CN111527195A - 用产生短链脂肪酸的肠道细菌群落的改变诊断和治疗酒精性肝病的组合物 - Google Patents
用产生短链脂肪酸的肠道细菌群落的改变诊断和治疗酒精性肝病的组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及能够用作酒精性脂肪肝的生物标志物的细菌菌株，以及用于预防或治疗酒精性脂肪肝的药物组合物、用于预防或改善酒精性脂肪肝的食品组合物或用于预防或改善酒精性脂肪肝的益生菌组合物，每种组合物包含所述细菌菌株作为有效成分。
Description
技术领域
本发明涉及包含具有改善酒精性脂肪肝病症状的功效的罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia)微生物的、用于诊断酒精性脂肪肝病的组合物，能够检测该菌株的试剂以及使用包含该菌株的肠道菌群预测或诊断酒精性脂肪肝病的风险的试剂盒。
背景技术
酒精性肝病(ALD)的病因是酒精，酒精很容易在胃肠道中吸收，其中2％至10％被肾脏和肺部清除，其余主要在肝脏中被氧化。已知长期饮酒会通过各种途径引起肝细胞的脂肪代谢失衡，从而诱发酒精性脂肪肝病。
通常，已知酒精性肝损害的机理是，消耗的酒精中约70％被乙醇脱氢酶(ADH)转化为乙醛，而其余的30％被细胞色素P450 2E1转化为乙醛，但最近的研究表明在酒精性肝炎患者中显著增加的肠道菌和作为内毒素之一的脂多糖(LPS)是酒精性肝损害的重要原因。
肠道菌群的组成比例与人体的免疫状态密切相关。当肠道上皮细胞之间的紧密连接受到抑制并且因长期饮酒而出现肠道渗漏现象时，肠道革兰氏阴性细菌的LPS大量通过门静脉移动，并由于诱导肝中的库普弗细胞(Kupffer cell)的活性和产生炎性细胞因子而引起重度肝损伤。
使用下一代序列分析方法进行细菌聚类分析已使对包括非培养物在内的菌群的分析成为可能，并且正在进行确定微生物基因组多样性与疾病之间关系的研究。
肠道菌群除了与肠道全身免疫性有关之外，还可能与次级器官(如肝脏、脑和肾脏)的疾病症状有关，并且已经发现，不仅肠道菌群的组成比例，而且特定菌株的获得对于免疫系统也非常重要。
因此，有必要鉴定出具有改善酒精性脂肪肝病症状的作用的肠道微生物，从而开发使用该肠道微生物诊断酒精性脂肪肝病的技术。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种具有改善酒精性脂肪肝病的活性的罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia)菌株。
本发明的一个目的是提供一种用于诊断酒精性脂肪肝病的组合物，该组合物包含能够检测肠道罗斯拜瑞氏菌属菌株的试剂。
本发明的一个目的是提供一种用于提供与酒精性脂肪肝病的诊断相关的信息的方法，该方法包括：
第一步，测量受试者的肠道中存在的具有缓解酒精性脂肪肝病症状的活性的罗斯拜瑞氏菌属菌株的量；
第二步，测量用酒精摄取处理的对照组的肠道中存在的具有缓解酒精性脂肪肝病症状的活性的罗斯拜瑞氏菌属菌株的量；和
第三步，比较第一步和第二步中测量的罗斯拜瑞氏菌属菌株的量。
技术方案
本发明涉及使用下一代序列分析方法进行肠道菌群分析，以及使用这种肠道菌群分析开发通过酒精摄取量改变的微生物群系生物标志物，特别地，已经分离出了与该微生物群系生物标志物相对应的肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)，并且通过小鼠实验已经确认了改善酒精性脂肪肝病症状的作用，从而完成了本发明。具体地，本发明人发现了从健康的韩国人分离的肠道罗斯拜瑞氏菌SNUG30017菌株，已确认改善酒精性脂肪肝病症状的作用，并且完成了本发明。
一方面，本发明涉及一种罗斯拜瑞氏菌属菌株，其具有预防或改善酒精性脂肪肝病的活性。
本发明的另一种实施方式涉及用于预防或治疗酒精性脂肪肝病的药物组合物，该药物组合物包含选自由根据本发明的罗斯拜瑞氏菌属菌株的微生物细胞、该菌株的鞭毛提取物、该菌株的培养物以及培养物的浓缩物和干燥产物组成的组中的一种或多种。
本发明的其他实施方式涉及用于预防或改善酒精性脂肪肝病的食品组合物，该食品组合物包含选自由根据本发明的罗斯拜瑞氏菌属菌株的微生物细胞、该菌株的鞭毛提取物、该菌株的培养物以及培养物的浓缩物和干燥产物组成的组中的一种或多种。
本发明的其他实施方式涉及用于预防或改善酒精性脂肪肝病的益生菌制剂，该益生菌制剂包含选自由根据本发明的罗斯拜瑞氏菌属菌株的微生物细胞、该菌株的鞭毛提取物、该菌株的培养物以及培养物的浓缩物和干燥产物组成的组中的一种或多种。
罗斯拜瑞氏菌属菌株可以导致肠道菌群的多样性增加，或与代谢相关的肠道菌群的功能性增加。
本发明的其他实施方式涉及用于诊断酒精性脂肪肝病的组合物，所述组合物包含用于定量存在于受试者肠道中的根据本发明的罗斯拜瑞氏菌属菌株的试剂。
该组合物可以包含用于定量作为脂肪酸代谢物的丁酸和丙酸的浓度的试剂。
本发明的其他实施方式涉及一种用于提供与酒精性脂肪肝病的诊断相关的信息的方法，该方法包括：第一步，测量受试者的肠道中存在的具有缓解酒精性脂肪肝病症状的活性的罗斯拜瑞氏菌属菌株的量；第二步，测量酒精摄取处理的对照组的肠道中存在的具有缓解酒精性脂肪肝病症状的活性的罗斯拜瑞氏菌属菌株的量；和第三步，比较第一步和第二步中测量的罗斯拜瑞氏菌属菌株的量。
在下文中，将更详细地描述本发明。
作为酒精摄取后肠道菌群分析的结果，根据本发明的具有改善酒精性脂肪肝病活性的罗斯拜瑞氏菌属菌株例如在低酒精摄取的正常组中显示出相关性，显示出相关性的罗斯拜瑞氏菌属菌株被选择为根据本发明的具有改善酒精性脂肪肝病活性的罗斯拜瑞氏菌属菌株。本发明的罗斯拜瑞氏菌属菌株可以源自肠道菌群。
罗斯拜瑞氏菌属菌株可以显示出通过加强肠上皮细胞之间的紧密连接来改善酒精性脂肪肝病的活性。具体地，已经确认当添加罗斯拜瑞氏菌属菌株时，上皮细胞膜的上皮阻力增加，并增强肠上皮细胞之间的结合(实施例7)。
罗斯拜瑞氏菌属菌株可以是选自由以下菌株组成的组中的一种或多种：肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)和人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)。
罗斯拜瑞氏菌属菌株可以是肠道罗斯拜瑞氏菌。
罗斯拜瑞氏菌属菌株可以是肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)SNUG30017。
罗斯拜瑞氏菌属菌株可以是人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)DSM 16839。
根据本发明的罗斯拜瑞氏菌属菌株可以是具有如下至少一种特性的菌株。
(1)加强上皮细胞之间的紧密连接，增加上皮细胞膜的上皮阻力，增加Zo-1和闭合蛋白(Occludin)基因的表达，或增加MUC2基因的表达，
(2)降低酒精性脂肪肝的致病物质(例如血液脂多糖(LPS))的浓度，
(3)改善肝脏损伤，降低血液ALT浓度，降低血液AST浓度，降低肝脏甘油三酯，通过体内屏障通透性实验进行的在FITC施用期间降低血液中FITC荧光表达，或作为油红O染色的结果减少肝脏的脂肪含量，
(4)减少引起脂肪肝的基因的表达，或减少PPAR-γ和CD36基因的表达，
(5)改善或治疗肝脏损害症状，或减少CXCL2和CXCL5基因的表达，
(6)减少肝脏中的炎性反应，或减少TNF-α和IL-1β基因的表达，
(7)肠道菌群恢复和多样性增加，
(8)DNA修复和新陈代谢相关的肠道菌群功能增强。
根据本发明的一种实施方式加强罗斯拜瑞氏菌属菌株的上皮细胞之间的紧密连接的特性意指维持或增加紧密连接的功能，并且具体地，它可以是增加紧密连接活性或增加紧密连接蛋白(例如膜蛋白、闭合蛋白)的mRNA表达。根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株增加人源的大肠细胞系Caco-2细胞系中的紧密连接蛋白表达，从而改善肠细胞之间的紧密连接特性。
