CN111481502A - 一种褐藻酸硫酸酯制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种褐藻酸硫酸酯的新制剂。具体地，本发明提供了一种乳膏剂，其包括：1～5重量份的褐藻酸硫酸酯；0.5～2重量份的皮肤渗透促进剂；10～30重量份的油相基质；10～90重量份的水；0.2～5重量份的乳化剂；和5～30重量份的保湿剂。本发明提供的乳膏剂具有优异的透皮能力及抑制活性。

Description

一种褐藻酸硫酸酯制剂

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种褐藻酸硫酸酯的新制剂。

背景技术

人乳头瘤病毒(HPV)为一类小DNA病毒，HPV的感染具有高度的嗜上皮特点，只选择性的感染皮肤、黏膜上皮细胞，引发各种皮肤黏膜的良性和恶性病变，全球约5％的癌症的发病率与HPV的感染有关。依据HPV生物学行为，可分为低危型和高危型。高危型HPV感染与多种恶性肿瘤的发生相关，其中75％的宫颈癌发生与HPV16、18感染相关。低危型的HPV感染则引起肛门和生殖器疣，其中绝大部分是由HPV6和HPV11感染引起。同时，根据不同的临床表现和病毒的感染部位不同，HPV还可分为黏膜型及皮肤型。

疣是由HPV感染皮肤黏膜引发的一种皮肤良性病变，儿童及青少年多发，成年人发病率相对偏低。根据疣的临床表现和发病位置又分为寻常疣、扁平疣、跖疣、尖锐湿疣及疣状表皮发育不良等。皮肤疣的传染源为患病者及病毒携带者，多由HPV1、2、4型感染引起，HPV 2型可能是引起人群手、足寻常疣的最常见HPV分型。皮肤疣病损部位触压有痛感，也可无任何症状；皮肤显微镜下可见淡黄色丘疹、增厚角质环及圆形乳头状角质增生，其间伴有毛细血管破裂出血形成的小黑点；病程与机体自身免疫力有重要关系，免疫力低下者发病率高，部分患者可自愈，患者往往因美观及疼痛不适而要求治疗。

目前皮肤疣治疗以破坏疣体、增强局部或全身免疫力为主要手段，包括药物、物理和外科手术切除等方法。但上述治疗方法存在病程长、治疗过程痛苦、易感染及易复发，患者配合度不佳等问题。此外，虽然国际国内都倾注了极大的热情在研发新型的对多种HPV病毒都有预防和控制的药物制剂上，但目前仍没有一种较好的药物可应用于疣体的治疗。

综上所述，本领域迫切需要一种用于治疗和/或预防疣病的新制剂。

发明内容

本发明的目的就是开发一种用于治疗和/或预防疣病的新制剂，该制剂具有优异的透皮能力以及抑制活性。

在本发明的第一方面，提供了一种乳膏剂，且所述乳膏剂包括：

1～5重量份的褐藻酸硫酸酯；

0.5～2重量份的皮肤渗透促进剂；

10～30重量份的油相基质；

10～90重量份的水；

0.2～5重量份的乳化剂；和

5～30重量份的保湿剂。

在另一优选例中，所述乳膏剂为水包油型(O/W)乳膏剂。

在另一优选例中，所述褐藻酸硫酸酯的分子量为100-500kDa；100-250kDa。

在另一优选例中，油相基质与水的质量比为1：(0.5～10)，较佳地1：(1～5)。

在另一优选例中，所述乳膏剂包含1～5wt％的褐藻酸硫酸酯。

在另一优选例中，所述乳膏剂包含0.5～2wt％的皮肤渗透促进剂。

在另一优选例中，所述乳膏剂包含2～4重量份的褐藻酸硫酸酯。

在另一优选例中，所述乳膏剂包含0.75～1.25重量份的皮肤渗透促进剂。

在另一优选例中，所述皮肤渗透促进剂选自下组：月桂氮酮、薄荷醇、肉豆蔻酸异丙酯、N-三甲壳聚糖、油酸、丙二醇，或其组合；较佳地，为月桂氮酮。

在另一优选例中，所述乳膏剂包含15～30重量份的油相基质。

在另一优选例中，所述油相基质选自下组：硬脂酸、二甲基硅油、石蜡(较佳地液状石蜡)、羊毛脂、大豆油、十六醇、十八醇，或其组合。

在另一优选例中，所述油相基质包含1～5重量份的硬脂酸。

在另一优选例中，所述乳膏剂包括20～80重量份的水；更优选地，30～80重量份的水；最优选地，40-70重量份的水。

在另一优选例中，所述乳膏剂包含0.4～4重量份的乳化剂；更优选地，2-4重量份的水。

在另一优选例中，所述的乳化剂选自下组：脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、吐温80、三乙醇胺、蓖麻油聚氧乙烯醚(如EL-80)、辛基酚聚氧乙烯醚(如OP-15)、脂肪醇聚氧乙烯醚23(如AEO-23)、鲸蜡硬脂醇聚氧乙烯醚20(如平平加O-20)，或其组合。

