CN111494979A - 一种强化分子结晶过程的结晶系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于结晶技术领域，提供了一种强化分子结晶过程的结晶系统和方法。该发明的结晶体系由结晶器、常压氮气保护室、可控电场、结晶溶液液滴滴加及实时监测体系喝温湿度控制系统组成。本发明中结晶器具有微米级凹井矩阵，并对其电荷性质进行调变，随后在外部电场下实现结晶器凹井结构处微电场的调控，促使荷电分子的定向泳动，达到结晶溶液的局部过饱和，从而实现对分子结晶行为的调控。外部电场的存在可以显著降低分子结晶过程的难度，增强过程的可控性。该结晶系统搭建简单、成本低廉，方法操作简便易行，且适用于磁场、电场、温度、湿度、pH等各种不同条件参数对结晶过程的调控。

Description

一种强化分子结晶过程的结晶系统和方法

技术领域

本发明属于结晶技术领域，具体地涉及一种强化分子结晶过程的结晶系统和方法。

背景技术

溶液结晶作为一种低能耗、低污染的高效分离和固体产品精制过程，广泛应用于食品工业、医药工业、生物化工、催化剂制造等领域。溶液结晶的传统手段主要是蒸发结晶、冷却结晶和萃取结晶。但是它们都存在一些局限，对于蒸发结晶来说，过高的温度严重制约了热敏性分子的结晶；对于低浓度结晶溶液来说，冷却结晶能耗高且产率低，萃取结晶需要添加新组分，既增加了结晶的难度，也增大的结晶的成本。此外，传统结晶手段的结晶条件调控粗犷，晶型控制难度大，重复性低。而目前无论是解析蛋白质的结构，还是研制特种药物和疫苗，都对晶体的质量、纯度、形貌等要求极高，传统结晶的局限性日益凸显。因此，为了便捷、高效的获取高质量晶体颗粒，优化、改进结晶过程，设计简单、通用的分子结晶系统和方法是目前面临的巨大挑战之一。文献D’Arcy A.,Villard F.,Marsh M.,An automatedmicroseed matrix-screening method for protein crystallization[J].ActaCrystallographica Section D:Biological Crystallography,2007,63(4):550-554.采用籽晶技术，向亚稳态溶液中加入晶核，一定程度上提高了结晶的效率，但是在这一过程中，需要将特定晶核逐一添加进结晶体系中，制约了自动化结晶的实现。因此，籽晶技术在面对工业大批量生产时，意义并不显著。而具有普适性、过程可控的结晶工艺和分析方法的开发尚未见报道。

众所周知，分子的结晶严重受限于结晶溶液的浓度，其驱动力来源于结晶溶液的过饱和度，只有当结晶溶液浓度大于其饱和度时，分子的结晶才能够自发进行。但是对于部分高附加值的样品来说，结晶溶液浓度很难达到过饱和，从而严重限制了分子结晶的成功率。本发明设计了具有微米级矩阵凹井的结晶器，并对其凹井结构进行表面接枝，改变结晶器荷电性质，随后利用外部电场调控凹井结构的局部电场，进而诱导分子的结晶，实现分子晶体的制备。

发明内容

要解决的技术问题：

为了突破现有技术的瓶颈，本发明设计了一种强化分子结晶过程的结晶体系，通过在结晶器矩阵凹井上的化学接枝，改变结晶器凹井的荷电性质，从而实现在外部电场下局部电荷密度的调控，并将其应用于高附加值分子的结晶，有效降低了结晶过程中的成核难度，缩短了结晶的诱导时间，解决了现有技术中溶液结晶成功率低的问题。

本发明的技术方案：

一种强化分子结晶过程的结晶方法，通过对结晶器施加外部电场，调控结晶器矩阵凹井结构的局部电场，实现结晶分子的定向泳动、富集，使溶液局部过饱和进而形成晶核，诱导晶体的形成；该结晶方法所用的结晶系统包含结晶器I，常压氮气保护室II，可控电场III，结晶溶液液滴滴加及实时监测体系IV，温、湿度控制系统V；该结晶方法，步骤如下：