例如，将菌株施用至Caco-2细胞后24小时，显示跨上皮电阻(TEER)的增加率(％)是对照组(图8a)的1倍以上、1.2倍以上、1.4倍以上、1.6倍以上、1.8倍以上或2倍以上，而且具有增强上皮细胞之间结合的作用，并且可以缓解酒精性脂肪肝病的症状。
TEER是一种定量技术，被广泛接受用于测量内皮和上皮单层细胞培养模型中紧密连接动力学的完整性。TEER值是显示在估计药物或化学物质递送之前细胞屏障完整性的有力指标。TEER测量可以实时进行而不会损坏细胞，通常，它基于宽频谱中的欧姆电阻测量或阻抗测量。利用TEER广泛表征的屏障模型包括胃肠道(GI)血管模型，并且可以用作胃肠道细胞层的电阻/肠上皮间隙的完整性的指标。
例如，当施用罗斯拜瑞氏菌属菌株时，Zo-1表达与对照组相比可以为100％以上、105％以上、110％以上或120％以上(图15a)。
例如，当施用根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株时，闭合蛋白表达与对照组相比可以为100％以上、105％以上、110％以上、115％以上、120％以上、125％以上、130％以上、135％以上或140％以上(图15a)。
例如，当施用根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株时，MUC2表达与对照组相比可以为100％以上、105％以上、110％以上、115％以上、120％以上、125％以上、130％以上、135％以上或140％以上(图15a)。
根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株的减少酒精性脂肪肝病的致病物质的作用可以减少作为酒精性脂肪肝病或酒精性肝炎的致病物质的脂多糖(LPS)的血液浓度，从而以改善酒精性脂肪肝。例如，当向C57BL/6J小鼠施用罗斯拜瑞氏菌属菌株以及酒精时，血液LPS浓度与仅施用乙醇的对照组相比可以为90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下或62％以下(图11)。
根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株的改善或治疗肝损伤的作用可以改善酒精性脂肪肝，从而与未用罗斯拜瑞氏菌属菌株处理的对照组对比，在罗斯拜瑞氏菌属菌株处理组中降低作为显示肝损伤程度指标的血液ALT浓度、血液AST浓度、肝脏的甘油三酯、通过体内屏障通透性实验得到的在FITC施用期间的血液FITC荧光表达和/或作为油红O染色的结果的肝脏脂肪的量。
例如，当施用根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株时，血液ALT浓度与对照组相比可以为100％以下、95％以下、90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下或50％以下。
例如，当施用根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株时，血液AST浓度与对照组相比可以为100％以下、95％以下、90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下或50％以下。
例如，当施用根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株时，肝脏的甘油三酯浓度(肝脏TG)与对照组相比可以为100％以下、95％以下、90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下或50％以下。
例如，当施用根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株时，血液FITC荧光表达与对照组相比可以为100％以下、95％以下、90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、74％以下、或73％以下。
例如，当施用根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株时，作为油红O染色的结果的脂肪的量与对照组相比可以为100％以下、95％以下、90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、55％以下或50％以下。
根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株可以改善酒精性脂肪肝，并且当罗斯拜瑞氏菌属菌株与酒精一起施用时，与未用罗斯拜瑞氏菌属菌株处理的对照组相比，罗斯拜瑞氏菌属菌株处理组中引起脂肪肝的基因的表达降低，从而确认了改善酒精引起的脂肪肝的作用。
例如，当施用根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株时，与肝脏中的脂肪代谢(例如甘油三酯合成和脂肪酸运输)有关的基因PPAR-γ的表达与对照组相比可以为90％以下、85％以下、80％以下或75％以下(图14)。
例如，当施用根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株时，在肝脏中与脂肪代谢(例如甘油三酯合成和脂肪酸转运)有关的基因CD36的表达与对照组相比可以为90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下或25％以下。
根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株可以改善由酒精引起的肝脏中的炎性反应的增加，并且当罗斯拜瑞氏菌属菌株与酒精一起施用时，与未用罗斯拜瑞氏菌属菌株处理的对照组相比，罗斯拜瑞氏菌属菌株处理组中炎性细胞因子或趋化因子基因的表达降低，从而确认了改善酒精引起的脂肪肝的作用。
例如，当施用根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株时，活化嗜中性粒细胞募集的作为炎性细胞因子之一的趋化因子CXCL2和/或CXCL5基因的表达与对照组相比可以为90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下或25％以下。
例如，当施用根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株时，称为炎性细胞因子的TNF-α和/或IL-1β基因的表达与对照组相比可以为90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、70％以下、65％以下、60％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下或25％以下。
根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株的加强上皮细胞之间紧密连接的特性可能是由于罗斯拜瑞氏菌属菌株的鞭毛。具体而言，在实施例8中，作为测量肠上皮膜的跨上皮电阻(TEER)和FITC通透性的结果，分别处理罗斯拜瑞氏菌属菌株、罗斯拜瑞氏菌属菌株的培养物和罗斯拜瑞氏菌属菌株的鞭毛之后，确认了当添加罗斯拜瑞氏菌属菌株的鞭毛时，跨上皮电阻显著增加，并且在罗斯拜瑞氏菌属菌株来源的鞭毛中具有加强肠道上皮细胞之间结合的作用，并且可以改善酒精性脂肪肝病。
本发明的药物组合物可以根据常规方法通过分别配制成口服制剂(例如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软膏剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等)或者肠胃外制剂(例如经皮剂、栓剂和无菌注射溶液)等来使用。
