CN111479809B - 一种TGF-βRI抑制剂的晶型、盐型及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种TGF‑βRI抑制剂的晶型、盐型及其制备方法，还包括所述晶型和盐型在制备治疗癌症药物中的应用。

Description

一种TGF-βRI抑制剂的晶型、盐型及其制备方法
本申请主张如下优先权：
CN201711331447.7，申请日2017年12月13日。
技术领域
本发明涉及一种TGF-βRI抑制剂的晶型、盐型及其制备方法，还包括所述晶型和盐型在制备治疗癌症药物中的应用。
背景技术
转化生长因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)是一个多功能生长因子超家族，具有广泛的生物学活性，参与早期胚胎发育，软骨和骨的形成，包外基质的合成，炎症，间质纤维化，免疫和内分泌功能的调节，肿瘤的形成和发展。
TGF-β超家族由一类结构和功能相关的多肽生长因子组成，包括TGF-βs(即侠义的TGF-β)、活化素(axtivins)、抑制素(inhibins)、骨形成蛋白(BMPs)即苗勒抑制物(mullerian)等，TGF-β是该家族的重要成员之一。在哺乳动物中TGF-β主要以TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三种形式存在，它们位于不同的染色体上，其中TGF-β1在体细胞中所占比例最高(＞90％)，它活性最强、功能最多，分布也最广泛。新合成的TGF-β以无活性的前体形式出现，由信号肽、潜活相关多肽(LAP)和成熟的TGF-β三部分组成，经酶解后形成有活性的TGF-β，再与其受体结合发挥生物学效应。
TGF-β信号分子通过跨膜的受体复合物进行信号转导。TGF-β受体是存在于细胞表面的跨膜蛋白，分为I型受体(TGF-βRI)、II型受体(TGF-βR II)和III型受体(TGF-βRIII)，其中TGF-βR I又被称作活化素样受体5(activin receptor-like kinase 5，ALK5)。TGF-βRIII缺乏内在活性，主要与TGF-β的储存有关。TGF-βR I和TGF-βR II属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，II型受体能以较高的亲和力与TGF-β配体结合，并与I型受体形成异源受体复合物，将I型受体近膜的一段富含甘氨酸、丝氨酸残基的区域(GS结构域)磷酸化，启动细胞内信号联级反应。
Smads是细胞内重要的TGF-β信号转导和调节分子，可以将TGF-β信号直接由细胞膜转导如细胞核内，TGF-β/Smads信号通路在肿瘤的发生和发展中起到重要的作用。在TGF-β/Smads信号转导中，活化的TGF-β首先与细胞膜表面的TGF-βR II结合，形成异源二聚体复合物，TGF-βR I识别并结合该二元复合物。
TGF-βR II将TGF-βR I胞浆区GS结构域的丝氨酸/苏氨酸磷酸化，从而激活TGF-βRI；活化的TGF-βR I进一步磷酸化R-Smads(Smad2/Smad3)蛋白，后者再与Co-Smad(Smad4)结合成为异三聚体复合物，这一复合物进入细胞核内，与其他辅助活化因子(co-activator)和辅助抑制因子(co-inhibitor)协同作用，调节靶基因的转录。在TGF-β/Smads信号通路中任何一个环节发生改变，都会导致信号转导通路的异常。
目前的研究表明，在肿瘤细胞中，TGF-β能直接影响肿瘤的生长(TGF-β信号的非固有影响)，或者通过诱导上皮间质转化、阻断抗肿瘤免疫应答、增加肿瘤相关纤维化和强化血管再生间接地影响肿瘤生长(TGF-β的固有影响)。同时，TGF-β具有很强的纤维化诱导作用，它是与肿瘤相关的成纤维细胞的激活剂。这些成纤维细胞是胶原I型和其他纤维化因子的主要来源。成纤维细胞和其他纤维化因子的诱导产物可能继续培育出一个微环境，这个环境会减少免疫应答，增加抗药性和强化肿瘤血管生成另外，在个体发育和肿瘤生长过程中，TGF-β影响血管生再生。例如，TGF-βRI型缺陷的小鼠胚胎显示出了严重的血管发育缺陷，证明TGF-β信号通道是血管内皮及平滑肌细胞发育中的关键调节器。
2013年，FDA授予礼来公司的小分子TGF-βR I抑制剂LY2157299(WO 2002/094833)用以治疗神经胶质瘤和肝癌。LY2157299是一种在研的孤儿药，名称为Galunisertib。Galunisertib能抑制肿瘤细胞侵袭和转移，同时抑制肿瘤细胞向血管內渗。在治疗肝癌患者的2期临床实验中，经Galunisertib治疗，约23％的患者血清中甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)水平下降20％以上。这些患者与无AFP应答反应的患者相比，肿瘤进展较慢且生存期更久，而且在这些患者体内也发现上皮细胞钙黏蛋白表达增强，这说明Galunisertib可以通过抑制TGF-β信号通路来调节ENT，从而抑制肝癌进展。
Galunisertib(LY2157299)的结构如式(III)所示：