在另一优选例中，所述乳膏剂包含5～15重量份的保湿剂。

在另一优选例中，所述保湿剂选自下组：甘油、白凡士林、透明质酸钠、聚乙二醇、丙二醇、山梨醇、羧甲基纤维素钠，或其组合。

在另一优选例中，所述保湿剂为甘油和白凡士林的组合。

在另一优选例中，所述保湿剂包含4～6重量份的白凡士林。

在另一优选例中，所述乳膏剂还包含：0.1～2重量份的抗氧化剂；优选地包含0.5～1.5重量份的抗氧化剂。

在另一优选例中，所述抗氧化剂选自下组：维生素E、丁基羟基茴香醚、2，6-二叔丁基对羟基甲苯、丙基没食子酸，或其组合。

在另一优选例中，所述乳膏剂还包含：1～15重量份的助乳剂；优选地包含2～4重量份的助乳剂。

在另一优选例中，所述的助乳剂选自下组：单硬脂酸甘油酯、硬脂醇，或其组合。

在另一优选例中，所述乳膏剂还包含：0.05～0.2重量份的防腐剂。

在另一优选例中，所述防腐剂选自下组：尼泊金酯、氯甲酚、三氯叔丁醇、氯己定，或其组合。

在本发明的第二方面，提供了一种如第一方面所述的乳膏剂的制备方法，所述方法包括步骤：

(i)按比例提供如第一方面所述的乳膏剂的各组分；

(ii)分别制备油相和水相；和

(iii)混合所述油相和所述水相，得到所述乳膏剂。

在另一优选例中，在搅拌下混合所述油相和所述水相。

在另一优选例中，在加热条件下(较佳地70～90℃)下混合所述油相和所述水相。

在另一优选例中，步骤(iii)为在搅拌下，向所述油相中加入(较佳地缓慢加入)水相，得到所述乳膏剂。

在另一优选例中，使油相和水相的混合物冷却后(较佳地，所述冷却是指降温至室温)，得到所述乳膏剂。

在另一优选例中，所述油相的制备方法包括步骤：

(a-1)按比例提供油相基质、保湿剂、皮肤渗透促进剂、任选的助乳剂，和任选的抗氧化剂；

(a-2)混合步骤(a-1)中各组分，得到所述油相。

在另一优选例中，在搅拌下混合步骤(a-1)中各组分。

在另一优选例中，在70～90℃下混合步骤(a-1)中各组分。

在另一优选例中，所述水相的制备方法包括步骤：

(b-1)按比例提供乳化剂、活性成分、保湿剂、和水；

(b-2)混合步骤(b-1)中各组分，得到所述水相。

在另一优选例中，在搅拌下混合步骤(b-1)中各组分。

在另一优选例中，在70～90℃下混合步骤(b-1)中各组分。

在另一优选例中，向所述水相中按比例加入防腐剂。

在本发明的第三方面，提供了一种产品，所述产品包括如第一方面所述的乳膏剂。

在另一优选例中，所述产品为消毒产品、药物、和/或医疗器械。

在另一优选例中，所述医疗器械包括：推注器，所述推注器内部预置有如第一方面所述乳膏剂。

在本发明的第四方面，提供了如第一方面所述的乳膏剂的用途，用于抑制ERK。

在另一优选例中，所述的乳膏剂用于抑制ERK在宫颈细胞中的表达。

在另一优选例中，所述的宫颈细胞包括未被HPV感染的宫颈细胞和被HPV感染的宫颈细胞。

在另一优选例中，所述的乳膏剂用于抑制ERK在被HPV感染的宫颈细胞中的表达。

在另一优选例中，所述的乳膏剂用于抑制ERK在被HPV感染的宫颈癌细胞中的表达。

在另一优选例中，所述的乳膏剂用于抑制ERK在被HPV感染的皮肤和/或粘膜细胞中的表达。

在另一优选例中，所述的乳膏剂用于抑制ERK基因在宫颈细胞中的表达。

在另一优选例中，所述的乳膏剂用于抑制ERK基因在皮肤和/或粘膜细胞中的表达。

在另一优选例中，所述的HPV感染为高危型HPV的感染，和/或低危型HPV的感染。

在另一优选例中，所述的高危型HPV选自下组：HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82，或其组合。

在另一优选例中，所述的低危型HPV选自下组：HPV1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或其组合。

在另一优选例中，所述的乳膏剂还用于预防和/或治疗与ERK过表达和/或ERK活性过高相关的疾病。

在另一优选例中，所述的“与ERK过表达和/或ERK活性过高相关的疾病”选自下组：流行性感冒、溃疡性结肠炎、宫颈癌、疣病、帕金森、哮喘和/或糖尿病肾病。

在另一优选例中，所述疣病包括寻常疣、扁平疣、跖疣、尖锐湿疣及疣状表皮发育不良，和/或肛门和生殖器疣。

在另一优选例中，所述乳膏剂还用于抑制NF-κB。

在本发明的第五方面，提供了一种体外非治疗性抑制NF-κB活化和/或ERK蛋白表达的方法，所述方法包括步骤：

在褐藻酸硫酸酯存在下，培养细胞，从而抑制所述细胞内ERK蛋白的表达。

在另一优选例中，所述的细胞包括正常宫颈细胞、宫颈癌细胞(如HeLa细胞)。

在另一优选例中，所述的细胞包括被HPV感染的宫颈细胞。

在本发明的第六方面，提供了一种抑制ERK蛋白表达的方法，所述方法包括步骤：

向需要的对象施用安全有效量的褐藻酸硫酸酯。

在另一优选例中，所述的施用包括局部给药、经皮给药、阴道内给药。

在另一优选例中，以1毫克/千克体重～100毫克/千克体重的量施用褐藻酸硫酸酯；更佳地，5毫克/千克体重～50毫克/千克体重，最佳地，10毫克/千克体重～20毫克/千克体重。

