/6J T2DM小鼠模型的分组与给药
除NC组外，将造模成功的小鼠随机分为5组，即模型组(DM)、阳性对照组(MF-500mg/kg/day),刺梨酸钙复合物低剂量组(L-25g/kg/day),刺梨酸钙复合物中剂量组(M-50g/kg/day),刺梨酸钙复合物高剂量组(H-100g/kg/day)，每组15只。除NC组喂养普通饲料其余各组均喂养60％高脂饲料。给药方式为每天定点灌胃10mL/kg，连续治疗4周。
2.检测
2.1 体重、摄食量及饮水量的检测
进入药效学评价阶段后，每周定时称量并统计小鼠体重；以笼为单位每天定时定量供给食物和水并记录初始量，于24h后记录剩余量，最终计算结果以只为单位(C57BL/6Jn＝5)。
2.2 空腹血糖(FBG)的检测
进入药效学评价阶段后，每周定时检测小鼠FBG。小鼠测量FBG前禁食8h，自由饮水，8h后剪尾采血测量FBG。
2.3 口服糖耐量(OGTT)的检测
EGH治疗4周后，各小鼠禁食8h检测其FBG，当FBG>8.33mmol/L时，灌胃浓度为20％葡萄糖溶液，当小鼠FBG<8.33mmol/L时，灌胃浓度为10％葡萄糖溶液；胃体积为10μL/g。灌胃后于0min,30min,60min及120min测各小鼠FBG，以积分面积(AUC)来表示OGTT:AUC(mmol/L.min)＝(FBGO+FBG30)×1S+(TBG30+FBG60)×15+(FBG60+TBG120)×30
3.实验结果
3.1 刺梨酸钙复合物对小鼠空腹血糖的影响见表2
表2刺梨酸钙复合物对小鼠空腹血糖的影响
Figure BDA0002472210180000051
与正常组比较*p<0.001,与模型组比较**p<0.01,***p<0.001。
结论：刺梨酸钙复合物对小鼠空腹血糖降糖率最高可达25％，具有辅助降血糖的功效。
3.2 刺梨酸钙复合物对糖尿病小鼠脂质代谢的影响，见图2。
结论：刺梨酸钙复合物高剂量组对糖尿病小鼠血清脂质水平有较好控制作用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的制备方法对刺梨果浆或刺梨果汁采用三段式酵素化工艺进行发酵，得到的发酵液中富含丰富的短链脂肪酸，能促进肠道对钙的吸收；在发酵液基础上充分利用刺梨中的有效成分,与钙形成复合钙，得到的刺梨酸钙复合物除含有丰富的蛋白质、维生素等营养物质外，还含有刺梨三萜、黄酮、刺梨多糖等功能性成分，经药效实验结果表明刺梨酸钙复合物增加骨密度效果显著，且能辅助降血糖。本发明为刺梨的产业链以及大健康产业链的发展提供了依据。
附图说明
图1为刺梨酸钙组与各对照组大鼠左侧股骨骨密度仪检查结果对比图，其中：
Ⅰ：正常组；Ⅱ：低钙组；Ⅲ：碳酸钙组；Ⅳ：刺梨酸钙组；
图2为刺梨酸钙复合物对糖尿病小鼠脂质代谢影响对比图，其中：
FFA：游离脂肪酸；TG:甘油三酯；TC：血清总胆固醇；NC:正常组；DC：模型组；MF：二甲双胍组；L：刺梨酸钙复合物低剂量组；M：刺梨酸钙复合物中剂量组；H：刺梨酸钙复合物高剂量组；与正常组比较*p<0.001,与模型组比较**p<0.01,***p<0.001。
具体实施方式
实施例1：一种刺梨酸钙复合物的制备方法：
(1)将刺梨果先剔除杂物和烂果，然后用水洗净，打浆机以7500r/min转速均匀打浆；
(2)以质量份计算，取刺梨果浆25份，白糖8份，纯化水75份，其中刺梨果浆与纯化水的质量比例为1:3；采用三段式酵素化工艺，先加入酒曲在21℃发酵16天后，再加入酵母在27℃发酵14天，然后加入醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液30℃下发酵30天，三个温度阶段共发酵2个月，得到刺梨发酵液；
(3)步骤(2)所得刺梨发酵液，pH值为2，按照刺梨发酵液：碳酸钙＝20:7的质量比例加入含量≥98％的食品级碳酸钙，温度30℃条件下搅拌反应1.5h，反应至溶液pH值为6.6，静置，取上清液，过滤，即得；所得刺梨酸钙复合物含钙量7.3mg/mL。
实施例2：一种刺梨酸钙复合物的制备方法：
(1)将刺梨果先剔除杂物和烂果，然后用水洗净，打浆机以4000r/min转速均匀打浆；
(2)以质量份计算，取刺梨果浆20份，白糖5份，纯化水40份，其中刺梨果浆与纯化水的质量比例为1:2；采用三段式酵素化工艺，先加入酒曲在21℃发酵25天后，再加入酵母在27℃发酵20天，然后加入醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液30℃下发酵75天，三个温度阶段共发酵4个月，得到刺梨发酵液；
(3)步骤(2)所得刺梨发酵液，pH值为4，按照刺梨发酵液：碳酸钙＝20:9的质量比例加入含量≥98％的食品级碳酸钙，温度20℃条件下搅拌反应3h，反应至溶液pH值为6，静置，取上清液，过滤，即得；所得刺梨酸钙复合物含钙量6.8mg/mL。