Figure GPA0000289954050000031
除了治疗效力外，药物研发者试图提供具有作为药物的性质(所述性质涉及加工、制造、储存稳定性等)的活性分子的适合形式。因此，发现具有所需性质的形式对药物研发至关重要。
发明内容
本发明提供式(I)化合物的晶型A，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.553°±0.2°、11.894°±0.2°、15.370°±0.2°、17.502°±0.2°、19.785°±0.2°、20.283°±0.2°、24.072°±0.2°、24.664°±0.2°。
Figure GPA0000289954050000032
在本发明的一些方案中，上述的晶型A，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.553°±0.2°、11.894°±0.2°、15.370°±0.2°、17.502°±0.2°、19.785°±0.2°、20.283°±0.2°、24.072°±0.2°、24.664°±0.2°。
在本发明的一些方案中，上述的晶型A，其X射线粉末衍射图谱如图1所示。
在本发明的一些方案中，上述晶型A的XRPD图谱解析数据如表1所示。
表1
Figure GPA0000289954050000033
Figure GPA0000289954050000041
在本发明的一些方案中，上述的晶型A也可以用DSC进行表征，起始温度为266.07℃，峰值温度为271.79℃。
在本发明的一些方案中，上述的晶型A，其差示扫描量热曲线在271.79℃±3℃处具有吸热峰。
在本发明的一些方案中，上述的晶型A，其差示扫描量热曲线图谱如图2所示。
在本发明的一些方案中，上述的晶型A也可以用TGA进行表征，TGA图谱显示加热至110.82℃时，重量减少了0.1075％，加热至229.08℃时，重量又减少了0.9974％，在229.08℃以后开始出现较大的重量损失。
在本发明的一些方案中，上述的晶型A，其热重分析曲线在110.82℃±3℃时失重达0.1075％，在229.08℃±3℃时失重达1.105％。
在本发明的一些方案中，上述的晶型A，其热重分析曲线图谱如图3所示。
本发明还提供式(II)化合物。
Figure GPA0000289954050000042
本发明还提供式(II)化合物的晶型B，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.349±0.2°，19.012±0.2°，20.235±0.2°，23.370±0.2°。
在本发明的一些方案中，上述的晶型B，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.349±0.2°，15.066±0.2°，16.782±0.2°，19.012±0.2°，20.235±0.2°，22.027±0.2°，23.370±0.2°，27.253±0.2°。
在本发明的一些方案中，上述的晶型B，其X射线粉末衍射图谱如图4所示。
在本发明的一些方案中，上述晶型B的XRPD图谱解析数据如表2所示。
表2
Figure GPA0000289954050000051
本发明的一些方案中，上述晶型B也可以用DSC进行表征，其在234.43℃±3℃有一个吸热峰。
在本发明的一些方案中，上述的晶型B，其差示扫描量热曲线在234.43℃±3℃处具有吸热峰。
在本发明的一些方案中，上述的晶型B，其差示扫描量热曲线图谱如图5所示。
本发明的一些方案中，上述晶型B也可以用TGA进行表征，TGA图谱显示加热至120℃时，重量减少了0.3043％，加热至238.46℃时，重量又减少1.295％。
在本发明的一些方案中，上述的晶型B，其热重分析曲线在120℃±3℃时失重达0.3043％，在238.46℃±3℃时失重达1.599％。
在本发明的一些方案中，上述的晶型B，其热重分析曲线图谱如图6所示。
本发明还提供式(I)所示化合物的盐酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐。
本发明的一些方案中，上述盐酸盐为
Figure GPA0000289954050000052
本发明的一些方案中，上述硫酸盐为
Figure GPA0000289954050000061
本发明的一些方案中，上述甲磺酸盐为
Figure GPA0000289954050000062
本发明还提供上述的化合物或晶型，其在制备治疗癌症药物中的应用。
技术效果
本发明提供的盐型及晶型的制备工艺简单，且晶型在高温、高湿条件下稳定，略有引湿性，盐型在纯水及生物媒介中的溶解性较好，具有良好的成药前景。
定义和说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在含有下列含义。一个特定的短语或术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文出现商品名时，旨在指代其对应的商品或其活性成分。