在另一优选例中，所述的方法是治疗性的或体外非治疗性的。

在本发明的第七方面，提供了一种治疗和/或预防的与ERK过表达和/或ERK活性过高相关的疾病方法，包括步骤：

向需要的对象施用如第一方面所述的乳膏剂。

在另一优选例中，所述的“与ERK过表达和/或ERK活性过高相关的疾病”选自下组：流行性感冒、溃疡性结肠炎、宫颈癌、疣病、帕金森、哮喘和/或糖尿病肾病。

在另一优选例中，所述疣病包括寻常疣、扁平疣、跖疣、尖锐湿疣及疣状表皮发育不良，和/或肛门和生殖器疣。

在另一优选例中，所述的施用包括局部给药、经皮给药、阴道内给药。

在另一优选例中，以1毫克～100毫克活性成分/千克体重的量施用所述乳膏剂；更佳地，5毫克～50毫克/千克体重，最佳地，10毫克～20毫克/千克体重，其中所述活性成分为褐藻酸硫酸酯。

在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了对细胞中ERK表达的抑制作用。

图2显示了对细胞中NF-κB表达的抑制作用。

图3显示了本发明乳膏剂的体内效果。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入地研究。提供了一种具有新颖组成的乳膏剂，该乳膏剂具有极佳的肤感，且经皮施用本发明的乳膏剂能够获得优异的体内HPV抑制效果。具体地，本发明的乳膏剂通过其新颖的配方大大改善了褐藻酸硫酸酯的透皮能力，尤其是具有更高活性的大分子量的褐藻酸硫酸酯，使得褐藻酸硫酸酯能够顺利达到皮下所需部位。此外，发明人还首次意外地发现了褐藻酸硫酸酯具有抑制ERK的作用。基于此，发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

除非另有定义，否则在说明书和权利要求书中所使用的下述术语具有的含义为所属领域技术人员通常理解的涵义。除非另有说明，本文全文引用的所有专利、专利申请、公开材料通过引用方式整体并入本文。

应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本发明主题作任何限制。在本申请中，除非另有具体说明，否则使用单数时也包括复数。必须注意，除非文中另有清楚的说明，否则在本说明书和权利要求书中所用的单数形式包括所指事物的复数形式。还应注意，除非另有说明，否则所用“或”、“或者”表示“和/或”。此外，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

ERK

细胞外信号调节激酶(ERK)是发现于20世纪90年代的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是有丝分裂原活化蛋白激酶MAPKs家族的重要亚族之一。活化的ERK能将胞外信号传递至细胞核，促进细胞质靶蛋白的磷酸化或调节其他蛋白激酶的活性，进而调节基因的表达。其信号传导是涉及调节细胞生长、发育及分化的信号网络的中心。因此，ERK参与细胞的增殖、分化、迁移、侵袭和凋亡等多种生物学效应。

Ras/Raf/MEK/ERK通路是与ERK功能相关的主要信号通路，由于该通路调控细胞的增殖、分化和凋亡，因此近年来该通路上的节点蛋白成为癌症靶向药物研发的热点所在。特异性的B-Raf抑制剂Vemurafenib和dabrafenib分别于2011年和2013年上市用于黑色素瘤的治疗，其中dabrafenib用于治疗B-RafV600E突变型非小细胞肺癌，获得了FDA的突破性药物资格。MEK1/2抑制剂trametinib也于2013年上市用于黑色素瘤的治疗。然而抑制这些上游通路节点有其局限性，肿瘤对B-Raf和MEK抑制剂可以快速的产生抗药性，药性产生的机制包括点突变、蛋白多聚形式改变、蛋白肽链长度改变等多种方式，这对于下一代抗耐药Raf、MEK药物是极大的阻碍。ERK作为该通路的下游关键节点，目前尚未发现有耐药性突变发生，ERK的靶向药物可能极大地改善对上游靶点抑制剂产生耐药的病人的治疗，是极具潜力的抗癌药研发领域。

本发明还提供了治疗或预防与ERK过表达和/或ERK活性过高相关的疾病的方法，向需要的对象施用安全有效量的褐藻酸硫酸酯、或含安全有效量的褐藻酸硫酸酯的组合物，或含安全有效量的褐藻酸硫酸酯的制剂。

如本文所用，所述的“ERK过表达”指，与对照(或正常人群或正常细胞)中的ERK表达量E0相比，某一个体或细胞中ERK的表达量E1与E0的比值(E1/E0)≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥5。在另一优选例中，所述的细胞为宫颈细胞。