(1)设定常压氮气保护室II中的温度和湿度的值，并利用温、湿度控制系统V使常压氮气保护室II中的温度和湿度稳定在设定值，并在整个结晶过程中实时监测、调控体系中的温度和湿度，完成晶体培养的前期准备工作；

(2)将配置好的结晶溶液滴加在结晶器I的凹井中，并立即调节高压直流电源至待研究电压；

(3)利用用户电脑2联合高速摄像机1和强光源13来实时观测样品在结晶器I凹井中的结晶行为；

(4)当晶体完成培养阶段后，利用反溶剂清洗出晶体颗粒，并收集。

所述的结晶器I的制备方法，采用3D打印的方法实现UV树脂的光固化并制备成结晶器I，且结晶器I表面具有矩阵式的凹井；随后，对矩阵式的凹井的电性进行调控：aUV树脂主要成分是聚丙烯酸，得到的结晶器的凹井具有羧基官能团，使凹井荷负电；b用过量氨水中和凹井上的羧酸官能团，使凹井对外呈电中性；c利用凹井的羧基官能团，将氨丙基咪唑API接枝到凹井上，再由碘甲烷使其季铵化，从而使凹井荷正电；d将2-溴乙胺氢溴酸盐接枝到1,2-二甲基咪唑生成1-氨基乙基-2，3二甲基咪唑溴化物，再利用凹井上的羧基，将其接枝在凹井上，从而使凹井荷正电。

所述的结晶器I的电性调变方法a：用无水乙醇超声清洗结晶器，干燥后得到凹井荷负电的结晶器I；方法b：用无水乙醇超声清洗结晶器I，在结晶器I的矩阵凹井中加入10～30wt％的氨水，在20～60℃下处理1～24h，倒出并用无水乙醇清洗，干燥后得到凹井不荷电的结晶器I；方法c：用无水乙醇超声清洗结晶器I，向结晶器I的凹井中加入API溶液，浓度为0.1～10wt％，20～60℃下处理1～24h，倒出并用无水乙醇清洗，干燥后向凹井中加入碘甲烷溶液，浓度为0.1～10wt％，20～60℃下处理1～24h，倒出并用无水乙醇清洗，干燥后得到凹井荷正电的结晶器I；方法d：在20～100℃条件下，将2-溴乙胺氢溴酸盐和1,2-二甲基咪唑在无水乙醇中处理60～120h，结晶、清洗后得到1-氨基乙基-2，3二甲基咪唑溴化物AeImBr，再向凹井中加入AeImBr溶液，浓度为1～10wt％，在20～100℃下处理1～24h，倒出并用无水乙醇清洗，干燥后得到矩阵凹井荷正电的结晶器I。

所述的常压氮气保护室II包含密封壁面3，与可移动密封门4组成密闭的结晶空间，在上下、左右四块壁面上分别内嵌上、下电极板5，左、右电极板6，并在壁面上开辟氮气进口7、氮气出口8。

可控电场III的设计，电场由外加高压直流电源提供，将电源正负极分别连接在上、下电极板或左、右电极板，通过调节电源电压可控制电场强度，转换正、负极可以调节电场方向。

结晶溶液液滴滴加及实时监测体系IV的使用，使结晶溶液的滴加量和滴加位置实现了精准的控制，同时实时观察液滴中分子的结晶行为。

结晶溶液滴加装置是由用户电脑2联合步进电机10和微量进样器11来调整液滴的滴加体积，由用户电脑2联合高速摄像机1和调平试验台9来控制液滴的滴加位置，此外还包含所需的辅助连接装置12。

分子结晶行为的实时监测体系是由电脑2联合高速摄像机1和强光源13来实时监测结晶溶液中分子的结晶行为，此外还包含连接所需的导线14。

所述的温、湿度控制系统V包括温、湿度测量与控制装置，来实时检测并调控常压氮气保护室II中的温、湿度，温度调控范围是-30～100℃，湿度调控范围为10％～100％。

