CN111518567B

CN111518567B - 超积累植物富集镉的微生物强化方法及所用的复合悬液

Info

Publication number: CN111518567B
Application number: CN202010336098.3A
Authority: CN
Inventors: 张奇春; 王京文; 王浣荷; 金树权
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-04-25
Filing date: 2020-04-25
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2040-04-25
Also published as: CN111518567A; AU2020103277A4

Abstract

本发明公开了一种菌株‑炭基盐水复合体悬液的制备方法，包括以下步骤：制备耐镉菌M6的菌体；利用松竹制备生物质炭；松竹生物质炭加入至生理盐水中，调节pH至中性；在所得的炭基生理盐水中加入菌体后培养，得菌株‑炭基盐水复合体悬液。本发明还同时提供了一种超积累植物富集镉的微生物强化方法：在镉污染土壤中种植伴矿景天，且每隔8～12d施加一次菌株‑炭基盐水复合体悬液。本发明的微生物强化方法是通过增加耐镉菌剂的野外活性为基础，从而提高超积累植物富集镉的能力，方法简便、成本低廉，具有广阔的应用前景。

Description

超积累植物富集镉的微生物强化方法及所用的复合悬液

技术领域

本发明涉及一种对超积累植物修复土壤镉污染的微生物强化方法，以及所用的菌株-炭基盐水复合体悬液。

背景技术

随着我国工业化进程的不断推进，土壤重金属污染问题日趋严峻也得到了越来越多人的重视，同时人们对于治理污染方式的研究也越来越深入。而植物修复因其价格低廉，操作简单，对环境扰动小，治理效果更为彻底等优点受到广泛关注。但同时在重金属胁迫下，植物修复所需的时间和高污染条件下植物受到的生理损伤问题是植物修复面临的主要问题。因此，随着研究的深入，人们发现可以利用微生物和植物之间的相互作用来促进植物的生长和修复。例如某些植物根系促生菌可以分泌生长激素、产生ACC脱氨酶和铁载体等其它影响植物生长的物质，来促进植株生长和发育缩短修复周期，同时增强植物抗氧化酶的活性，达到减轻重金属离子毒害的作用；有些则可以通过释放有机酸或生物表面活性剂，改变土壤pH值及氧化还原电位，进而改变重金属在土壤中的迁移效率和生物利用度。有些有机酸可以螯合游离态重金属离子，降低其在土壤中的生物有效性，降低毒害效果，还有一些有机酸也可以活化根系周围的重金属，使其更易被植物吸收，达到一种累积效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种超积累植物富集镉的微生物强化方法及所用的菌株-炭基盐水复合体悬液，本发明具有成本低廉、操作简便、增强超积累植物富集镉效率高的优势

为了解决上述技术问题，本发明提供一种菌株-炭基盐水复合体悬液的制备方法，包括以下步骤：

1)、制备耐镉菌M6的菌体；

2)、制备生物质炭(特制生物质炭)：

将松竹干燥后粉碎，得松竹颗粒；

将松竹颗粒在无氧条件下加热至(800±50)℃保温处理(1±0.1)小时，得松竹生物质炭；

3)、制备炭基生理盐水：

按照(30±2)g/L的料液比，将松竹生物质炭加入至生理盐水中，搅拌均匀振荡；再调节pH至(7±0.5)，得炭基生理盐水；

4)、制备菌株-炭基盐水复合体悬液：

在(150±10)mL炭基生理盐水中加入菌体0.2mL，将所得的菌悬液先均匀振荡，然后于(25±1)℃培养22～26h后，再均匀振荡，得菌株-炭基盐水复合体悬液。

说明：可利用0.1mol/L HCl进行pH的调节。

作为的菌株-炭基盐水复合体悬液的制备方法的改进：

所述步骤2)为：将松竹先于(60±5)℃烘干(20±1)h，再于(48±5)℃烘干(28±1)h，然后粉碎，得松竹颗粒。

作为的菌株-炭基盐水复合体悬液的制备方法的进一步改进：

所述步骤2)为：将松竹颗粒用锡箔纸包好，且排除松竹颗粒之间孔隙间的空气，再外附一层锡箔纸用于密封；然后置于马弗炉(Nabertherm GmbH,Dermany)内，从而在无氧的条件下以(15±1)℃/分钟的升温速率升温至(800±50)℃，保温处理(1±0.1)小时，得松竹生物质炭。

本发明还同时提供了一种超积累植物富集镉的微生物强化方法，利用上述方法制备所得的菌株-炭基盐水复合体悬液，在镉污染土壤中种植伴矿景天，且每隔8～12d施加一次菌株-炭基盐水复合体悬液。