如本文所用，所述的“ERK活性过高”指，与对照(或正常人群或正常细胞)中的ERK活性A0相比，某一个体或细胞中ERK的活性A1与A0的比值(A1/A0)≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥5。在另一优选例中，所述的细胞为宫颈细胞。

褐藻酸硫酸酯

褐藻酸硫酸酯是一种低聚褐藻酸的C2及C3位上引入硫酸酯基(-OSO₃-)而成的一种硫酸多糖类化合物，重均分子量为100～500kDa，较佳地100kDa-250kDa，聚甘露糖醛酸(M段)含量为5～95％，聚古罗糖醛酸(G段)含量为5～95％，硫酸根取代度为5～15％。

在一个实施例中，所用的褐藻酸硫酸酯的制备方法具体如下：于磺化反应釜中加入500kg甲酰胺，缓慢滴加150kg氯磺酸，滴酸结束加入50kg低聚褐藻酸，继续升温至70℃，反应3h。反应结束后醇沉，洗涤沉淀，沉淀以水溶解，缓慢滴入氢氧化钠溶液转换，待pH降至10，醇沉结晶即得褐藻酸硫酸酯。

其制备过程的反应式如下：

本发明所用的不同分子量的褐藻酸硫酸酯均可参考上述方法制备得到，其中所用低聚褐藻酸不同。

组合物和施用方法

本发明还提供了一种含有褐藻酸硫酸酯作为活性成分的组合物或制剂，且所述的组合物或制剂用于抑制ERK和/或NF-κB。所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、兽药组合物、食品组合物、膳食补充剂、饮料组合物、保健品组合物等。

在本发明中，含褐藻酸硫酸酯的制剂或药物组合物(或兽药组合物)可直接用于疾病治疗或预防，例如，用于与ERK过表达和/或ERK活性过高相关的疾病的治疗和预防。在使用本发明褐藻酸硫酸酯制剂或组合物时，还可同时使用其他ERK过表达和/或ERK活性过高相关的疾病的治疗剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量褐藻酸硫酸酯和任选的额外的ERK过表达和/或ERK活性过高相关的疾病的治疗剂，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、白凡士林、硬脂酸、二甲基硅油、水，或其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。

本发明的药物组合物可以被制成乳膏剂，用常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成透皮(经皮)形式、阴道内或局部给药形式。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明褐藻酸硫酸酯还可与其他治疗剂一起使用。

对于本发明的药物组合物，可通过常规的方式施用于所需的对象(如人和非人哺乳动物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：局部给药、经皮给药、阴道内给药等。

使用药物组合物时，是将安全有效量的褐藻酸硫酸酯制剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约200毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1毫克/千克体重～约100毫克/千克体重；更佳地，是约5毫克/千克体重～约50毫克/千克体重，最佳地，是约10毫克/千克体重～约20毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

乳膏剂及其制备方法

本发明还提供了一种乳膏剂。乳膏的主要组分为水相、油相和乳化剂，同时又根据连续相与分散相的不同，将其分为水包油型(O/W)和油包水型(W/O)两种类型。发明人将褐藻酸硫酸酯分别制成水包油型(O/W)或是油包水型(W/O)的乳膏剂进行测试，发现油包水型乳膏剂肤感较差。

优选地，所述乳膏剂为乳膏剂；更优选地为水包油型乳膏剂。

在一个实施例中，所述的乳膏剂包括：1～5重量份的褐藻酸硫酸酯；0.5～2重量份的皮肤渗透促进剂；10～30重量份的油相基质；10～90重量份的水；0.2～5重量份的乳化剂；和5～30重量份的保湿剂。

优选地，所述的乳膏剂还包含：0.1～2重量份的抗氧化剂；1～15重量份的助乳剂；和/或0.05～0.2重量份的防腐剂。

在另一优选例中，所述皮肤渗透促进剂选自下组：表面活性剂类、二甲亚砜及其类似物、氮酮类化合物、醇类化合物，脂肪酸类化合物，或其组合；较佳地，所述皮肤渗透促进剂为氮酮类化合物(如月桂氮酮)。

在另一优选例中，所述乳化剂为非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂，或其组合；更优选地，所述的乳化剂选自下组：聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸类、聚氧乙烯烷基醚类、失水山梨醇脂肪酸酯类，或其组合。

在另一优选例中，所述抗氧化剂选自下组：天然黄酮类抗氧化剂、酚类抗氧化剂、活性多糖类抗氧化剂、维生素类抗氧化剂、皂苷及丹宁类抗氧化剂，或其组合。

在另一优选例中，所述的助乳剂选自下组：烷醇酰胺类增稠剂、脂肪醇和脂肪酸类增稠剂、醚类增稠剂、酯类增稠剂、氧化胺类增稠剂、纤维素及其改性类增稠剂、聚丙烯酰胺类增稠剂、天然胶及其改性类增稠剂、疏水缔合型增稠剂，或其组合。