本发明的中间体化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
本发明具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本发明的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本发明的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。
下面会通过实施例具体描述本发明，这些实施例并不意味着对本发明的任何限制。
本发明所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。
本发明采用下述缩略词：rt代表室温；aq代表水溶液；eq代表当量；DCM代表二氯甲烷；THF代表四氢呋喃；DMSO代表二甲基亚砜；DMF代表N，N-二甲基甲酰胺；EtOAc代表乙酸乙酯；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；dioxane代表二氧六环；HOAc代表乙酸；DIPEA代表二异丙基乙胺；TEA或Et3N代表三乙胺；Na2CO3代表碳酸钠；K2CO3代表碳酸钾；NaHCO3代表碳酸氢钠；Na2SO4代表硫酸钠；NaOH代表氢氧化钠；LiHMDS代表双(三甲基硅基)胺基锂；Pd(dppf)Cl2代表[1，1′-双(二苯基磷)二茂铁]二氯化钯；Xphos代表2-二环己基磷-2′，4′，6′-三异丙基联苯；Xphos-PD-G2代表氯(2-二环己基瞵基-2′，4′，6′-三异丙基-1，1′-联苯基)[2-(2′-氨基-1，1′-联苯)]钯(II)；NBS代表N-溴代琥珀酰亚；HCl代表盐酸；H2SO4代表硫酸；℃代表摄氏度。
化合物经手工或者
Figure GPA0000289954050000071
软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。
仪器及分析方法
本发明中，X-射线粉末衍射光谱(X-ray powder diffractometer，XRPD)采用下述方法测定：
仪器型号：布鲁克D8 advance X-射线衍射仪；
测试方法：大约10～20mg样品用于XRPD检测。
详细的XRPD参数如下：
光管：Cu，kα，
Figure GPA0000289954050000072
光管电压：40kV，光管电流：40mA；
发散狭缝：0.60mm；
探测器狭缝：10.50mm；
防散射狭缝：7.10mm；
扫描范围：3-40deg或4-40deg；
步径：0.02deg；
步长：0.12秒；
样品盘转速：15rpm。
本发明中，差示扫描量热分析(Differential Scanning Calorimeter，DSC)采用下述方法测定：
仪器型号：TA Q2000差示扫描量热仪。
测试方法：取约1mg样品置于DSC铝锅内进行测试，在50mL/min氮气条件下，以10℃/min的升温速率，加热样品从30℃(室温)到300℃(或350℃)。
本发明中，热重分析(Thermal Gravimetric Analyzer，TGA)采用下述方法测定：
仪器型号：TA Q5000热重分析仪。
测试方法：取样品(2～5mg)置于TGA铂金锅内进行测试，在25mL/min N2条件下，以10℃/min的升温速率，加热样品从室温到300℃或失重20％。
本发明中，动态蒸汽吸附分析(Dynamic Vapor Sorption，DVS)采用下述方法测定：
仪器型号：SMS DVS Advantage动态蒸汽吸附仪
测试条件：取样品(10～15mg)置于DVS样品盘内进行测试。
详细的DVS参数如下：
温度：25℃
平衡：dm/dt＝0.01％/min(最短：10min，最长：180min)
干燥：0％RH下干燥120min
RH(％)测试梯级：10％
RH(％)测试梯级范围：0％-90％-0％
引湿性评价分类如下：
引湿性分类 引湿增重*
潮解 吸收足量水分形成液体
极具引湿性 ΔW％≥15％
有引湿性 15％＞ΔW％≥2％
略有引湿性 2％＞ΔW％≥0.2％
无或几乎无引湿性 ΔW％＜0.2％
*在25±1℃和80±2％RH下的引湿增重(ΔW％)
附图说明
图1为式(I)化合物晶型A的XRPD谱图。
图2为式(I)化合物晶型A的DSC谱图。
图3为式(I)化合物晶型A的TGA谱图。
图4为式(II)化合物晶型B的XRPD谱图。
图5为式(II)化合物晶型B的DSC谱图。
图6为式(II)化合物晶型B的TGA谱图。
图7为式(II)化合物晶型B的DVS谱图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例来做进一步的说明，但具体的实施方式并不是对本发明的内容所做的限制。
实施例1式(I)化合物的制备
Figure GPA0000289954050000081
中间体1-6的制备：
Figure GPA0000289954050000091