用量比一般为：2.5kg的土壤，每隔10d按(150±50)mL的添加量将菌株-炭基盐水复合体悬液加入土壤中。

本发明所用的菌株为重镉污染土壤中分离出的对镉具有活化作用的M6菌株，该菌株在在已公开的《耐镉菌株对土壤镉形态及土壤微生物群落结构的影响》中有明确告知。耐镉菌M6可使土壤有效态镉增加大于30％。高通量测序所得的M6的16S rDNA部分序列(GeneBank上的注册号为KM349307)在NCBI上进行BLAST比较，M6在系统发育地位上属于Bacteria，Actinobacteria，Actinobacteridae，Actinomycetales，Micrococcineae，Arthrobacte。

本发明是一种超积累富集镉的微生物强化方法：应用菌株-炭基盐水复合体与超积累植物进行联合修复农田镉污染的土壤。

本发明对耐镉菌M6进行特制的炭基负载，制成的菌株-炭基盐水复合体与超积累植物联用修复镉污染农田土壤，从而降低土壤含镉量。本发明的微生物强化方法是通过增加耐镉菌剂的野外活性为基础，从而提高超积累植物(伴矿景天)富集镉的能力，方法简便、成本低廉，因此具有广阔的应用前景。本发明方法不仅能同时适用在农田轻度镉污染土壤，而且可以用于农田中度或重度镉污染土壤。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为M6菌株和菌株+生物质炭(菌株-炭基盐水复合体)的电子显微镜拍摄结果。

a.M6菌株2μm尺度；b、菌株+生物质炭2μm尺度；

c.M6菌株500nm尺度；d.菌株+生物质炭500nm尺度；

图2是田间实例1的土壤有效态Cd含量(A)和景天茎叶Cd含量(B)。

图3是田间实例2的土壤有效态Cd含量(A)和景天茎叶Cd含量(B)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、一种菌株-炭基盐水复合体悬液的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、制备耐镉菌M6的菌体：

将耐镉菌M6接种到液体LB培养基中，于28℃的温度、200r/min的转速，有氧条件下摇菌培养至对数期，根据该菌生长曲线用紫外分光光度计调节OD值，保证菌液cfu≥1×10⁸个/mL，在8000r/min下离心10min，弃上清液，得到菌体，待用。

2)、从野外采集松竹，先置于60℃烘箱中烘干脱水20h，然后于48℃烘箱中再烘28h，取出后用粉碎机破碎后过1mm筛，得松竹颗粒；

将松竹颗粒用锡箔纸包好，且排除松竹颗粒之间孔隙间的空气，再附上一层锡箔纸(作为包装袋)用于密封；然后置于马弗炉(Nabertherm GmbH,Dermany)内，在无氧的条件下加热到800℃保温1小时，升温速率为15℃/分钟；得松竹生物质炭，待用。

3)、按照松竹生物质炭：生理盐水＝30g/L的料液比，在容器(例如试管)中加入生理盐水，再加入松竹生物质炭，搅拌均匀后，于150rpm的震荡频率下振荡半小时；接着边滴加0.1mol/L HCl，边搅拌均匀，直至pH至7，得炭基生理盐水。

说明：用pH计测定溶液中的pH值。

4)、用150mL炭基生理盐水将菌体(0.2mL)复悬形成菌悬液，在150rpm的震荡频率下振荡半小时后，放入25℃培养箱中培养24h后取出，在150rpm的震荡频率下再振荡半小时，得菌株-炭基盐水复合体悬液。

实验1、将菌株-炭基盐水复合体悬液离心(8000r/min的转速下离心10分钟)，取少量样品用滤纸包裹，放置于2.5％的戊二醛溶液中4℃固定过夜。之后用0.1M，pH＝7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min。之后用1％的锇酸溶液固定样品2h，再次重复磷酸缓冲液漂洗步骤，并用梯度浓度(浓度依次为30％,50％,70％,80％,90％和95％)乙醇对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min。最后用乙醇与醋酸异戊酯(1：1，v/v)的混合液处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯(100％)处理样品20min后进行临界点干燥，镀膜后将处理好的样品在Hitachi TM-1000型扫描电镜中观察。

所得结果为：不同放大倍数下(2μm、500nm)电子显微镜拍摄图分别如图1的b、d所述。即为M6菌株负载于生物质炭间隙和表面上的拍摄结果，生物质炭因其具有大的比表面积而能够给菌株提供生长空间，图中可以看到M6菌株在生物质炭的间隙和表面均有分布且数量较多。