在另一优选例中，所述保湿剂选自下组：多元醇类保湿剂、天然保湿因子、氨基酸类保湿剂、高分子生化类保湿剂，或其组合。

在另一优选例中，所述防腐剂选自下组：对羟基苯甲酸酯类、咪唑烷基脲、卡松类及羟甲基二甲基乙内酰脲，或其组合。

如本文所用，白凡士林属于润滑剂、乳膏剂基质类别，极具防水性，是一种非常好的保湿用品，用于配制医药的药膏及皮肤保护油膏用的原料。

如本文所用，硬脂酸又称十八碳烷酸、十八酸等，由油脂水解生产，主要用于生产硬脂酸盐，如硬脂酸钠、硬脂酸镁等，还广泛用于制化妆品、稳定剂、表面活性剂、软化剂、医药品及其他有机化学品。

如本文所用，乳化剂，例如，脂肪醇聚氧乙烯醚、吐温80等等。其中，脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO)，又称为聚氧乙烯脂肪醇醚。聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸(聚山梨酯，吐温类)为一类亲水性非离子表面活性剂，广泛用于制备水包油型乳膏基质。

如本文所用，甘油为无色味甜澄明黏稠液体，无臭，有暖甜味，能从空气中吸收潮气，具有较强的保湿性，在医学方面，用以制取各种制剂、溶剂、吸湿剂、防冻剂和甜味剂，配剂外用软膏或栓剂等。

如本文所用，防腐剂包括尼泊金酯等。其中，尼泊金酯是国际上公认的广谱性高效食品防腐剂，抑菌范围广，对霉菌、酵母菌、革兰氏阴性菌的抑制效果较好。美国、欧洲、日本、加拿大、韩国、俄罗斯等国都允许尼泊金酯在食品中应用，中国GB2760中规定尼泊金乙酯、尼泊金丙酯以及尼泊金甲酯钠、尼泊金乙酯钠、尼泊金丙酯钠盐可以作为食品防腐剂。

如本文所用，皮肤渗透促进剂包括氮酮类化合物(如月桂氮酮)等。

本发明还提供了一种如第一方面所述乳膏剂的制备方法，包括步骤：

(i)按比例提供乳膏剂中各组分；

(ii)分别制备油相和水相；和

(iii)混合所述油相和所述水相，得到所述乳膏剂。

优选地，在搅拌下混合所述油相和所述水相。

优选地，在加热条件下(如70～90℃)下混合所述油相和所述水相。

优选地，步骤(iii)为在搅拌下，向所述油相中加入(较佳地缓慢加入)水相，得到所述乳膏剂。

优选地，将油相和水相的混合物冷却后，较佳地冷却至室温(如10-30℃)后，得到所述乳膏剂。

优选地，所述油相的制备方法包括步骤：

(a-1)按比例提供油相基质、皮肤渗透促进剂、保湿剂、任选的助乳剂，和任选的抗氧化剂；

(a-2)混合步骤(a-1)中各组分，得到所述油相。

更优选地，在搅拌下混合步骤(a-1)中各组分。

更优选地，在70～90℃下混合步骤(a-1)中各组分。

更优选地，步骤(a-1)中，所述保湿剂选自下组：白凡士林、透明质酸钠、聚乙二醇、丙二醇、山梨醇、羧甲基纤维素钠或其组合。

优选地，所述水相的制备方法包括步骤：

(b-1)按比例提供乳化剂、活性成分、保湿剂，和水；；

(b-2)混合步骤(b-1)中各组分，得到所述水相。

更优选地，在搅拌下混合步骤(b-1)中各组分。

更优选地，在70～90℃下混合步骤(b-1)中各组分。

更优选地，步骤(b-1)中，所述保湿剂选自下组：甘油、透明质酸钠、聚乙二醇、丙二醇、山梨醇、羧甲基纤维素钠，或其组合。

更优选地，向所述水相中按比例加入防腐剂。

在一个具体的实施例中，所述乳膏剂通过如下方法制备：

(1)油相制备：

按比例提供油相基质、皮肤渗透促进剂(如月桂氮酮)、保湿剂(如白凡士林等)、助乳剂(如单硬脂酸甘油酯)，和的抗氧化剂(如维生素E)并在70～90℃(如80℃)下混合(较佳地搅拌下混合)，得到油相；

(2)水相制备：

按比例提供乳化剂、活性成分(即褐藻酸硫酸酯)、保湿剂(如甘油等)、和水，并在70～90℃(如80℃)下混合均匀(较佳地搅拌下混合均匀)，制备得水相；较佳地向所述水相中加入防腐剂(如尼泊金酯)；

(3)乳膏剂制备：

在室温(0～30℃)下，搅拌下，将水相加入到油相中，制得乳膏剂。

优选地，搅拌下，将水相加入到油相中，并在搅拌下直至冷却至室温，得乳膏剂；

可选地，当出现颗粒粗糙的现象时，可在乳膏剂温度降到30～40℃时用刮板碾细乳膏。

优选地，所述尼泊金酯被以0.1％的无水乙醇溶液的形式加入。

抑制ERK蛋白表达的方法

本发明还提供了一种抑制ERK蛋白表达的方法，包括步骤：向需要的对象施用安全有效量的褐藻酸硫酸酯。

在另一优选例中，向对象施用褐藻酸硫酸酯是施用浓度为0.01mg/ml～10mg/ml的褐藻酸硫酸酯；优选地，施用浓度为0.25mg/ml～1.5mg/ml的褐藻酸硫酸酯；更优选地，施用浓度为0.5mg/ml～1.0mg/ml的褐藻酸硫酸酯。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的乳膏剂显著改善了活性成分褐藻酸硫酸酯特别是大分子量褐藻酸硫酸酯的透皮能力；本发明的乳膏剂中活性成分透过率高达60％以上，而其他类型的制剂(如凝胶剂)中活性成分的透过率接近于0。