当作为肠胃外制剂提供根据本发明的药物组合物时，作为一个实例，它可以是局部施用剂(例如液体、凝胶剂、清洁组合物、片剂、栓剂、霜剂、软膏、敷料溶液、喷雾剂、其他搽剂等)或液体制剂(例如溶液剂、混悬剂、乳剂等)，它可以包括皮肤外用药，例如无菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干剂、栓剂、霜剂、软膏、胶冻、泡沫或清洁剂，优选液体、凝胶、清洁组合物等。作为一个实例，制剂可以通过向无菌水中添加增溶剂、乳化剂、用于调节pH的缓冲液等来制备。
作为非水溶剂或悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、可注射酯(例如油酸乙酯)等。
本发明的药物组合物可以进一步包含药学上合适的和生理上可接受的助剂，例如载体、赋形剂和稀释剂等。
本发明的药物组合物中包含的载体、赋形剂和稀释剂可以是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。配制时，可以使用稀释剂或赋形剂，例如常用的填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等。
根据本发明的药物组合物可以通过各种途径施用至包括人的哺乳动物。施用方法可以是所有常用方法，例如，可以通过口服，真皮，静脉内，肌内，皮下途径等施用，并且优选可以口服施用。
在将本发明的药物组合物应用至人的具体实施方式中，本发明的药物组合物可以单独施用，但是通常，考虑到施用方法和标准药物实践，可以通过与选择的药物载体混合来施用。
例如，可以将本发明的含有罗斯拜瑞氏菌属菌株的组合物以含有淀粉或乳糖的片剂形式、单独或含有赋形剂的胶囊剂形式或含有化学调味剂或着色剂的酏剂或悬浮液形式口服、肠胃外或舌下施用。
本发明的药物组合物的剂量可以根据患者的年龄、体重、性别、施用形式、健康状况和疾病程度而不同，并且可以取决于医生或药剂师的决定分成每天一次至几次地定期给药。例如，基于活性成分的含量，日剂量可以为0.1至500mg/kg，优选0.5至300mg/kg。剂量是对平均情况的举例说明，取决于个人差异，剂量可高或可低。
另外，当本发明的药物组合物的日剂量小于该剂量时，不能获得显著的效果，而当其超过该剂量时，这是不经济的，并且也超出了在平均剂量的范围，因此可能引起不良的副作用，因此上述范围是优选的。
对于根据本发明的其他实施方式的用于预防或改善酒精性脂肪肝病的食品组合物，食品意指含有一种或多种营养素的天然产品或加工品，优选意指其经过一定程度的加工后可以直接食用，并且旨在包括常规意义上的所有食品、食品添加剂、保健功能食品、饮料和饮料添加剂。在本发明中，饮料是用于饮用以解渴或享受味道的通用术语，并且旨在包括功能性饮料。
根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属可以被包含在各种可食用产品中，例如乳制品、酸奶、凝乳、奶酪(例如夸克奶酪、奶油奶酪、加工奶酪、软奶酪、硬奶酪)、发酵油、奶粉、乳基发酵产品、冰淇淋、谷物发酵基产品、乳基粉、饮料、调料和宠物饲料。本文中的术语“食品”是最广泛的含义，包括除了药物产品和兽医产品以外的可以被动物摄取的所有提供的形式的所有类型的产品。
对于饮料，除了含有罗斯拜瑞氏菌属菌株作为必需组分之外，对液体组分没有特别限制，并且作为普通饮料，可以含有各种调味剂或天然碳水化合物等作为附加组分。
前述天然碳水化合物的实例是常见糖，例如单糖(例如葡萄糖、果糖等)、二糖(例如麦芽糖、蔗糖等)和多糖(例如糊精、环糊精等)；以及糖醇，例如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等。作为除上述以外的调味剂，可以有利地使用天然调味剂(甜蛋白、甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等))和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。天然碳水化合物的比例通常为每100mL本发明的食品组合物约1至20g，优选约5至12g。
本发明的食品组合物可包含各种营养补充剂，维生素，矿物质(电解质)，调味剂(例如合成调味剂和天然调味剂)、着色剂和填充剂(奶酪、巧克力等)，果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、碳酸饮料中使用的碳化剂等。
另外，本发明的食品组合物可以包含用于制备天然果汁和果汁饮料以及蔬菜饮料的果肉。这些组分可以单独使用或组合使用。
当根据本发明的组合物用作膳食补充剂时，它可以原样施用，或与合适的可饮用液体(例如水、酸奶、牛奶或果汁等)混合，或与固体或液体食品混合。在这方面，膳食补充剂可以是片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、混悬剂、小袋剂、锭剂、甜味剂、棒剂、糖浆剂以及相应的剂型，通常是单位剂量形式。优选地，本发明的组合物可以以通过药物产品的常规制备方法制备的片剂、胶囊剂或粉剂的形式给药。
根据本发明的一种实施方式的食品组合物中所含的作为活性成分的罗斯拜瑞氏菌属菌株的含量可以根据食品形式、期望的用途等适当地调整而没有特别限定，例如，作为总食品重量的活性成分，选自由罗斯拜瑞氏菌属菌株的微生物细胞、罗斯拜瑞氏菌属菌株的培养物、菌株的裂解物和菌株的提取物中组成的组中的一种或多种的添加量可以为0.00001重量％至100重量％、0.001重量％至99.9重量％、0.1重量％至99重量％，更优选为1重量％至50重量％、0.01至15重量％。例如，基于100mL的食品组合物，可以0.02至10g，优选0.3至1g的比例添加。
根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株，特别地，具有可作为益生菌使用的优势，因此，可以提供包含根据本发明的罗斯拜瑞氏菌属菌株的益生菌组合物。根据本发明的罗斯拜瑞氏菌属菌株通过具有预防或改善酒精性脂肪肝的特性可以作为有用的益生菌制剂使用。
益生菌应满足与毒性缺乏、生存力、附着性和有用的作用相关的几个要求。这些益生菌特征即使在同一细菌物种中也是菌株依赖性的。因此，重要的是开发对所有益生菌要求均表现出优异性能的菌株，并且已证明该菌株具有优异的益生菌特性。另外，用于益生菌组合物中的菌株的优选条件可以包括胃内活性损失低和对肠中各种抗生素的抗性。
益生菌被定义为“当以一定数量消耗时，提供超过必需基本营养的健康优势的活微生物(Araya M.等人，2002；Guarner F.等人，1998)”。益生菌包括多种乳酸菌和双歧杆菌物种，这意味着这些菌株已被证明具有促进特定健康的作用。益生菌应满足与毒性缺乏、生存力、附着性和有用的作用相关的几个要求。另外，据报道，改善肠道免疫力的作用应伴随着维持肠细胞之间紧密连接的功能和炎性细胞因子的减少、抗炎细胞因子的增加、维持肠道菌群的平衡等。因此，重要的是开发出针对所有益生菌要求均具有优异性能的菌株。
因此，用于益生菌组合物中的菌株的优选条件可以包括胃内活性损失低和对肠中各种抗生素的抗性。
本文使用的术语“用于诊断的标志物或诊断标志物”是作为区分酒精性脂肪肝病状态和非酒精性脂肪肝病状态的标准的物质，并且包括显示酒精性脂肪肝病患者的样品与正常样品相比升高或降低的各种有机生物分子等。为了本发明的目的，根据本发明的一种实施方式的用于诊断的组合物是指在酒精性脂肪肝病患者中以特别高的水平表达的罗斯拜瑞氏菌属菌株，并且是指与相应菌株呈正相关的瘤胃球菌属(Ruminococcus sp.)菌株、布劳特氏菌属(Blautia sp.)菌株和/或梭菌属(Clostridium sp.)菌株微生物或群集。
优选地，检测试剂意指被用于检测样品中作为酒精性脂肪肝的诊断标志物存在的罗斯拜瑞氏菌属菌株、瘤胃球菌属菌株、布劳特氏菌属菌株和/或梭菌属菌株的物质。例如，它可以是选自由可以特异性检测有机生物分子(例如蛋白质、核酸、脂质、糖脂、糖蛋白或糖(单糖、二糖、寡糖等)等)的引物、探针、反义寡核苷酸、适体和抗体组成的组中的一种或多种，所述有机生物分子特异性地存在于罗斯拜瑞氏菌属菌株、瘤胃球菌属菌株、布劳特氏菌属菌株和/或梭菌属菌株中。