步骤A：将乙酸乙酯(291.41毫升，2.98摩尔)溶于甲苯(750.00毫升)中，然后在室温下分批加入乙醇钠(135.06克，1.98摩尔)，反应混合物在室温下搅拌1小时。将1-1(150.00克，992.33毫摩尔)在25℃下加入到上述反应液中，然后加热至95℃并搅拌15小时。反应混合物冷却到约30℃，用醋酸调节pH值至7，加水(500毫升)稀释，然后用乙酸乙酯(500毫升)萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用硅胶柱纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯v/v＝50/1)，得到1-2。
步骤B：将1-2(120.00克，579.07毫摩尔)溶解于吡啶(300毫升)中，然后加入1-氨基吡咯烷-2-酮的对甲基苯磺酸盐(172.01克，631.66毫摩尔)。反应混合物在25℃下搅拌16小时，然后减压浓缩除去溶剂。剩余物加水(300毫升)稀释，然后用乙酸乙酯(300毫升×2)萃取。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩得到1-3。
步骤C：将1-3(155.00克，535.72毫摩尔)溶解于甲苯中，然后加入乙醇钠(72.91克，1.07摩尔)。反应混合物加热至100℃并搅拌16小时，随后冷却到室温。缓慢加水(1.5升)稀释，用浓盐酸调节pH值至4，并用二氯甲烷/异丙醇(v/v＝10/1，1升×7)萃取。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用石油醚/乙酸乙酯(v/v＝10/1，200毫升)打浆，过滤并收集固体。该固体减压干燥后得到1-4。
步骤D：将1-4(45.00克，184.99毫摩尔)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(650.00毫升)中，然后加入NBS(49.09克，258.99毫摩尔)。反应混合物在30～40℃下搅拌60小时，然后用水(600毫升)稀释，并用二氯甲烷/异丙醇(v/v＝10/1，500毫升×3)萃取。合并的有机相用氢氧化钠(0.5摩尔/升，800毫升)洗涤一次，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。得到的固体用油醚/乙酸乙酯(v/v＝10/1，200毫升)打浆，过滤并收集固体。该固体减压干燥后得到1-5。
步骤E：将1-5(1.00克，3.60毫摩尔)和硼酸三异丙酯(1.79克，9.54毫摩尔)溶解于四氢呋喃(20.00毫升)中。反应混合物冷却至零下70℃，然后逐滴加入正丁基锂(2.5M，3.74毫升)。滴加完成后，反应混合物在25℃下搅拌1小时后，用盐酸水溶液(0.5摩尔/升)调节pH值至7。然后减压浓缩除去四氢呋喃，再冷却到15℃。将该混合物过滤，滤饼用油醚/乙酸乙酯(v/v＝10/1，5.5毫升)打浆，过滤并收集固体，该固体减压干燥后得到1-6。
式(I)化合物的制备：
Figure GPA0000289954050000101
步骤A：将1-7(16.00克，65.30毫摩尔)溶解于四氢呋喃(800.00毫升)中，冷却至零下60～70℃后，滴加六甲基二硅基氨基锂(1摩尔/升，130.60毫升，65.30毫摩尔)。反应混合物在零下60～70℃下搅拌15分钟，加入N，N-二甲基甲酰胺(14.32克，195.90毫摩尔，15.07毫升)。然后在零下60～70℃下继续搅拌15分钟，随后用饱和氯化铵水溶液(500毫升)淬灭。反应混合物升至室温后用乙酸乙酯(500毫升×2)萃取。合并的有机相用盐水(500毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用硅胶柱纯化(洗脱剂：二氯甲烷/乙酸乙酯v/v＝10/1)，得到1-8。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ10.46(s，1H)，8.62(s，1H)，8.16(d，J＝9.3Hz，1H)，7.88(d，J＝9.3Hz，1H)。
步骤B：在装有温度计和氮气球的500毫升三口瓶中，加入2-二乙氧基磷酰基乙睛(3.83克，21.61毫摩尔，3.48毫升)和四氢呋喃(80毫升)。将混合物冷却至0℃，然后分批加入叔丁醇钾(2.42克，21.61毫摩尔)。反应混合物在0℃下搅拌15分钟后通过滴液漏斗滴加至另一悬浮液(将1-8分散在四氢呋喃(120毫升)并冷却至0℃)中。反应混合物在0℃下搅拌15分钟，然后倒入水(300毫升)中淬灭，并用乙酸乙酯(200毫升)和二氯甲烷(200毫升×2)萃取。合并的有机相用盐水(300毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用硅胶柱纯化(洗脱机：二氯甲烷/乙酸乙酯v/v＝200/1至10/1)，得到1-9。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.42(s，1H)，8.03(d，J＝9.3Hz，1H)，7.98-7.91(m，1H)，7.85-7.78(m，1H)，7.60(d，J＝9.2Hz，1H)。