(b)本发明的乳膏剂经皮给药时表现出优异的体内活性。

(c)本发明的乳膏剂具有良好的肤感；还可用于较潮湿的部位，即能吸收湿气，又能产生一定程度的干燥效应，且又易清洁。

(d)本发明的乳膏剂中使用活性成分为高分子量的褐藻酸硫酸酯，其活性相比低分子量的褐藻酸硫酸酯提升了几十倍。

(e)褐藻酸硫酸酯(特别是高分子量的褐藻酸硫酸酯)对ERK具有优秀的抑制活性；且褐藻酸硫酸酯具有优良的安全性，毒副作用很小或几乎无毒副作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非特别指出，各实施例和对比例中所用的褐藻酸硫酸酯的分子量为105～120kDa。

除非特别说明，实施例中所用材料、试剂均通过市售途径获得。

实施例1：褐藻酸硫酸酯对HPV假病毒颗粒侵染过程的抑制作用

将Hela细胞以每毫升十万个细胞接种于96孔细胞培养板，每孔0.1ml，于37度5％CO₂培养箱中培养24小时；加入100倍稀释的HPV假病毒颗粒混合液50μl于Hela细胞中，同时加入不同浓度的褐藻酸硫酸酯(高分子量(105～120kDa)的褐藻酸硫酸酯的浓度为0.625～5μg/ml；低分子量(6-18kDa)的褐藻酸硫酸酯的浓度为7.8～125μg/ml)，研究其对于HPV假病毒侵染的抑制作用，每个浓度3孔，并设立病毒对照孔，37度5％CO₂培养箱中培养24小时。然后弃去培养液，用PBS清洗2次。直接于荧光显微镜下观察，比较加药组与病毒对照组的细胞荧光值的强弱。

实验结果表明，褐藻酸硫酸酯为低分子量时，浓度为31.25μg/ml以上几乎完全抑制GFP荧光的表达，而7.8μg/ml时仍能够抑制荧光的表达。这说明褐藻酸硫酸酯显示出对于HPV16假病毒颗粒侵染过程的强抑制作用，在较低的浓度下(15.625μg/ml)其抑制率仍高达73.8％。结果如表1所示。

褐藻酸硫酸酯为高分子量时，浓度为5μg/ml以上几乎完全抑制GFP荧光的表达，而0.625μg/ml时仍能够抑制荧光的表达。这说明褐藻酸硫酸酯显示出对于HPV16假病毒颗粒侵染过程的超强抑制作用，在较低的浓度下(1.25μg/ml)其抑制率仍高达52.1％。结果如表1所示。

表1.褐藻酸硫酸酯对HPV假病毒颗粒侵染过程的抑制作用

实验结果显示本发明使用的高分子量的褐藻酸硫酸酯的抑制活性显著提升，100％的抑制率仅需5μg/ml的浓度。

实施例2：褐藻酸硫酸酯对NF-κB和ERK蛋白表达的抑制活性

以每毫升10万个细胞接种于6孔细胞培养板，每孔1ml，于37度5％CO₂培养箱中培养24小时；加入2倍稀释的3个浓度(1.0、0.5、0.25mg/ml)的褐藻酸硫酸酯药液，每个浓度3孔，并设立细胞对照孔M，37度5％CO₂培养箱中培养48小时。然后弃去培养液，用PBS清洗2次。加入RIPA细胞裂解液在冰浴中进行裂解30min，将细胞裂解液收集于1.5ml离心管中于4度10,000rpm离心10min去沉淀，将上清与用2x SDS-PAGE上样缓冲液混合后沸水浴5min，冷却后进行SDS-PAGE电泳分离。然后用western blot方法检测HPV的NF-κB和ERK蛋白的表达情况，以β-actin为内参。通过Image J软件对蛋白条带进行定量，将空白对照的NF-κB/actin或ERK//actin比值设为1，然后将各个给药孔的比值分别与对照孔(比值为1)比较，最终可得到各个给药浓度的NF-κB和ERK蛋白的相对表达水平(RL)，并计算抑制率。

HPV的NF-κB或ERK蛋白表达抑制率＝(RL_control-RL_sample)/RL_control。

实验结果见图1、2和表2所示(图中PMGS即褐藻酸硫酸酯)，实验结果表明，褐藻酸硫酸酯各药物组均显示了对于NF-κB的蛋白表达的抑制作用，以1.0mg/ml剂量组的抑制率最高为79.97％，中剂量(0.5mg/ml)组次之为67.25％；褐藻酸硫酸酯在高剂量(1.0mg/ml)呈现对于ERK蛋白表达的抑制作用，1.0mg/ml及中剂量(0.5mg/ml)的抑制率分别为88.24、88.98％，0.25mg/ml组抑制率为60.76％。

