CN116274343A - 一种高效、绿色、永久性固定土壤重金属镉的修复方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了土壤治理领域的一种高效、绿色、永久性固定土壤重金属镉的修复方法通过生物炭与巴氏孢子菌相互结合构建耦合系统，在耦合系统系统中生物炭作为培养基，由于生物炭富含养分、空隙，可为细菌提供养分、生长栖息地，刺激细菌生长，随后细菌在繁殖过程中代谢基因介导的尿溶途径进行镉固定，同时采用本技术方案后可以高效、快速、永久性的固定土壤镉，镉不再次被释放，无需添加化学试剂、无需机械设备，具有绿色、环保、低碳排放的特点。
Description
技术领域
本发明属于土壤治理领域，具体是一种高效、绿色、永久性固定土壤重金属镉的修复方法。
背景技术
镉(Cd)污染的农业土壤通过食物链暴露给人类造成了严重的健康问题。由于Cd具有不可生物降解性、生物蓄积性和高毒性，会积累在土壤里面，并通过食物链进入人体，威胁人体健康。进入人体的镉会对人的大脑、骨骼和肝脏造成损害。土壤中镉含量高主要是由电镀、精炼厂和矿山排放等人为活动造成的。
为了解决上述问题，目前已经公开物理化学修复技术，如电动力学修复、如淋洗、氧化还原等方法进行修复，例如公告号为CN108201962A的技术方案公开了一种镉污染土壤的治理装置，该装置通过搅拌的方法对土壤粉碎后与有机肥混合改良土壤。但是上述方法进行修复时往往容易产生使用较多的机械设备，成本较高。2、耗能高。3、碳排放多。4、容易破坏土壤结构、因添加化学药剂易产生二次污染等缺陷。
发明内容
为了解决传统技术中使用较多机械设备，能耗较高的问题，本发明的目的是提供一种高效、绿色、永久性固定土壤重金属镉的修复方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种高效、绿色、永久性固定土壤重金属镉的修复方法，通过生物炭与巴氏孢子菌相互结合构建耦合系统，在耦合系统系统中生物炭作为培养基，生物炭中的养分和空隙，为细菌提供养分，生长栖息地，从而刺激细菌生长，随后细菌在繁殖过程中代谢基因介导的尿溶途径进行镉固定。
进一步，还包括以下步骤：
S1，细菌的获得，将废弃矿山周围的表层土壤进行采集随后进行土壤分层将细菌提取出；
S2，细菌培养，调节配比细菌培养液，随后将菌体内的芽孢进行分散，从而观察菌株的情况将菌株择优取出；
S3，生物炭制备，利用水稻秸秆通过限氧热解得到生物炭，随后将制得的生物炭研磨；
S4，耦合系统的构建，向被污染的土壤中施加额外的菌种和生物炭；S5，辅导剂添加以实现镉固定，细菌通过必要的代谢基因介导的尿溶途径进行镉固定。
进一步，所述步骤S1中用无菌取土铲挖取土壤置于无菌的离心管中，随后将全部的离心管装入放有冰袋的保温盒里带回，称取2g土壤样品放置于广口锥形瓶内进行培养。
进一步，所属步骤S2中将培养细菌环境的pH调节至6.5-7.5之间，随后在恒温摇床中振荡，使样品中菌体、芽孢分散，静置后取其上清液采用稀释涂布平板法依次稀释到10-7，分别取10-5、10-6和10-7的稀释液均匀涂布于筛选培养基上，放入30℃的恒温培养箱中培养24h通过观察不同平板上菌株的生长速度、生长量以及酶促反应变色状况初步筛选出生长能力强、产脲酶活性高的菌株，通过观察其菌落特征等进行初步鉴定，再利用16SrRNA序列测定确定其种属，获得目标细菌：巴氏孢子菌菌株。
进一步，所述步骤S3中生物炭利用稻秆通过热解得到，具体制备步骤如下将水稻秸秆在60℃烘箱干燥至恒定重量，研磨通过0.15mm筛，然后在马弗炉中300℃有限空气条件下热解，然后，制得的生物炭冷却并研磨。
进一步，所述步骤S4中将采集到的镉污染土壤进行风干，风干后过2mm筛，向该污染土壤添加0.00069％(W/W)尿素及0.00125％(W/W)CaCl2激活土壤矿化过程。随后将生物炭及细菌添加到镉污染土壤上，生物炭添加量为1％(W/W)，细菌添加量为1％(V/W)，混匀，混匀的土壤放到烧杯中，并在25℃恒温箱中进行，昼夜光照12/12h。在培养期间，土壤样品每天浇水，以保持60％的持水能力。