所述的反溶剂为：目标结晶分子不溶或者溶解度极低的任何溶剂。

本发明的有益效果：本发明提出一种强化分子结晶过程的结晶系统和方法，通过外部电场调控结晶器凹井结构的局部电场，诱导荷电结晶分子的定向泳动，达到结晶溶液的局部浓缩，提高结晶的成功率。本发明旨在高附加值分子的结晶，利用局部电场的调变降低结晶溶液在结晶过程中成核的难度，缩短结晶的诱导时间，同时结晶过程精准可控。在本发明中，结晶系统搭建简单、成本低廉、适用范围广，能够轻易的实现在磁场、电场、温度、湿度、pH等因素下的结晶过程的调控。

附图说明

图1是本系统的正面示意图。

图2(a)是适用于本系统的具有微米级凹井矩阵的结晶器的等轴测视图。

图2(b)是适用于本系统的具有微米级凹井矩阵的结晶器的剖视图。

图3是NaCl在10kV电场下结晶晶体的SEM图。

图4是溶菌酶在10kV电场下结晶晶体的SEM图。

图中：1高速摄像机；2电脑；3密封壁面；4可移动密封门；5内嵌式上、下电极板；6内嵌式左、右电极板；7氮气进口；8氮气出口；9调平试验台；10步进电机；11微量进样器；12辅助连接装置；13强光源；14导线；I结晶器；II常压氮气保护室；III可控电场；IV结晶溶液液滴滴加及实时监测体系；V温、湿度控制系统。

具体实施方式

以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。

实施例1

采用3D打印技术制备微结晶器，并采用步骤1中的方法a处理结晶器待用。取1.4g的NaCl溶解在20mL的去离子水中，在25℃下配置成稳定均一的溶液待用。打开氮气进、出气阀，排尽结晶系统中空气，并利用温、湿度控制仪调控系统内的温度为10～30℃，湿度为40～80％。然后用液滴滴加装置将配置好的结晶溶液滴在微结晶器的荷电凹井矩阵中，并立即打开高压直流电源(连接上、下电极板)，将电压调至10kV，使结晶器在稳定电场中静置蒸发24h，得到晶体如图3。

实施例2

采用3D打印技术制备微结晶器，并采用步骤1中的方法c处理结晶器待用。将13.6g醋酸钠粉末溶解在83.1g冰醋酸溶液中，制成醋酸-醋酸钠缓冲浓缩液，取6.5g醋酸-醋酸钠缓冲浓缩液溶于1L去离子水中，充分搅拌，得到pH值为3.65的缓冲液待用。随后，将300mg溶菌酶冻干粉溶于10mL上述缓冲液中，将0.5g的NaCl溶于10mL的缓冲液中作结晶剂，将二者混合后，加入0.6g丙三醇作添加剂，混合均匀后得到溶菌酶溶液待用。打开氮气进、出气阀，排尽结晶系统中空气，并利用温、湿度控制仪调控系统内的温度为10～30℃，湿度为40～80％。然后用液滴滴加装置上述结晶溶液滴在微结晶器的荷电凹井矩阵中，并立即打开高压直流电源(连接上、下电极板)，将电压调至10kV，使结晶器在稳定电场中静置蒸发24h，得到晶体如图4。

Claims (9)

1.一种强化分子结晶过程的结晶方法，通过对结晶器施加外部电场，调控结晶器矩阵凹井结构的局部电场，实现结晶分子的定向泳动、富集，使溶液局部过饱和进而形成晶核，诱导晶体的形成；该结晶方法所用的结晶系统包含结晶器(I)，常压氮气保护室(II)，可控电场(III)，结晶溶液液滴滴加及实时监测体系(IV)，温、湿度控制系统(V)；该结晶方法，其特征在于，步骤如下：

(1)设定常压氮气保护室(II)中的温度和湿度的值，并利用温、湿度控制系统(V)使常压氮气保护室(II)中的温度和湿度稳定在设定值，并在整个结晶过程中实时监测、调控体系中的温度和湿度，完成晶体培养的前期准备工作；