表2.褐藻酸硫酸酯对HPV的NF-κB和ERK蛋白表达的抑制作用

实施例3乳膏剂制备

实施例3-1

(1)油相制备：取白凡士林5wt％，硬脂酸2wt％，单硬脂酸甘油酯3wt％，硅油20wt％，维生素E 1wt％，月桂氮酮1wt％至于烧杯中，在搅拌、温度80℃条件下，将试剂混合均匀，制备得油相。

(2)水相制备：依此取乳化剂脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠2wt％，吐温80 1wt％，活性成分3wt％，甘油5wt％，加入水中，在搅拌、水温80℃条件下，将试剂混合均匀，制备得水相。并将适量无水乙醇溶解的0.1％的尼泊金甲酯加入所述水相中。

(3)乳膏剂制备：室温下，边缓慢搅拌边将水相加入到油相中，搅拌至冷却即可制备乳膏剂。若出现颗粒粗糙的现象时，可在乳膏剂温度降到30-40℃时用刮板碾细乳膏。

实施例3-2

(1)油相制备：取白凡士林5wt％，硬脂酸3wt％，液体石蜡20wt％，羊毛脂3wt％，单硬脂酸甘油酯10wt％，维生素E 0.1wt％，月桂氮酮1wt％至烧杯中，在搅拌、温度80℃条件下，将试剂混合均匀，制备得油相。

(2)水相制备：依此取乳化剂三乙醇胺0.25wt％，吐温80 0.2wt％，活性成分3wt％，甘油20wt％，加入水中，在搅拌、水温80℃条件下，将试剂混合均匀，制备得水相。并将适量无水乙醇溶解的0.1％的尼泊金甲酯加入所述水相中。

(3)乳膏剂制备：室温下，边缓慢搅拌边将水相加入到油相中，搅拌至冷却即可制备乳膏剂。若出现颗粒粗糙的现象时，可在乳膏剂温度降到30-40℃时用刮板碾细乳膏。

实施例3-3

(1)油相制备：取白凡士林5wt％，硬脂酸3wt％，大豆油20wt％，单硬脂酸甘油酯10wt％，维生素E 0.1wt％，月桂氮酮1wt％至烧杯中，在搅拌、温度80℃条件下，将试剂混合均匀，制备得油相。

(2)水相制备：依此取脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠2wt％，吐温80 1wt％，活性成分3wt％，甘油5wt％，加入水中，在搅拌、水温80℃条件下，将试剂混合均匀，制备得水相。并将适量无水乙醇溶解的0.1％的尼泊金甲酯加入所述水相中。

(3)乳膏剂制备：室温下，边缓慢搅拌边将水相加入到油相中，搅拌至冷却即可制备乳膏剂。若出现颗粒粗糙的现象时，可在乳膏剂温度降到30-40℃时用刮板碾细乳膏。

对比例1凝胶剂的制备

凝胶剂组分	重量份
		褐藻酸硫酸酯	5
卡波姆	2
		甘油	5
三乙醇胺	1
		PEG4000	1.6
尼泊金甲酯	0.1
		无水乙醇	1.6
水	83.7

凝胶剂制备过程：1.卡波姆于适量水中充分溶胀，加入甘油，三乙醇胺和溶于无水乙醇的尼泊金甲酯，混合均匀得空白基质；2.用适量水溶解褐藻酸硫酸酯和PEG4000后加入空白基质，用水定量至相应质量，混合均匀得凝胶剂。

测试例1：透皮效果评价

取小鼠背部皮肤，去除皮下脂肪组织和结缔组织，露出真皮层，蒸馏水洗净，置于生理盐水中浸泡30min后，取出用生理盐水漂洗至洗液澄明，用滤纸吸干，备用。将褐藻酸硫酸酯配成0.3mg/mL备用。

取褐藻酸硫酸酯0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mL于试管中，加入蒸馏水补至0.5mL，分别加入浓硫酸-硼砂3.0mL摇匀，100℃加热10min，取出，置冰水浴中冷却至室温，加入咔唑0.1mL摇匀，100℃加热10min，冷却后于562nm测光密度，并绘制标准曲线。

(1)乳膏剂透皮效果测试

取处理好的鼠皮裁剪成合适大小，置于扩散池中，角质层向上；分别取100mg的乳膏样品(实施例3-1)均匀涂于皮肤表面；向接受室中加入生理盐水6.5mL，置于37℃恒温水浴中，转速100r/min；于4h从接受室中精密吸取100μL溶液，计算累计渗透量Q。向所取的100μL溶液分别加入浓硫酸-硼砂3.0mL摇匀，100℃加热10min，取出，置冰水浴中冷却至室温，加入咔唑0.1mL摇匀，100℃加热10min，冷却后于562nm测光密度，以标准曲线计算累积渗透量Q，结果见表3所示。