在本文中，微生物检测剂可以是抗体，并且相应的微生物可以使用基于抗原-抗体反应的免疫学方法检测。用于此的分析方法包括蛋白质印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)、放射免疫扩散、欧氏免疫扩散(Ouchterlony immunodiffusion)、火箭免疫电泳、免疫组织染色、免疫沉淀测定、补体固定测定、FACS(荧光激活细胞分选仪)、蛋白质芯片等，但不限于此。
本文中使用的术语“风险预测”是指确定测试受试者是否可能发展为酒精性脂肪肝病或相关疾病，并且可以在临床上用于通过对酒精性脂肪肝病的发展或相关疾病的发生的高风险测试受试者进行特殊和适当管理来延迟发作或停止发作，或用于通过选择最合适的治疗方法来确定治疗方式。另外，“诊断”意指确认病理状况的存在或特性，并且出于本发明的目的，诊断可以意指确认酒精性脂肪肝病的发展或相关疾病的发生。
根据本发明的一种实施方式，包含能够检测罗斯拜瑞氏菌属菌株的试剂的组合物可以以高灵敏度检测酒精性脂肪肝病或酒精性脂肪肝相关疾病，包括具有高检测特异性的所有菌株。
作为本发明的另一种实施方式，可以以用于风险预测或诊断酒精性脂肪肝病或酒精性脂肪肝相关疾病的试剂盒的形式提供包含用于检测本发明的微生物的试剂的组合物。本发明的试剂盒可包含用于检测相应微生物的检测试剂，例如引物、探针、反义寡核苷酸、适体和/或抗体，并且此外，可包含适用于该分析方法的一种或多种其他组分组合物、液体或装置。
作为一个具体实例，本发明中包含对相应微生物具有特异性的引物的试剂盒可以是包含用于进行扩增反应(例如聚合酶链式反应(PCR)等)的基本元件的试剂盒。例如，用于PCR的试剂盒可以包括试管或其他合适的容器、反应缓冲液、脱氧核苷酸(dNTP)、酶(例如Taq-聚合酶，逆转录酶)、DNA酶、RNA酶抑制剂、DEPC-水、无菌水等。
该试剂盒可包括用于采集样品的血液或肠液采集设备，并且该采集设备还可包括选自由以下的采集设备组成的组中的一种或多种：刷子、吸收垫、棉棒、滴管、拭子、注射器和羊水收集器，但能够收集生物样品的任何采集设备均不受限制。
另外，该试剂盒还可包括用于收集测试受试者的样品以预测或诊断酒精性脂肪肝并或酒精性脂肪肝相关疾病的风险的说明书。
作为本发明的其它实施方式，本发明涉及用于检测选自由罗斯拜瑞氏菌属菌株、瘤胃球菌属菌株、布劳特氏菌属菌株和/或梭菌属菌株组成的组中的微生物中的一种或多种以提供使用罗斯拜瑞氏菌属菌株风险预测或诊断酒精性脂肪肝病或酒精性脂肪肝相关疾病所需的信息的方法。
与用于风险预测或诊断酒精性脂肪肝病或酒精性脂肪肝相关疾病的组合物有关的主题可以同样地应用于检测微生物的方法。
优选地，可以通过包括以下步骤来实施该方法：(a)收集测试受试者的样品；(b)从样品中提取基因组DNA；使特异于罗斯拜瑞氏菌属菌株的引物与提取的基因组DNA反应；(c)扩增反应产物。
在步骤(a)中，从预测为酒精性脂肪肝病或酒精性脂肪肝相关疾病的患者的人体收集“测试受试者的样品”，并且“测试受试者的样品”包括诸如血液、肠液、组织、细胞、全血、血清、血浆唾液、粪便或尿液的样品，但是例如，“测试受试者的样品”可以是血液、肠液、收集自测试受试者的肠的组织，优选是粪便样品。
在步骤(b)中，可以通过应用本领域已知的常规技术从测试受试者的样品中提取基因组DNA，特异于罗斯拜瑞氏菌属菌株的引物如上所述。
在步骤(c)中，用于扩增反应产物的方法可以是本领域已知的普通扩增技术，例如，聚合酶链式反应、SYBR实时PCR、逆转录-聚合酶链式反应、多重PCR、降落PCR、热起动PCR、巢式PCR、增强PCR、实时PCR、差异显示PCR、cRNA末端的快速扩增、反向PCR、小载体PCR、TAIL-PCR、连接酶链式反应、修复链式反应、转录介导的扩增、自我维持序列复制和靶序列的选择性扩增反应，但是本发明的范围不限于此。
另外，可以进一步进行：(d)将步骤(c)中的扩增产物的量与正常对照组样品的扩增产物的量进行比较，并且当确定测试受试者的样品的扩增产物与正常对照组样品的扩增产物相比显著增加或减少时，可以确定相应的测试受试者患有酒精性脂肪肝或酒精性脂肪肝。
优选地，当测试受试者样品的罗斯拜瑞氏菌属菌株的微生物的扩增产物低于正常对照组样品时，可以预测具有酒精性脂肪肝病或酒精性脂肪肝病的风险，或被诊断出患有酒精性脂肪肝病或酒精性脂肪肝病。
有益效果
本发明涉及一种罗斯拜瑞氏菌属菌株，该菌株可以通过基于韩国双胞胎队列根据酒精摄取而改变的肠道菌群的相关性分析来用作酒精性脂肪肝病的新型生物标志物，并且使用本发明的罗斯拜瑞氏菌属菌株，可以开发或利用用于诊断酒精性脂肪肝病的试剂盒或用于治疗酒精性脂肪肝病的组合物。
附图说明
图1按组显示了本发明的队列的酒精摄取量(g/天)和AUDIT得分的相关结果以及年龄、性别和C反应蛋白(hsCRP)临床指标信息。
图2显示了根据本发明的一种实施方式，根据酒精摄取量将基于16S rRNA分析的肠道菌群分为AUDIT区域I、II、III来确认肠道菌群多样性变化的结果。
图3是根据本发明的一种实施方式，通过用OTU(操作分类单位，基于16S的生物信息学细菌分类单位)来分析健康因素与肠道菌群之间的关联性的结果。
图4是根据本发明的一种实施方式，通过用分类单元(taxon)来分析健康因素与肠道菌群之间的关联性的结果。
图5是根据本发明的一种实施方式，使用cytoscape软件执行网络分析的结果。
图6是根据本发明的一种实施方式，在将年龄、性别、双胞胎和家庭关系指定为随机参数并且将酒精摄取组作为校正参数之后，进行短链脂肪酸代谢物的关联性分析的结果。
图7是根据本发明的一种实施方式，进行对确保短链脂肪酸代谢物信息的307个样品中的代谢物与肠道菌群相关性分析的结果。
图8a是确认根据本发明的一种实施方式的肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburiaintestinalis)SNUG300117菌株的加强肠上皮细胞之间紧密连接的作用的实验结果。
图8b是在SDS-PAGE凝胶上上样源自肠道罗斯拜瑞氏菌和人罗斯拜瑞氏菌菌株的蛋白质提取物的结果。
图8c是对源自肠道罗斯拜瑞氏菌和人罗斯拜瑞氏菌菌株的蛋白质提取物进行LTQ-Orbitrap质谱分析的结果。
图8d是用透射电子显微镜观察肠道罗斯拜瑞氏菌和人罗斯拜瑞氏菌菌株的结果。
图8e是在将罗斯拜瑞氏菌属菌株、罗斯拜瑞氏菌属菌株的培养物和罗斯拜瑞氏菌属菌株的鞭毛添加至Caco-2细胞系中后24小时测量膜的上皮电阻的结果。
图8f是用乙醇以500mM/孔处理经罗斯拜瑞氏菌属菌株、罗斯拜瑞氏菌属菌株培养物和罗斯拜瑞氏菌属菌株的鞭毛处理过的Caco-2细胞并培养3小时后测量膜的上皮电阻的结果。
图8g是在以1g/l处理FITC-葡聚糖(Fluorescein-dextran)并培养1小时后，通过荧光通过FITC通透性测量通透性的结果。
图9a是显示用于确认根据本发明的菌株改善酒精性脂肪肝病的作用的动物实验过程的示意图。
图9b是确认根据本发明的一种实施方式的罗斯拜瑞氏菌属菌株SNUG30017菌株改善酒精性脂肪肝病的作用的结果。
图10是根据本发明的一种实施方式，在提取肝脏和阑尾之后测量体重的结果。
图11是根据本发明的一种实施方式，测量血液丙氨酸氨基转移酶(ALT)和构成革兰氏阴性细菌的细胞壁的脂多糖(LPS)的结果。
图12是根据本发明的一种实施方式，通过苏木精和曙红(H&E)染色的组织病理学观察的结果。
图13a是根据本发明的一种实施方式，进行作为对肝组织损伤的量度的油红O染色的结果。
图13b是基于随机选择的区域上的油红O染色结果的6张照片，使用ImageJ程序对显示脂肪的红色进行定量的结果。
图14是确认根据本发明的一种实施方式的肝组织的基因表达的变化的结果，各条形图从左开始为阴性对照组(Pair)、阳性对照组(EtOH)，肠道罗斯拜瑞氏菌给药组(EtOH+Ri)，人罗斯拜瑞氏菌给药组(EtOH+Rh)、嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)给药组(EtOH+Akk)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG给药组(EtOH+LGG)。