未施加任何处理的情况下，耐镉菌M6直接于不同放大倍数下(2μm、500nm)电子显微镜拍摄，所得结果如图1的a、c所述。

田间实例1、用于农田轻度镉污染土壤。

盆栽种植所用土壤采自浙江省诸暨市，土壤全镉含量0.70mg·kg^-1，属轻度污染；诸暨取样地地处浙中内陆，属亚热带季风气候区，四季分明，雨水较多，光照充足。位于河谷平原，土壤属水稻土土类、渗育水稻土亚类、老培泥砂田土种。气温年平均为16.3℃，常年平均降水量约1373.6毫米，降水日年均约158.3天，相对湿度约82％，日照年均约1887.6小时，年日照百分率为45％。采用直径20cm，高14cm的塑料花盆进行盆栽试验，称取风干土壤2.5kg至花盆中，调节土壤含水量至60％田间持水量，待土壤组分稳定后，移入5株超积累植物(伴矿景天)，保证每株生长状况基本相同。

盆栽试验于浙大校区温室内进行，共分3个处理：

1)、CK，每次加150mL ddH₂O；

2)、M6,每次加150mL M6；150mL M6的制备方法为：在0.2mL菌体中加入ddH₂O定容至150mL；

3)、M6+C，每次加150mL菌株-炭基盐水复合体悬液。

每个处理重复三次。自2018年6月3日起，每隔10d按150mL的添加量加入到对应的花盆中，施加5次后收获。采集植株样和土壤样的镉含量。镉含量的测定方法按照常规的石墨炉原子吸收分光光度计(PE AA800)法进行检测，所得结果如图2所述：

与CK相比，M6和M6+C处理植株收获后DTPA提取态的土壤Cd分别增加了34％和52％；与M6相比，M6+C处理伴矿景天的叶和茎吸镉量明显增加。

田间实例2、用于农田中度镉污染土壤。

盆栽种植所用土壤采自浙江省杭州市富阳区，土壤全镉含量4.74mg·kg^-1，属中度污染。富阳取样地属亚热带季风气候，年均气温16.1℃，年均日照时数1927.7小时，无霜期约231天，年均降雨量1441.9mm。

实验方式等同于田间实例1。

自2018年6月3日起，每隔10d按150mL的添加量加入到对应的花盆中，施加5次后收获。采集植株样和土壤样的镉含量。

所得结果如图3所述：

与CK相比，M6和M6+C处理植株收获后DTPA提取态的土壤Cd分别增加了76％和104％；与M6相比，M6+C处理伴矿景天叶和茎吸镉量明显增加。

对比例1、将实施例1步骤3)中的生理盐水改成灭菌水，其余等同于实施例1。

对比例2、将实施例1步骤2)改成：将松竹颗粒直接放入马弗炉无氧加热，其余等同于实施例1。

对比例3、取消实施例1步骤4)中的培养，即，用150mL炭基生理盐水将菌体(0.2mL)复悬形成菌悬液，振荡半小时后，直接作为菌株-炭基盐水复合体悬液。其余等同于实施例1。

对比例4、将实施例1中的松竹改成水稻秸秆。其余等同于实施例1。

将上述对比例所得的菌株-炭基盐水复合体悬液，按照田间实例2进行实验，与CK相比，M6+C处理植株收获后DTPA提取态的土壤Cd增加量，如下表1所述。

表1

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.菌株-炭基盐水复合体悬液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、制备耐镉菌M6的菌体；

2)、制备生物质炭：

将松竹干燥后粉碎，得松竹颗粒；

将松竹颗粒在无氧条件下加热至800±50℃保温处理1±0.1小时，得松竹生物质炭；

3)、制备炭基生理盐水：

按照30±2g/L的料液比，将松竹生物质炭加入至生理盐水中，搅拌均匀振荡；再调节pH至7±0.5，得炭基生理盐水；

4)、制备菌株-炭基盐水复合体悬液：

在150±10mL炭基生理盐水中加入菌体0.2mL，将所得的菌悬液先均匀振荡，然后于25±1℃培养22～26h后，再均匀振荡，得菌株-炭基盐水复合体悬液。

2.根据权利要求1所述的菌株-炭基盐水复合体悬液的制备方法，其特征在于：

所述步骤2)为：将松竹先于60±5℃烘干20±1h，再于48±5℃烘干28±1h，然后粉碎，得松竹颗粒。

3.根据权利要求1或2所述的菌株-炭基盐水复合体悬液的制备方法，其特征在于：

所述步骤2)为：将松竹颗粒用锡箔纸包好，且排除松竹颗粒之间孔隙间的空气，再外附一层锡箔纸用于密封；然后置于马弗炉内，在无氧的条件下以15±1℃/分钟的升温速率升温至800±50℃，保温处理1±0.1小时，得松竹生物质炭。

4.一种超积累植物富集镉的微生物强化方法，利用如权利要求1～3任一所述方法制备所得的菌株-炭基盐水复合体悬液，其特征在于：在镉污染土壤中种植伴矿景天，且每隔8～12d施加一次菌株-炭基盐水复合体悬液。