表3乳膏剂中各成分累计渗透量Q

经测试，实施例3-2和实施例3-3中制备的乳膏剂也具有类似的透皮效果。

(2)凝胶剂透皮效果测试

取处理好的鼠皮裁剪成合适大小，置于扩散池中，角质层向上；分别取100mg的凝胶剂样品(对比例1)均匀涂于皮肤表面；向接受室中加入生理盐水6.5mL，置于37℃恒温水浴中，转速100r/min；于4h从接受室中精密吸取0.5mL溶液，计算累计渗透量Q。向所取的0.5mL溶液分别加入浓硫酸-硼砂3.0mL摇匀，100℃加热10min，取出，置冰水浴中冷却至室温，加入咔唑0.1mL摇匀，100℃加热10min，冷却后于562nm测光密度，以标准曲线计算累积渗透量Q，结果见表4所示。

表4凝胶剂中各成分累计渗透量Q

从表3中看出，4h时褐藻酸硫酸酯的累积渗透量为64％左右，而乳膏剂中的其他成分基本无检出，说明软膏基质有助于褐藻酸硫酸酯的渗透，且各个基质成分对褐藻酸硫酸酯的含量测定没有影响。从表4中看出，4h后凝胶剂中褐藻酸硫酸酯透过率几乎为零，绝大部分褐藻酸硫酸酯停留在皮肤表面，且含量测定实验证明凝胶剂中其他组分对含量测定无影响。

结果显示，本发明的乳膏剂大大改善了褐藻酸硫酸酯的透皮能力。

测试例2凝胶剂与乳膏剂在动物实验上活性比较

通过离体皮肤透过实验证明，凝胶剂中活性成分主要集中在皮肤表面，在本发明的乳膏剂中，褐藻酸硫酸酯可以透过皮肤，到达皮下。

动物实验中，分别将褐凝胶剂和本申请的乳膏剂涂于动物皮肤表面，2h后观察动物皮肤情况发现，凝胶剂在皮肤表面形成了一层薄膜，可在一定程度上阻止其他物质进入；而涂有乳膏剂的皮肤表面无明显乳膏残留，因此推测乳膏已透过皮肤。

测试例3：乳膏剂的体内活性评价

乳膏剂为实施例2-1中制备，其褐藻酸硫酸酯含量为3wt％。

将制备的HPV45假病毒以皮内注射的方式感染裸鼠，每只小鼠固定区域注射感染假病毒液50μL(2cm*2cm)。分为空白组和给药组，其中空白组只感染假病毒，给药组在小鼠感染病毒0.5h后，涂抹给药，分为低(5mg/只)、中(10mg/只)、高剂量组(20mg/只)，小鼠平均体重18-20g，8只/组，第3天采用小鼠成像仪检测小鼠皮肤内的荧光信号强度，观察乳膏剂的治疗效果。实验结果如图3及表5所示，病毒组的荧光强度为3.52*E4，乳膏剂组(即高剂量组)的荧光强度为1.52*E4，二者具有显著性差异(P<0.05)。

表5.褐藻酸硫酸酯对HPV在小鼠体内表达的抑制作用

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种乳膏剂，其特征在于，所述乳膏剂包括：

1～5重量份的褐藻酸硫酸酯；

0.5～2重量份的皮肤渗透促进剂；

10～30重量份的油相基质；

10～90重量份的水；

0.2～5重量份的乳化剂；和

5～30重量份的保湿剂。

2.如权利要求1所述的乳膏剂，其特征在于，所述乳膏剂为水包油型乳膏剂。

3.如权利要求1所述的乳膏剂，其特征在于，油相基质与水的质量比为1：(0.5～10)；较佳地1：(1～5)。

4.如权利要求1所述的乳膏剂，其特征在于，所述褐藻酸硫酸酯的分子量为100-500kDa。

5.如权利要求1所述的乳膏剂，其特征在于，

(i)所述皮肤渗透促进剂选自下组：月桂氮酮、薄荷醇、肉豆蔻酸异丙酯、N-三甲壳聚糖、油酸、丙二醇，或其组合；较佳地，所述皮肤渗透促进剂为月桂氮酮；

(ii)所述油相基质选自下组：硬脂酸、二甲基硅油、石蜡、羊毛脂、大豆油、十六醇、十八醇，或其组合；

(iii)所述的乳化剂选自下组：脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠、吐温80、三乙醇胺、蓖麻油聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚23、鲸蜡硬脂醇聚氧乙烯醚20，或其组合；和/或

(iv)所述保湿剂选自下组：甘油、白凡士林、透明质酸钠、聚乙二醇、丙二醇、山梨醇、羧甲基纤维素钠，或其组合。

6.一种如权利要求1所述的乳膏剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(i)按比例提供如权利要求1所述的乳膏剂的各组分；

(ii)分别制备油相和水相；和

(iii)混合所述油相和所述水相，得到所述乳膏剂。

7.一种产品，其特征在于，所述产品包括如权利要求1所述的乳膏剂。

8.一种如权利要求1所述的乳膏剂的用途，其特征在于，用于抑制ERK和/或NF-κB。

9.一种体外非治疗性抑制NF-κB活化和/或ERK蛋白表达的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

在褐藻酸硫酸酯的存在下，培养细胞，从而抑制所述细胞内NF-κB活化和/或ERK蛋白的表达。

10.抑制ERK蛋白表达的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

向需要的对象施用安全有效量的褐藻酸硫酸酯。

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