(2)将配置好的结晶溶液滴加在结晶器(I)的凹井中，并立即调节高压直流电源至待研究电压；

(3)利用用户电脑(2)联合高速摄像机(1)和强光源(13)来实时观测样品在结晶器(I)凹井中的结晶行为；

(4)当晶体完成培养阶段后，利用反溶剂清洗出晶体颗粒，并收集。

2.根据权利要求1所述的强化分子结晶过程的结晶方法，其特征在于，所述的结晶器(I)的制备方法，采用3D打印的方法实现UV树脂的光固化并制备成结晶器(I)，且结晶器(I)表面具有矩阵式的凹井；随后，对矩阵式的凹井的电性进行调控：a)UV树脂主要成分是聚丙烯酸，得到的结晶器的凹井具有羧基官能团，使凹井荷负电；b)用过量氨水中和凹井上的羧酸官能团，使凹井对外呈电中性；c)利用凹井的羧基官能团，将氨丙基咪唑API接枝到凹井上，再由碘甲烷使其季铵化，从而使凹井荷正电；d)将2-溴乙胺氢溴酸盐接枝到1,2-二甲基咪唑生成1-氨基乙基-2，3二甲基咪唑溴化物，再利用凹井上的羧基，将其接枝在凹井上，从而使凹井荷正电。

3.根据权利要求1或2所述的强化分子结晶过程的结晶方法，其特征在于，所述的结晶器(I)的电性调变方法a：用无水乙醇超声清洗结晶器，干燥后得到凹井荷负电的结晶器(I)；方法b：用无水乙醇超声清洗结晶器(I)，在结晶器(I)的矩阵凹井中加入10～30wt％的氨水，在20～60℃下处理1～24h，倒出并用无水乙醇清洗，干燥后得到凹井不荷电的结晶器(I)；方法c：用无水乙醇超声清洗结晶器(I)，向结晶器(I)的凹井中加入API溶液，浓度为0.1～10wt％，20～60℃下处理1～24h，倒出并用无水乙醇清洗，干燥后向凹井中加入碘甲烷溶液，浓度为0.1～10wt％，20～60℃下处理1～24h，倒出并用无水乙醇清洗，干燥后得到凹井荷正电的结晶器(I)；方法d：在20～100℃条件下，将2-溴乙胺氢溴酸盐和1,2-二甲基咪唑在无水乙醇中处理60～120h，结晶、清洗后得到1-氨基乙基-2，3二甲基咪唑溴化物AeImBr，再向凹井中加入AeImBr溶液，浓度为1～10wt％，在20～100℃下处理1～24h，倒出并用无水乙醇清洗，干燥后得到矩阵凹井荷正电的结晶器(I)。

4.根据权利要求3所述的强化分子结晶过程的结晶方法，其特征在于，所述的常压氮气保护室(II)包含密封壁面(3)，与可移动密封门(4)组成密闭的结晶空间，在上下、左右四块壁面上分别内嵌上、下电极板(5)，左、右电极板(6)，并在壁面上开辟氮气进口(7)、氮气出口(8)。

5.根据权利要求1、2或4所述的强化分子结晶过程的结晶方法，其特征在于，可控电场(III)的设计，电场由外加高压直流电源提供，将电源正负极分别连接在上、下电极板或左、右电极板，通过调节电源电压可控制电场强度，转换正、负极可以调节电场方向。

6.根据权利要求5所述的强化分子结晶过程的结晶方法，其特征在于，结晶溶液液滴滴加及实时监测体系(IV)的使用，使结晶溶液的滴加量和滴加位置实现了精准的控制，同时实时观察液滴中分子的结晶行为。

7.根据权利要求1、2、4或6所述的强化分子结晶过程的结晶方法，其特征在于，结晶溶液滴加装置是由用户电脑(2)联合步进电机(10)和微量进样器(11)来调整液滴的滴加体积，由用户电脑(2)联合高速摄像机(1)和调平试验台(9)来控制液滴的滴加位置，此外还包含所需的辅助连接装置(12)。

8.根据权利要求7所述的强化分子结晶过程的结晶方法，其特征在于，分子结晶行为的实时监测体系是由电脑(2)联合高速摄像机(1)和强光源(13)来实时监测结晶溶液中分子的结晶行为，此外还包含连接所需的导线(14)。

9.根据权利要求8所述的强化分子结晶过程的结晶方法，其特征在于，所述的温、湿度控制系统(V)包括温、湿度测量与控制装置，来实时检测并调控常压氮气保护室(II)中的温、湿度，温度调控范围是-30～100℃，湿度调控范围为10％～100％。

Images