图15a是确认肠组织的基因表达变化的结果，各条形图从左开始为阴性对照组(Pair)、阳性对照组(EtOH)，肠道罗斯拜瑞氏菌给药组(EtOH+Ri)，人罗斯拜瑞氏菌给药组(EtOH+Rh)、嗜粘蛋白阿克曼菌给药组(EtOH+Akk)和鼠李糖乳杆菌GG给药组(EtOH+LGG)。
图15b是确认肠组织中闭合蛋白和β-肌动蛋白表达变化的蛋白质印迹照片。
图15c是定量肠组织中通过蛋白质印迹确认的蛋白质表达并通过β-肌动蛋白校正闭合蛋白表达所得的值，各条形图从左开始为阴性对照组(Pair)、阳性对照组(EtOH)，肠道罗斯拜瑞氏菌给药组(EtOH+Ri)，人罗斯拜瑞氏菌给药组(EtOH+Rh)、嗜粘蛋白阿克曼菌给药组(EtOH+Akk)和鼠李糖乳杆菌GG给药组(EtOH+LGG)。
图16a是确认基于16S rRNA用Faith系统发生多样性指标按组分析的肠道菌群多样性的变化结果。
图16b是确认基于16S rRNA用Chao1指标按组分析的肠道菌群多样性的变化结果。
图16c是进行基于16S rRNA分析的肠道菌群的主成分分析的结果。
图16d是进行单变量分析(LefSE)以分析肠道菌群变化的结果。
图17是通过PICRUSt进行肠道菌群KEGG途径功能估计分析的结果。
具体实施方式
在下文中，将通过以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于举例说明本发明，而本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1.研究对象和样品收集
从韩国双胞胎队列的410个单卵和双卵双胞胎及其家属中收集粪便样品，并在-80℃下冷冻保存。将保存的冷冻样品移至实验室，并使用QIAamp FAST DNA粪便微型试剂盒(Qiagen)提取细菌基因组DNA。在本队列中，通过利用酒精摄取量(克/天)和酒精摄取习惯的调查结果(即AUDIT评分临床指标)，通过根据AUDIT分数划分为I区(分数0-7，正常组)、II区(分数8-15)，三区(分数16-40，酒精摄取量高的组)来进行分析。图1显示了本队列的酒精摄取量(g/天)和AUDIT分数的相关性分析结果以及按组的年龄、性别、C反应蛋白(hsCRP)临床指标信息。
实施例2.使用16S rRNA分析肠道菌群
使用下表1中针对细菌16S rRNA基因的V4区域的515F/806R引物(SEQ ID NO:1和2)扩增实施例1中提取的DNA，并使用Illumina公司的MiSeq装置产生序列数据。使用QIIME流水线(QIIME pipeline)分析产生的大批序列(bulk sequence)，确认肠道细菌的全部基因信息，鉴定肠道菌群的结构，然后观察与酒精摄取指标的关联性。
[表1]
图2显示了将基于16S rRNA分析的肠道菌群根据酒精摄取量分为AUDIT区域I、II、III来确认分析的肠道菌群的多样性变化的结果，确认了在高酒精摄入量的组中，肠道菌群的多样性降低了。这表明，由于有益菌的多样性降低和潜在有害菌的优势，酒精摄取量的增加可能负面影响肠道健康。
实施例3.肠道菌群与酒精摄取量的相关性分析
使用能够通过校正年龄、性别和家族史控制混杂变量的MaAsLin(线性模型多变量分析)软件，通过多变量分析研究了肠道细菌，所述肠道细菌可以根据酒精摄取量确定肠道菌群的变化，从而确定肠道健康。在将年龄、性别和与双胞胎的家族关系指定为随机参数并将酒精摄取组指定为校正参数之后，使用MaAsLin软件，通过用OTU(操作分类单位，基于16S的生物信息学细菌分类单位)和分类单元划分健康因素与肠道菌群之间的关联性并进行分析，结果示于图3和图4。
如在图3中可以确认的那样，在酒精摄取量高的组中，人体普雷沃斯菌(Prevotella copri)OTU具有最大的关联性，而在酒精摄取量低的组中，罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia)OTU具有最大的关联性。图3的结果显示了与如图4可确认的通过分类单元分析时相同的趋势。
实施例4.饮酒组对肠道菌群网络的分析
为了调查高酒精摄取组和正常组中肠道菌群的发生模式，使用cytoscape软件进行了网络分析。
结果示于图5中，通过网络分析观察肠道菌群的相互关系，结果发现，根据酒精摄取将肠道菌群分为两组。属于同一组的分类群彼此之间具有强正相关，而与其他组之间则具有负相关。
实施例5.根据酒精摄取分析肠道菌群和短链脂肪酸代谢物的相关性
对于韩国双胞胎队列的一部分，在307份粪便样品中对作为肠道菌群来源的代谢物短链脂肪酸进行了分析。将相同量的粪便样品溶解在无菌三级蒸馏水中，并使用95％(v/v)硫酸进行氧化，然后离心以收集上清液。
对于内标，向样品上清液中添加1％的2-甲基戊酸，然后添加乙醚。涡旋后，离心收集醚层，并使用安捷伦公司的6890 GC-FID装置分析短链脂肪酸代谢物。固定的短链脂肪酸代谢物谱共有6种，分别是乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸。
对于此谱线，使用MaAsLin软件，在将双胞胎的年龄、性别和家族关系指定为随机参数，并将酒精摄取组指定为校正参数之后，对该关联性进行了分析。
图6显示了实验结果，可以确认，随着酒精摄取量的增加，丁酸的相对存在比例降低。另外，可以确认，随着酒精摄取量的增加，丁酸与丙酸的比例增加。
此外，对于确保短链脂肪酸代谢物信息的307份样品，进行了代谢物与肠道菌群相关性的分析。结果，如图7所确认的，罗斯拜瑞氏菌属与丁酸呈正相关，普雷沃斯菌属和巨单胞菌属与丙酸呈正相关。
通过以上结果，可以确认，根据酒精摄取量引起的肠道菌群的变化可以诱导代谢物短链脂肪酸的变化，并且肠道菌群和短链脂肪酸代谢物可以用作酒精摄取引起疾病的生物标志物。
实施例6.韩国来源的罗斯拜瑞氏菌属菌株的分离和鉴定
从健康的韩国人的肠道菌群中分离出肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburiaintestinalis)菌株。具体而言，由健康普通成年人提供用于分离肠道菌群的样品，并从粪便样品中分离和鉴定菌株(IRB批准号：1602/001-001)。
粪便样品收集后立即移至本实验室，并立即用于菌株分离。通过直接涂片法在包含1.5％琼脂的YCFAG培养基中击打样品后，将其在厌氧条件下于37℃下培养48小时。随机选择培养后纯分离的菌落，并在YBHI培养基中培养，为鉴定菌株，在提取菌株的基因组DNA后，使用下表2中针对16S rRNA基因的27F/1492R引物(SEQ ID NO:3和4)进行PCR反应。
[表2]
| 分类 | SEQ ID NO | 序列(5'->3') |
| 正向 | 3 | AGAGTTTGATYMTGGCTCAG |
| 反向 | 4 | TACGGYTACCTTGTTACGACT |
使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR反应产物后，进行序列分析。结果如以下表3的序列所示，菌株的分离最终使用该序列信息通过Chunlab的EzBioCloud程序(http://www.ezbiocloud.net/identify)进行多重比较而完成。
[表3]
分离出的菌株被命名为肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)SNUG30017，保藏在韩国典型培养物保藏中心，给予的保藏号为KCTC13327BP(肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)SNUG30017，保藏于2017年9月1日)。
为了长期保存纯分离和鉴定出的菌株，将甘油(60％v/v)添加到达到指数期的培养物中，以制成储备液并保存在-80℃。
实施例7.罗斯拜瑞氏菌属菌株加强肠上皮细胞之间的膜的紧密连接的特性
Caco-2细胞系来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并用作用于测试加强肠上皮细胞之间的膜的紧密连接的特性的动物细胞。Caco-2细胞系是人大肠来源的结肠直肠癌腺癌细胞，该细胞的形式是上皮细胞。