采用上述方案后实现了以下有益效果：1、高效、快速、永久性的固定土壤镉，镉不再次被释放。
2、无需添加化学试剂、无需机械设备，具有绿色、环保、低碳排放的特点。
3、固化过程中其反应方程式为：
(NH2)2CO+H2O→2NH3+CO2(反应式1)
2NH3+2H2O→2NH4 ++2OH-(反应式2)
CO2+2OH-→HCO3 –+OH-→CO3 2–+H2O(反应式3)
Ca2++CO3 2–→CaCO3(↓)(反应式4)
Cd2++CO3 2–→CdCO3(↓)(反应式5)
细菌通过必要的代谢基因介导的尿溶途径进行镉固定。尿素被产脲酶细菌分泌的脲酶水解成NH4 +和CO2(反应式1)。在水解过程中，CO3 2-被释放(反应式2-3)，导致Ca2+以CaCO3的形式沉淀(反应式4)。同时Cd可代换Ca，与生成CdCO3(反应式5)。
附图说明
图1为本发明XRD分析数据图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例基本如附图1所示：一种高效、绿色、永久性固定土壤重金属镉的修复方法具体实施过程如下：
1、细菌筛选与培养
a.细菌筛选
在废弃矿山周围进行土样采集，采集表层(0-20cm)。用无菌取土铲挖取土壤置于无菌50ml离心管中。将全部的离心管装入放有冰袋的保温盒里，带回。
称取2g土壤样品放置于，经高压灭菌处理后的广口锥形瓶(内含100ml LB液体培养基:胰蛋白酶(Tryptone)10g、酵母提取物(Yeast Extract)5g、NaC110g，琼脂18-20g(固体培养基需要)，pH调节至6.5-7.5之间，调节时所用的NaOH和HC1的浓度均为0.1mol/L，121℃高压灭菌30min。)，在30℃、150r/min恒温摇床中振荡24h，使样品中菌体、芽孢分散，静置5min后取其上清液采用稀释涂布平板法依次稀释到10-7，分别取10-5、10-6、10-7的稀释液均匀涂布于筛选培养基上(蛋白胨1g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，葡萄糖1g/L，酚红溶液0.012g/L，20g/L琼脂，pH 7。
冷却灭菌至50℃加入过滤灭菌的40％的尿素溶液50mL)，放入30℃的恒温培养箱中培养24h通过观察不同平板上菌株的生长速度、生长量以及酶促反应变色状况初步筛选出生长能力强、产脲酶活性高的菌株，通过观察其菌落特征等进行初步鉴定，再利用16SrRNA序列测定确定其种属。获得目标细菌：巴氏孢子菌(Sporosarcina pasteurii,S.pasteurii)菌株。
b.细菌培养
在250mL培养瓶中培养产脲酶菌，瓶中含有125mL Tris-YE生长培养基(20g L-1酵母提取物，10g L-1(NH4)2SO4,15g L-1Tris和1g 24mL-1尿素)。细菌培养物在30℃下振荡48小时(130rpm)。然后使用紫外可见光谱(V-730，日本)测量光密度，以评估细菌生长。细菌强度为1.52×108cell mL-1，供进一步使用。
2、生物炭制备
生物炭是利用稻秆通过热解得到的。水稻秸秆在60℃烘箱干燥至恒定重量，研磨通过0.15mm筛，然后在马弗炉中300℃有限空气热解2小时。当生物炭含有大量官能团时细菌的生长较好，所以热解温度设置为低温热解，为300℃。然后，制得的生物炭冷却并研磨，在使用前通过100目的尺寸。
3、生物炭-细菌(2B)系统固定土壤镉
采用巴氏孢子菌(Sporosarcina pasteurii,S.pasteurii)菌株对土壤中Cd进行生物修复，采用生物炭维持土壤肥力和功能。巴氏菌和生物炭耦合系统，称为“生物炭-细菌(2B)系统”。我们直接向被污染的土壤中施加额外的菌种和生物炭，以创建一个简单可行的途径。具体操作如下：
采集到的镉污染土壤进行风干，风干后过2mm筛。向该污染土壤添加0.00069％(W/W)尿素及0.00125％(W/W)CaCl2以激活土壤矿化过程。随后将生物炭及细菌添加到镉污染土壤上，生物炭添加量为1％(W/W)，细菌添加量为1％(V/W)，混匀。