实施例3：一种刺梨酸钙复合物的制备方法：
(1)将刺梨果先剔除杂物和烂果，然后用水洗净，打浆机以10000r/min转速均匀打浆；
(2)以质量份计算，取刺梨果浆30份，白糖10份，纯化水90份，其中刺梨果浆与纯化水的质量比例为1:3；采用三段式酵素化工艺，先加入酒曲在21℃发酵40天后，再加入酵母在27℃发酵30天，然后加入醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液30℃下发酵110天，三个温度阶段共发酵6个月，得到刺梨发酵液；
(3)步骤(2)所得刺梨发酵液，pH值为3，按照刺梨发酵液：碳酸钙＝20:8的质量比例加入含量≥98％的碳酸钙，温度40℃条件下搅拌反应1h，反应至溶液pH值为7，静置，取上清液，过滤，即得；所得刺梨酸钙复合物含钙量7.3mg/mL。
实施例4：一种刺梨酸钙复合物的制备方法：
(1)将刺梨果先剔除杂物和烂果，然后用水洗净，榨汁机榨汁；
(2)以质量份计算，取刺梨果汁30份，白糖10份，纯化水90份，其中刺梨果汁与纯化水的质量比例为1:3；采用三段式酵素化工艺，先加入酒曲在21℃发酵19天后，再加入酵母在27℃发酵13天，然后加入醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液30℃下发酵28天，三个温度阶段共发酵2个月，得到刺梨发酵液；
(3)步骤(2)所得刺梨发酵液，pH值为4，按照刺梨发酵液：碳酸钙＝20:8的质量比例加入含量≥98％的药品级碳酸钙，温度40℃条件下搅拌反应1.5h，反应至溶液pH值为6.5，静置，取上清液，过滤，即得；所得刺梨酸钙复合物含钙量7.2mg/mL。
实施例5：一种刺梨酸钙复合物的制备方法：
(1)将刺梨果先剔除杂物和烂果，然后用水洗净，榨汁机榨汁；
(2)以质量份计算，取刺梨果汁28份，白糖8份，纯化水70份，其中刺梨果汁与纯化水的质量比例为1:2.5；采用三段式酵素化工艺，先加入酒曲在21℃发酵45天后，再加入酵母在27℃发酵35天，然后加入醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液30℃下发酵70天，三个温度阶段共发酵5个月，得到刺梨发酵液；
(3)步骤(2)所得刺梨发酵液，pH值为2.5，按照刺梨发酵液：碳酸钙＝20:7的质量比例加入碳酸钙，温度20℃条件下搅拌反应3h，反应至溶液pH值为6，静置，取上清液，过滤，即得；所得刺梨酸钙复合物含钙量6.8mg/mL。
实施例6：一种刺梨酸钙复合物的制备方法：
(1)将刺梨果先剔除杂物和烂果，然后用水洗净，榨汁机榨汁；
(2)以质量份计算，取刺梨果汁20份，白糖5份，纯化水40份，其中刺梨果汁与纯化水的质量比例为1:2；采用三段式酵素化工艺，先加入酒曲在21℃发酵50天后，再加入酵母在27℃发酵43天，然后加入醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液30℃下发酵87天，三个温度阶段共发酵6个月，得到刺梨发酵液；
(3)步骤(2)所得刺梨发酵液，pH值为2，按照刺梨发酵液：碳酸钙＝20:9的质量比例加入含量≥98％的碳酸钙，温度35℃条件下搅拌反应1h，反应至溶液pH值为7，静置，取上清液，过滤，即得；所得刺梨酸钙复合物含钙量7.1mg/mL。
实施例7：一种刺梨酸钙复合物的制备方法：
(1)将刺梨果洗净，打浆机以6000r/min转速均匀打浆；
(2)以质量份计算，取刺梨果浆25份，白糖8份，纯化水75份，其中刺梨果浆与纯化水的质量比例为1:3；采用三段式酵素化工艺，先加入酒曲在18℃发酵30天后，再加入酵母在25℃发酵25天，然后加入醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液28℃下发酵95天，三个温度阶段共发酵5个月，得到刺梨发酵液；
(3)步骤(2)所得刺梨发酵液，pH值为2，按照刺梨发酵液：碳酸钙＝20:8的质量比例加入含量≥98％的碳酸钙，温度20℃条件下搅拌反应3h，反应至溶液pH值为6，静置，取上清液，过滤，即得；所得刺梨酸钙复合物含钙量6.9mg/mL。
实施例8：一种刺梨酸钙复合物的制备方法：
(1)将刺梨果洗净，榨汁机榨汁；
(2)以质量份计算，取刺梨果汁20份，白糖5份，纯化水40份，其中刺梨果汁与纯化水的质量比例为1:2；采用三段式酵素化工艺，先加入酒曲在23℃发酵27天后，再加入酵母在30℃发酵15天，然后加入醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液32℃下发酵48天，三个温度阶段共发酵3个月，得到刺梨发酵液；