使用添加了20％胎牛血清(FBS)、1％非必需氨基酸溶液、1％HEPES、1.5％碳酸氢钠溶液、青霉素-链霉素(10U/ml)的MEM(美国赛默飞世尔科技公司)培养基在5％CO2的存在下于37℃下培养Caco-2细胞。对于肠上皮细胞之间壁的紧密连接的实验，将Caco-2细胞等分到24孔迁移板(孔径为0.4μm，美国康宁公司(Corning,USA))中，使其数目为3×105个细胞/ml/孔，每隔一天更换一次培养基，将其培养7天，完全形成单层以用于实验。
作为实验组，使用了肠道罗斯拜瑞氏菌SNUG30017菌株(Ri)，而对于对照组，则使用购自德国菌株银行(DSMZ)的人罗斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)DSM 16839菌株(Rh)。将每种细菌在厌氧条件下于YBHI液体培养基中于37℃下培养，使其达到指数期，然后离心，然后通过去除上清液并在PBS中稀释来制备。对于菌株，使用细菌计数试剂盒，使用BD公司的Accuri C6流式细胞仪装置测量细菌的数量。对于形成单层的Caco-2细胞，在处理该菌株之前添加未添加胎牛血清和抗生素的培养基，添加该菌株以使感染复数(MOI)为100。然后，测量0小时、12小时和24小时后的跨上皮电阻(TEER)。
结果示于图8a，示出了Ri菌株与对照组相比增加了跨上皮电阻，并且与对照组相比，在24小时比12小时更多地显著增加了跨上皮电阻。Rh与对照组相比则没有显著差异。
通过该结果，可以看出，实施例6中通过分离确保的肠道罗斯拜瑞氏菌SNUG30017菌株具有加强肠上皮细胞之间的结合的作用，并且可以减轻酒精性脂肪肝病的症状。
实施例8.罗斯拜瑞氏菌属菌株鞭毛加强肠上皮细胞之间的膜的紧密结合的特性
8-1：罗斯拜瑞氏菌属菌株鞭毛的提取
为了提取罗斯拜瑞氏菌属菌株的鞭毛，进行以下操作。
将肠道罗斯拜瑞氏菌SNUG30017菌株(Ri)和人罗斯拜瑞氏菌DSM 16839菌株(Rh)在厌氧条件下于37℃下在500ml YBHI液体培养基中培养24小时，然后在4℃下，4,000×g离心20分钟，并去除上清液。然后，将菌株悬浮于4℃PBS中，然后均质化3次，每次30秒。将其在4℃下，10,000×g离心20分钟以仅固定上清液，并将通过在4℃下，100,000×g超高速离心1小时浓缩的沉淀悬浮于500μl三级无菌蒸馏水中，将如此提取的蛋白质估计为鞭毛。
8-2：罗斯拜瑞氏菌属菌株鞭毛的确认
使用PAGE凝胶和LTQ-Orbitrap质谱仪分析实施例8-1中获得的蛋白质提取物。
具体地，使用BCA蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)对源自Ri和Rh菌株的蛋白提取物进行定量。将相同量的蛋白提取物添加到包含10％β-巯基乙醇的Laemmli样品上样缓冲液(Bio-Rad公司)中，然后在85℃下煮沸10分钟，然后将样品上样到10％SDS-PAGE凝胶上，从而确认约35kDa大小的条带，结果示于图8b。
将具有相应大小的条带在胰蛋白酶消化下进行LTQ-Orbitrap质谱分析。作为将确保的氨基酸序列与由NCBI确保的蛋白质数据库进行比对的结果，确认了提取的蛋白质为罗斯拜瑞氏菌属菌株的鞭毛，其结果示于图8c。
另外，为了确认Ri和Rh菌株的鞭毛，在厌氧条件下于37℃下在YBHI固体培养基中培养24小时后，将菌株置于网格上，使用PTA(磷钨酸)进行负染色。通过透射电子显微镜(TEM)观察鞭毛，结果示于图8d。
8-3：确认罗斯拜瑞氏菌属菌株鞭毛加强肠上皮细胞之间紧密连接的特性
为了确认源自罗斯拜瑞氏菌属菌株的鞭毛具有加强肠上皮细胞之间的膜的紧密连接的特性，进行以下操作。
具体而言，Caco-2细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并用作动物细胞以测试保护被乙醇破坏的肠上皮细胞之间的膜的紧密连接。使用添加了20％胎牛血清(FBS)、1％非必需氨基酸溶液、1％HEPES、1.5％碳酸氢钠溶液、青霉素-链霉素(10U/ml)的MEM(美国赛默飞世尔科技公司)培养基在5％CO2存在下于37℃下培养Caco-2细胞。对于保护肠上皮细胞之间的壁的紧密连接的实验，将Caco-2细胞等分到24孔迁移板(孔径为0.4μm，美国康宁公司)中，使其数目为3×105个细胞/ml/孔，每隔一天更换一次培养基，将其培养7天，完全形成单层以用于实验。
作为实验组，使用了肠道罗斯拜瑞氏菌SNUG30017菌株(Ri)，而对于对照组，则使用购自德国菌株银行(DSMZ)的人罗斯拜瑞氏菌。将每种细菌在厌氧条件下于YBHI液体培养基中于37℃下培养，使其达到指数期，然后离心，然后通过去除上清液并在PBS中稀释来制备。对于菌株，使用细菌计数试剂盒，使用BD公司的Accuri C6流式细胞仪装置测量细菌数。对于培养，用0.22μm的过滤器处理上清液。对于实施例8-1中提取的鞭毛，使用赛默公司的BCA试剂盒测量蛋白质浓度。对于形成单层的Caco-2细胞，在处理该菌株之前添加未添加胎牛血清和抗生素的培养基。对于每种菌株的情况，添加到1×108个细胞/孔，1×109个细胞/孔，对于菌株培养物的情况，添加1％，对于菌株鞭毛的情况，添加250μM和500μM。
然后，测量0小时和24小时后的跨上皮电阻(TEER)。然后，将乙醇以500mM/孔处理，并培养3小时，然后测量跨上皮电阻，并通过荧光测量FITC通透性。
在添加细菌、培养物和鞭毛后24小时内测量跨上皮电阻的结果示于图8e。在细菌的情况下，当以1×109个细胞/孔处理时，与对照组相比，Rh菌株显著提高了跨上皮电阻。对于鞭毛，当添加250μM或500μM时，与对照组相比，所有Ri和Rh来源的鞭毛均显著提高了跨上皮电阻。在培养物的情况下，显示出当以1％处理Ri来源的培养物时，与对照组相比，跨上皮电阻显著降低。从以上结果可以看出，罗斯拜瑞氏菌菌株来源的鞭毛与菌株或培养物相比具有加强肠上皮细胞之间的结合的作用。
然后，在以500mM/孔处理乙醇并培养3小时之后，测量跨上皮电阻的结果示于图8f。结果表明，与用PBS处理的阴性对照组相比，用乙醇(E)处理的阳性对照组非常显著地降低了跨上皮电阻。另外，当以1×109个细胞/孔处理时，与阳性对照组相比，Ri菌株显著增加了跨上皮电阻。在培养物的情况下，将Ri来源的培养物以1％处理时，与阳性对照组相比显著增加，在用丁酸盐(but)处理的对照组中也显示了相同的结果。通过以上结果，可以看出乙醇破坏了肠上皮细胞之间的膜，并且Ri来源的菌株和培养物具有保护肠上皮细胞之间的结合的作用。
在以1g/l处理FITC-葡聚糖(荧光素-葡聚糖)并培养1小时之后，通过荧光测量FITC通透性的结果显示在图8g中。结果表明，与用PBS处理的阴性对照组相比，用乙醇处理的阳性对照组显著增加了上皮细胞膜的通透性。此外，当用1×109个细胞/孔处理时，与阳性对照组相比，Ri菌株显著降低了上皮细胞膜的通透性。在鞭毛的情况下，与阳性对照组相比，当添加250μM或500μM时，Ri显著降低上皮细胞膜的通透性，而当添加500μM时，Rh具有明显的作用。在所有情况下，培养物都没有降低通透性的作用。从以上结果可以看出，由于乙醇破坏了肠上皮细胞之间的膜，因此通透性增加，并且Ri来源的菌株和鞭毛具有保护肠上皮细胞之间结合的作用，从而降低了通透性。
实施例9.动物实验模型的建立
为了研究单一菌株施用引起的肠道菌群变化与酒精性脂肪肝之间的因果关系，进行了动物实验。