混匀的土壤放到烧杯中，并在25℃恒温箱中进行，昼夜光照12/12h。在培养期间，土壤样品每天浇水，以保持60％的持水能力。培养20天后，采集土壤样品分析。
4、生物炭-细菌(2B)系统永久快速固定镉
20天后，可以快速、有效降低镉的有效性。
20天后，请参考图1，XRD分析发现土壤镉以CdCO3的形式固定在土壤中，实现永久固定。
其反应方程式为：
(NH2)2CO+H2O→2NH3+CO2(反应式1)
2NH3+2H2O→2NH4 ++2OH-(反应式2)
CO2+2OH-→HCO3 –+OH-→CO3 2–+H2O(反应式3)
Ca2++CO3 2–→CaCO3(↓)(反应式4)
Cd2++CO3 2–→CdCO3(↓)(反应式5)
细菌通过必要的代谢基因介导的尿溶途径进行镉固定。尿素被产脲酶细菌分泌的脲酶水解成NH4 +和CO2(反应式1)。在水解过程中，CO3 2-被释放(反应式2-3)，导致Ca2+以CaCO3的形式沉淀(反应式4)。同时Cd可代换Ca，与生成CdCO3(反应式5)。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (6)
1.一种高效、绿色、永久性固定土壤重金属镉的修复方法，其特征在于：通过生物炭与巴氏孢子菌相互结合构建耦合系统，在耦合系统系统中生物炭作为培养基，生物炭中的养分和空隙，为细菌提供养分，生长栖息地，从而刺激细菌生长，随后细菌在繁殖过程中代谢基因介导的尿溶途径进行镉固定。
2.根据权利要求1所述的一种高效、绿色、永久性固定土壤重金属镉的修复方法，其特征在于：还包括以下步骤：
S1，细菌的获得，将废弃矿山周围的表层土壤进行采集随后进行土壤分层将细菌提取出；
S2，细菌培养，调节配比细菌培养液，随后将菌体内的芽孢进行分散，从而观察菌株的情况将菌株择优取出；
S3，生物炭制备，利用水稻秸秆通过限氧热解得到生物炭，随后将制得的生物炭研磨；
S4，耦合系统的构建，向被污染的土壤中施加额外的菌种和生物炭；
S5，辅导剂添加以实现镉固定，细菌通过必要的代谢基因介导的尿溶途径进行镉固定。
3.根据权利要求2所述的一种高效、绿色、永久性固定土壤重金属镉的修复方法，其特征在于：所述步骤S1中用无菌取土铲挖取土壤置于无菌的离心管中，随后将全部的离心管装入放有冰袋的保温盒里带回，称取2g土壤样品放置于广口锥形瓶内进行培养。
4.根据权利要求2所述的一种高效、绿色、永久性固定土壤重金属镉的修复方法，其特征在于：所属步骤S2中将培养细菌环境的pH调节至6.5-7.5之间，随后在恒温摇床中振荡，使样品中菌体、芽孢分散，静置后取其上清液采用稀释涂布平板法依次稀释到10-7，分别取10-5、10-6和10-7的稀释液均匀涂布于筛选培养基上，放入30℃的恒温培养箱中培养24h通过观察不同平板上菌株的生长速度、生长量以及酶促反应变色状况初步筛选出生长能力强、产脲酶活性高的菌株，通过观察其菌落特征等进行初步鉴定，再利用16SrRNA序列测定确定其种属，获得目标细菌：巴氏孢子菌菌株。
5.根据权利要求2所述的一种高效、绿色、永久性固定土壤重金属镉的修复方法，其特征在于：所述步骤S3中生物炭利用稻秆通过热解得到，具体制备步骤如下将水稻秸秆在60℃烘箱干燥至恒定重量，研磨通过0.15mm筛，然后在马弗炉中300℃有限空气热解，然后，制得的生物炭冷却并研磨。
6.根据权利要求5所述的一种高效、绿色、永久性固定土壤重金属镉的修复方法，其特征在于：所述步骤S4中将采集到的镉污染土壤进行风干，风干后过2mm筛，向该污染土壤添加0.00069％(W/W)尿素及0.00125％(W/W)CaCl2激活土壤矿化过程。随后将生物炭及细菌添加到镉污染土壤上，生物炭添加量为1％(W/W)，细菌添加量为1％(V/W)，混匀，混匀的土壤放到烧杯中，并在25℃恒温箱中进行，昼夜光照12/12h。在培养期间，土壤样品每天浇水，以保持60％的田间持水能力。
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