(3)步骤(2)所得刺梨发酵液，pH值为3，按照刺梨发酵液：碳酸钙＝20:9的质量比例加入含量≥98％的食品级碳酸钙，温度35℃条件下搅拌反应1h，反应至溶液pH值为7，静置，取上清液，过滤，即得；所得刺梨酸钙复合物含钙量7.2mg/mL。
以上刺梨酸钙复合物中钙含量的测定方法(参照食品安全国家标准食品中钙的测定(标准编号：GB5009.92—2016))如下：
1.镧溶液:50g/L，称取氧化镧14.66g溶解于30mL盐酸中，并稀释定容至250mL；本试验选用50mL待测样品溶液中，加入镧溶液2mL。
2.钙标准储备液:500μg/mL，称取在100℃烘干至恒重的钙标准物质0.1248g于100mL烧杯中，加入去离子水10mL，然后缓慢加入50％盐酸3-4mL，使其完全溶解后，与电热炉上煮沸赶去二氧化碳，冷却至室温后，将烧杯中剩余的液体转移至100mL容量瓶中，使用去离子水冲洗烧杯内壁3-4次，定容至100mL。
3.钙标准使用液:100μg/mL，取钙标准储备液10mL，去离子水定容于50mL容量瓶中。
取1ml待测样品，定容至250mL，待用。
4.检测条件：Agilent 240FS火焰原子吸收；阴极灯：Ca灯，灯电流10mA,波长422.7nm；狭缝：0.5nm；火焰：空气/乙炔。
实施例9：
将实施例1-8所得刺梨酸钙复合物按常规技术制成保健品，可用于预防骨质疏松、增加骨密度。
实施例10：
将实施例1-8所得刺梨酸钙复合物按常规技术制成保健品，可用于辅助降血糖。

Claims (9)

1.一种刺梨酸钙复合物的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：
(1)将刺梨果洗净，打浆或榨汁；
(2)取刺梨果浆/果汁、白糖和纯化水混合，采用三段式酵素化工艺，依次用酒曲、酵母、醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液进行发酵，得到刺梨发酵液；
(3)将步骤(2)所得刺梨发酵液与碳酸钙反应，反应完成后静置，取上清液，过滤，即得。
2.根据权利要求1所述刺梨酸钙复合物的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：
(1)将刺梨果洗净，以4000-10000r/min转速均匀打浆或榨汁；
(2)以质量份计算，取刺梨果浆或刺梨果汁20-30份，白糖5-10份，纯化水40-90份，其中刺梨与纯化水的质量比为1:2-3；采用三段式酵素化工艺，即依次在18-23℃下用酒曲发酵16-50天、25-30℃下用酵母发酵13-43天、28-32℃下用醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液发酵30-110天，三个温度阶段共发酵2-6个月，得到刺梨发酵液；
(3)步骤(2)所得刺梨发酵液，pH值为2-4，加入碳酸钙，温度20-40℃条件下搅拌反应1h-3h,反应至溶液pH值为6-7，静置，取上清液，过滤，即得。
3.根据权利要求2所述刺梨酸钙复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，刺梨果打浆的转速为7500r/min。
4.根据权利要求2所述刺梨酸钙复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为：取刺梨25份，白糖8份，纯化水75份，采用三段式酵素化工艺，先加入酒曲在21℃发酵16天后，再加入酵母在27℃发酵14天，然后加入醋酸菌和植物乳杆菌的混合菌液30℃下发酵30天，三个温度阶段共发酵2个月，得到刺梨发酵液。
5.根据权利要求2所述刺梨酸钙复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)具体为：步骤(2)所得刺梨发酵液，pH值为2.5-2.9，按照刺梨发酵液：碳酸钙＝20:7-9的质量比例加入含量≥98％的碳酸钙，温度30℃条件下搅拌反应1.5h，反应至溶液pH值为6.6，静置，取上清液，过滤，即得。
6.根据权利要求1或2或3所述刺梨酸钙复合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述刺梨果为刺梨鲜果，先剔除杂物和烂果，然后用水洗净。
7.如权利要求1-6任一项所述制备方法制得的刺梨酸钙复合物，其钙含量为6-8mg/mL。
8.如权利要求7所述刺梨酸钙复合物在制备预防骨质疏松、增加骨密度保健品中的应用。
9.如权利要求7所述刺梨酸钙复合物在制备降血糖保健品中的应用。
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