每天向雄性8至10周龄的C57BL/6J雄性小鼠施用Lieber DeCarli饲料，以诱导酒精性脂肪肝。如图9a所示，在喂食不含酒精的饲料2天以适应液体膳食之后，从第3天起，酒精的浓度每2天增加1％和3％，并在第6天以5％(v/v)施用，然后喂食5％(v/v)，持续10天后，在第16天的早晨，口服31.5％(v/v)乙醇，并在9个小时内完成实验。然后，对于阴性对照组，口服施用具有相同卡路里的45％(v/v)麦芽糖糊精。对于实验组的膳食，通过调节除了添加酒精外添加的麦芽糖糊精的量，使之与不添加酒精的阴性对照组饮食的卡路里相同。作为实验组，使用了肠道罗斯拜瑞氏菌SNUG30017(Ri)和人斯拜瑞氏菌DSM 16839菌株(Rh)，对于对照组，使用了通常已知具有减轻酒精性脂肪性肝病作用的嗜粘蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)ATCC BAA-835和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG KCTC 5033菌株。通过口服施用的方法以每天2×109CFU/0.2ml的量将每种菌株定殖15天，对于阴性和阳性对照组，口服施用PBS。每隔一周测量一次小鼠的体重，每隔两天测量一次饲料的摄取量，结果示于图9b。
结果，如在图9b中可见，确认了即使实验期间的平均进食量没有差异，与阴性对照组(Pair)相比，作为阳性对照组的乙醇组(EtOH)的体重变化也显著减少。这意味着尽管摄取了相同的卡路里，但由于乙醇，体重减轻了。乙醇组(EtOH)和罗斯拜瑞氏菌菌株给药组(EtOH+Ri，EtOH+Rh)的体重无显著差异，而在作为对照组的嗜粘蛋白阿克曼菌组(EtOH+Akk)中，与乙醇组相比，体重显著减轻。
实验结束后，处死小鼠，提取肝脏、盲肠和脾脏，然后测量其重量，结果示于图10。
结果，如在图10中可见，仅在阴性对照组(Pair)和作为阳性对照组的乙醇组(EtOH)之间显示了肝脏、盲肠和脾脏相对于体重的相对比例的显著变化，这意味着给药每种菌株均不影响肝脏、盲肠和脾脏的重量变化。
实施例10.确认罗斯拜瑞氏菌菌株对酒精性脂肪肝的改善作用
10-1：定量分析
在实施例9的实验结束时，收集小鼠的血液，并测量血液丙氨酸氨基转移酶(ALT)、组成革兰氏阴性细菌细胞壁的脂多糖(LPS)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。此外，还测量了肝脏中的甘油三酯(TG)，并在即将完成实验之前，口服施用了具有异硫氰酸荧光素(FITC)荧光的右旋糖酐(4kDa)(60mg/100g体重)，并在4小时内收集了血液并进行了测量血液中荧光的体内通透性(FITC)。结果示于图11。
结果，如在图11中可见，作为阳性对照组的乙醇组的血ALT浓度显著升高，诱发了酒精性脂肪肝。此外，在作为实验组的肠罗斯拜瑞氏菌SNUG30017(Ri)和人罗斯拜瑞氏菌DSM 16839菌株(Rh)组中以及作为对照组的嗜粘蛋白阿克曼菌组(Akk)中，血液ALT浓度显著降低。ALT是用作肝损害指标的代表性生物标志物，该结果意味着该菌株的施用缓解了酒精性脂肪肝。
在AST的情况下，确认了在作为阳性对照组的乙醇组中，与阴性对照组相比，血液AST浓度显著增加，从而诱导了酒精性脂肪肝。另外，在作为实验组的肠罗斯拜瑞氏菌SNUG30017(Ri)组中，与乙醇组相比，血液AST浓度显著降低。AST也是用作肝损伤指标的代表性生物标志物，该结果意味着该菌株的施用缓解了酒精性脂肪肝。
在肝脏甘油三酯(TG)的情况下，确认了在作为阳性对照组的乙醇组中，与阴性对照组相比，肝脏中的甘油三酯浓度显著增加，诱发了酒精性脂肪肝病。另外，在作为实验组的肠罗斯拜瑞氏菌SNUG30017(Ri)组中，与乙醇组相比，甘油三酯显著降低，该结果表明该菌株的施用缓解了酒精性脂肪肝。
在FITC的情况下，确认了在作为阳性对照组的乙醇组中，与阴性对照组相比，血液FITC荧光表达显著增加，作为酒精性脂肪肝病发生的原因之一的屏障通透性增加。另外，在作为实验组的肠罗斯拜瑞氏菌SNUG30017(Ri)和人罗斯拜瑞氏菌DSM 16839菌株(Rh)以及作为对照组的嗜粘蛋白阿克曼菌组(Akk)中，与乙醇组相比，血液FITC荧光表达显著降低，这个结果意味着菌株的施用降低了屏障通透性并有助于缓解酒精性脂肪肝。
在作为酒精性脂肪肝发生的原因之一的LPS的情况下，确认了在作为阳性对照组的乙醇组中，与阴性对照组相比，血液脂多糖(LPS)的浓度显著增加，并且屏障通透性增加，从而增加了源自肠的LPS。另外，在作为实验组的肠罗斯拜瑞氏菌SNUG30017(Ri)和人罗斯拜瑞氏菌DSM 16839菌株(Rh)中，与乙醇组相比，血液LPS浓度显著降低，该结果表明该菌株的给药增强了屏障并且减少了LPS的释放，从而有助于缓解酒精性脂肪肝。
10-2：组织学分析
在用10％福尔马林固定肝组织以进行组织病理学观察之后，进行苏木精和曙红(H&E)染色的结果示于图12中，进行作为肝脏组织损伤的标准的油红O染色的结果，以及使用ImageJ软件对其进行定量的结果示于图13a和图13b中。
根据图12的结果，证实了在作为阳性对照组的乙醇组(II.EtOH)中，与阴性对照组(I.Pair)相比，除了脂肪积累以外，中心静脉(CV)周围的免疫细胞(例如嗜中性粒细胞)也发生浸润。另外，在作为实验组的肠罗斯拜瑞氏菌SNUG30017(III.EtOH+Ri)和人罗斯拜瑞氏菌DSM 16839菌株(IV.EtOH+Rh)中，与乙醇组相比，免疫细胞的浸润降低，这意味着施用罗斯拜瑞氏菌菌株减少了引起酒精性脂肪肝的炎性反应。
根据图13a和图13b的结果，在作为阳性对照组的乙醇组(II.EtOH)中，确认了肝脏中脂肪积累的增加，但是在施用Ri(III.EtOH+Ri)和Rh(IV.EtOH+Rh)菌株的实验组中，确认了脂肪在肝脏中的积累得到缓解。特别地，作为在随机选择的6个区域中对红色进行定量的结果，确认了脂肪显著降低(图13b)。图13b是通过确保随机选择区域的油红O染色结果的6张照片，使用ImageJ程序对显示脂肪的红色进行定量的结果。
10-3：基因表达分析
对于组织的基因表达的分析，使用RNeasy脂质组织微型试剂盒(凯杰公司)提取肝脏组织的RNA，并使用容易旋转(easy-spin)总RNA提取试剂盒(Intron公司)提取肠组织的RNA。使用高效RNA-到-cDNA(RNA-to-cDNA)试剂盒(应用生物系统公司)将RNA合成为cDNA后，使用roter-基因SYBR绿PCR(roter-gene SYBR green PCR)试剂盒(凯杰公司)分析基因表达的结果示于图14(肝脏组织)和图15a(肠组织)。
图14是与脂肪代谢(例如肝脏中的甘油三酯合成和脂肪酸转运)相关的基因PPAR-γ和CD36的表达与活化嗜中性粒细胞募集的趋化因子CXCL2和CXCL5的基因表达以及被称为炎性细胞因子的TNF-α和IL-1β的表达的比较分析。
图15a是与肠中肠上皮细胞之间的紧密连接相关的Zo-1、闭合蛋白的基因表达以及与粘液层相关的MUC2的基因表达的比较分析。
然后，使用下表4的引物(SEQ ID NO:6至27)，并且分别通过18S和HPRT管家基因来校正肝和肠的表达。
[表4]
根据图14的结果，与阴性对照组(Pair)相比，阳性对照组(EtOH)中PPAR-γ和CD36的表达显著增加，这意味着乙醇使肝脏中的脂肪代谢增加。另一方面，在施用Ri菌株的实验组(EtOH+Ri)中，与阳性对照组相比，两种基因的表达均显著降低；在施用Rh的实验组(EtOH+Rh)中，CD36基因的表达显著降低。这意味着施用罗斯拜瑞氏菌属菌株降低了与脂肪代谢有关的基因的表达，从而有助于缓解酒精性脂肪肝。
另外，在阳性对照组(EtOH)中，与阴性对照组(Pair)相比，CXCL2和CXCL5的表达显著增加，这意味着乙醇引起肝脏中炎性反应增加和免疫细胞活性增加。特别地，CXCL2和CXCL5是作为炎性细胞因子之一的趋化因子，并且诱导炎症。另一方面，在施用Ri的实验组(EtOH+Ri)中，与阳性对照组相比，两种基因的表达均显著降低，而施用Rh的实验组(EtOH+Rh)中，CXCL2的表达显著降低。这意味着施用罗斯拜瑞氏菌属菌株降低了与免疫细胞调节相关的基因的表达，从而有助于缓解酒精性脂肪肝。
此外，与阴性对照组(Pair)相比，阳性对照组(EtOH)中TNF-α和IL-1β的表达显著增加，这意味着乙醇引起的肝脏炎性反应增加。另一方面，在施用Ri和Rh的实验组(EtOH+Ri，EtOH+Rh)中，两者均显著降低，这意味着通过菌株施用降低了肝脏中的炎性反应。
根据图15a的结果，在Zo-1的情况下，阴性对照组(Pair)和阳性对照组(EtOH)之间没有显著差异。另一方面，在闭合蛋白的情况下，与阴性对照组(Pair)相比，阳性对照组(EtOH)中的表达显著降低，这意味着闭合蛋白的表达影响乙醇导致的肠中肠上皮细胞之间的紧密连接的降低。同时，在所有施用Ri和Rh的实验组(EtOH+Ri，EtOH+Rh)和施用Akk的对照组(EtOH+Akk)中，闭合蛋白的表达均显著增加。这意味着施用罗斯拜瑞氏菌属菌株增加了闭合蛋白表达并加强了肠上皮细胞之间的膜，从而有助于缓解酒精性脂肪肝。
在MUC2的情况下，与阴性对照组(Pair)相比，阳性对照组(EtOH)中的表达显著降低，这意味着乙醇进一步增加粘液层的通透性。另一方面，在所有施用Ri和Rh的实验组(EtOH+Ri，EtOH+Rh)中，MUC2表达均显著增加。这意味着施用罗斯拜瑞氏菌属菌株增加了MUC2表达并加强了粘液层，从而有助于缓解酒精性脂肪肝。
10-4：蛋白质表达分析
为了分析肠组织中的蛋白质表达，将肠组织中的蛋白质在添加了蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中匀浆并提取，然后使用BCA蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)进行定量。添加包含10％β-巯基乙醇的Laemmli样品上样缓冲液(Bio-Rad公司)，在85℃下煮沸10分钟，然后进行10％SDS-PAGE凝胶。然后，将膜在添加了5％BSA的TBST中封闭1小时，然后连接一抗和二抗，以进行反应。反应强度通过GeneTools(Syngene公司)定量。
图15b显示了与肠中肠上皮细胞之间的紧密连接有关的闭合蛋白和作为管家基因的β-肌动蛋白的蛋白表达。图15c是通过定量每组总共4至5个样品获得的结果并通过β-肌动蛋白值校正来显示相对蛋白表达的图。根据图15b和图15c的结果，与阴性对照组(Pair)相比，阳性对照组(EtOH)中闭合蛋白的表达显著降低，这意味着由于乙醇减少了肠中闭合蛋白的表达，肠上皮细胞之间的膜变弱。另一方面，在所有施用Ri和Rh的实验组(EtOH+Ri，EtOH+Rh)和添加Akk的对照组(EtOH+Akk)中，闭合蛋白的表达均显著增加，Ri最显著地增加了表达。特别地，这意味着肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)菌株增加了闭合蛋白的表达并增强了肠上皮细胞之间的膜，从而有助于缓解酒精性脂肪肝。
10-5：使用16S rRNA分析肠道菌群
在实施例9的实验结束时，收集小鼠的盲肠并在-81℃下冷冻保存，将样品移至实验室，并使用QIAamp FAST DNA粪便微型试剂盒(Qiagen)提取细菌基因组DNA。使用下表5中针对细菌16S rRNA基因的V3-4区域的引物(SEQ ID NO:28和29)扩增提取的DNA，并且在进行索引PCR之后，使用Illumina公司的MiSeq装置产生序列数据。使用QIIME流水线分析产生的大批序列(bulk sequence)，通过确认肠道菌群的全基因组信息，鉴定肠道菌群的结构，然后进行分组单变量分析(LefSE)。
[表5]
基于16S rRNA用Faith系统发生多样性和Chao1指标按组分析的肠道菌群多样性变化的结果示于图16a和图16b，在Faith系统发生多样性指标的情况下，确认了与阴性对照组相比，作为阳性对照组的乙醇组中肠道菌群的多样性显著降低。这表明，由于有益菌的减少和潜在有害菌的优势，酒精摄取量的增加可能负面影响肠道健康。另一方面，在施用Ri和LGG的实验组中，两种指标表明肠道菌群的多样性显著增加。这表明施用菌株可以增加肠道菌群的多样性，从而正面影响肠道健康。
进行基于16S rRNA分析的肠道菌群的主成分分析的结果示于图16c，通过PCA图，确认了作为阳性对照组的乙醇组具有与阴性对照组非常不同的肠道菌群结构。另一方面，已确认仅施用Ri的实验组具有与作为阳性对照组的乙醇组不同的肠道菌群结构。这表明施用菌株改变了组成肠道菌群的物种，从而调节了肠道菌群结构。
为了分析哪个肠道菌群被改变，进行单变量分析(LefSE)的结果示于图16d。在作为阳性对照组的乙醇组中，确认了细胞壁由脂多糖(LPS)组成的代表性有害细菌肠杆菌科的优势。另一方面，在施用Ri的实验组中，确认了阿克曼菌属和普雷沃斯菌属的增加。这意味着施用菌株改变了肠道菌群，从而有助于缓解酒精性脂肪肝。
通过PICRUSt进行肠道菌群KEGG途径功能估计分析的结果示于图17。在作为阳性对照组的乙醇组中，确认了聚糖降解和半乳糖代谢功能的优势。另一方面，在施用Ri的实验组中，确认了DNA修复和代谢功能的增加。这意味着施用菌株控制了肠道菌群的功能，有助于缓解酒精性脂肪肝。
PCT/RO/134表
Claims (15)
1.一种罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia)菌株，具有预防或改善酒精性脂肪肝病的活性。
2.根据权利要求1所述的罗斯拜瑞氏菌属菌株，其中，所述罗斯拜瑞氏菌属菌株具有选自由以下组成的组中的特性中的一种或多种：加强上皮细胞之间的紧密连接，降低酒精性脂肪肝病的致病物质，以及降低屏障通透性。
3.根据权利要求2所述的罗斯拜瑞氏菌属菌株，其中，所述加强上皮细胞之间的紧密连接的特性是由罗斯拜瑞氏菌属菌株的鞭毛引起的。
4.根据权利要求2所述的罗斯拜瑞氏菌属菌株，其中，所述加强上皮细胞之间的紧密连接是在诱导酒精脂肪肝病的动物模型中，通过与未用罗斯拜瑞氏菌属菌株处理的对照组相比，在罗斯拜瑞氏菌属菌株处理组中，增加上皮细胞膜的上皮电阻、增加闭合蛋白基因的表达或增加MUC2基因的表达而引起的。
5.根据权利要求1所述的罗斯拜瑞氏菌属菌株，其中，所述罗斯拜瑞氏菌属菌株具有降低选自由CXCL2基因、CXCL5基因、TNF-α基因和IL-1β基因组成的组中的肝脏炎性细胞因子中的至少一种的表达的特性。
6.根据权利要求1所述的罗斯拜瑞氏菌属菌株，其中，所述预防或改善酒精性脂肪肝病是通过摄取所述罗斯拜瑞氏菌属菌株来改善选自由以下组成的组中的肝功能指标中的至少一种：降低ALT的血液浓度，降低AST的血液浓度，降低肝脏中的甘油三酯，降低肝脏脂肪的量以及降低与肝脏脂肪合成相关的基因的表达。
7.根据权利要求6所述的罗斯拜瑞氏菌属菌株，其中，所述与肝脏脂肪合成相关的基因是PPAR-γ或CD36。
8.根据权利要求1所述的罗斯拜瑞氏菌属菌株，其中，所述菌株是肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)。
9.根据权利要求1所述的罗斯拜瑞氏菌属菌株，其中，所述菌株是保藏号为KCTC13327BP的肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)SNUG30017。
10.一种用于预防或治疗酒精性脂肪肝病的药物组合物，包含选自由根据权利要求1至9中任一项所述的罗斯拜瑞氏菌属菌株的微生物细胞、所述菌株的鞭毛提取物、所述菌株的培养物以及所述培养物的浓缩物和干燥产物组成的组中的一种或多种。
11.一种用于预防或改善酒精性脂肪肝病的食品组合物，包含选自由根据权利要求1至9中任一项所述的罗斯拜瑞氏菌属菌株的微生物细胞、所述菌株的鞭毛提取物、所述菌株的培养物以及所述培养物的浓缩物和干燥产物组成的组中的一种或多种。
12.一种用于预防或改善酒精性脂肪肝病的益生菌组合物，包含选自由根据权利要求1至9中任一项所述的罗斯拜瑞氏菌属菌株的微生物细胞、所述菌株的鞭毛提取物、所述菌株的培养物以及所述培养物的浓缩物和干燥产物组成的组中的一种或多种。
13.根据权利要求12所述的益生菌组合物，其中，所述罗斯拜瑞氏菌属菌株引起肠道菌群的多样性增加或与代谢相关的肠道菌群的功能增加。
14.一种用于诊断酒精性脂肪肝病的组合物，包含用于定量存在于受试者的肠中的根据权利要求1至9中任一项所述的罗斯拜瑞氏菌属菌株的试剂。
15.根据权利要求14所述的用于诊断酒精性脂肪肝病的组合物，包含用于定量脂肪酸代谢物丁酸和丙酸的浓度的试剂。
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