步骤C：将1-9(4.50克，15.20毫摩尔)，1-6(4.43克，18.24毫摩尔)，碳酸钠(4.83克，45.60毫摩尔)，[1，1’-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(556.07毫克，759.96微摩尔)，2-双环己基瞵-2’，6’-二甲氧基联苯(311.98毫克，759.96微摩尔)和[2-(2-氨基苯基)苯基]-氯-钯-环己基-[2-(2，6-二甲氧基苯基)苯基]膦(547.64毫克，759.96微摩尔)加入到二氧六环(100毫升)和水(20毫升)的混合溶剂中。用氮气置换3次然后加热至90～100℃并搅拌2小时。将反应混合物倒入水(200毫升)中淬灭，并用二氯甲烷(200毫升×2)萃取。合并的有机相用盐水(200毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物用硅胶柱纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇，v/v＝30/1)，得到粗品，粗品在石油醚/乙酸乙酯(v/v＝5/1)的混合溶剂中搅拌12小时，过滤并收集固体，该固体经减压浓缩干燥得到1-10。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.49(s，1H)，7.82-7.74(m，2H)，7.59-7.46(m，4H)，6.99(dd，J＝2.6，6.1Hz，1H)，4.39(d，J＝6.3Hz，2H)，2.90-2.70(m，4H)，2.20(s，3H)。
步骤D：将1-10(5.37克，14.62毫摩尔)溶解于二氯甲烷(20毫升)，二甲基亚砜(70毫升)和水(20毫升)的混合溶剂中，然后分别加入双氧水(8.29克73.10毫摩尔，7.02毫升，30％)和氢氧化钠(2摩尔/升，14.62毫升)。混合物在15～20℃下搅拌12小时。将混合物倒入水(200毫升)中淬灭，并用二氯甲烷/异丙醇(3/1)的混合溶剂(200毫升×1)萃取。有机相用饱和硫代硫酸钠水溶液(200毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。剩余物经制备高效液相色谱法纯化(柱子：Phenomenex Gemini C18 250×50毫米×10微米；流动相：[水(0.05％氨水v/v)-乙腈]；梯度：5％-32％，33；80％分钟)得到式(I)化合物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.45(s，1H)，8.09(d，J＝15.6Hz，1H)，7.85(d，J＝15.6Hz，1H)，7.69(d，J＝9.2Hz，1H)，7.55-7.45(m，2H)，7.37(d，J＝7.8Hz，1H)，6.99(d，J＝7.7Hz，1H)，5.93-5.65(m，2H)，4.35(br.s.，2H)，2.99-2.64(m，4H)，2.33(s，3H)。
实施例2式(II)化合物的制备
Figure GPA0000289954050000111
将115毫克式(I)化合物加入到8毫升玻璃瓶中，加入4毫升的四氢呋喃，超声助溶，成混悬液；然后缓慢加入1.05当量的一水合对甲苯磺酸。将上述悬浊样品置于磁力搅拌器上(40℃)进行搅拌16小时。将样品液离心，取出固体置于35℃真空干燥箱中干燥16小时得到式(II)化合物。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.61(s，1H)，8.14(t，J＝8.0Hz，1H)，8.05(d，J＝15.6Hz，1H)，7.90(d，J＝8.8Hz，1H)，7.70(dd，J＝8.4，15.6Hz，4H)，7.54(d，J＝15.6Hz，1H)，7.39(d，J＝8.0Hz，1H)，7.20(d，J＝7.6Hz，2H)，4.42(m，2H)，3.05-2.87(m，2H)，2.82(s，3H)，2.81-2.74(m，2H)，2.35(s，3H)。
实施例3式(IV)化合物的制备
Figure GPA0000289954050000121
将115毫克式(I)化合物加入到8毫升玻璃瓶中，加入4毫升的四氢呋喃，超声助溶，成混悬液；然后缓慢加入1.05当量的盐酸。将上述悬浊样品置于磁力搅拌器上(40℃)进行搅拌16小时。将样品液离心，取出固体置于35℃真空干燥箱中干燥16小时。将所得固体加入适量丙酮配成混悬液40℃搅拌后，离心弃去上清液，室温条件下用油泵将固体样品抽干得到式(IV)化合物。
实施例4式(V)化合物的制备
Figure GPA0000289954050000122
将115毫克式(I)化合物加入到8毫升玻璃瓶中，加入4毫升的四氢呋喃，超声助溶，成混悬液；然后缓慢加入1.05当量的硫酸。将上述悬浊样品置于磁力搅拌器上(40℃)进行搅拌16小时。将样品液离心，取出固体置于35℃真空干燥箱中干燥16小时得到式(V)化合物。
实施例5式(VI)化合物的制备
Figure GPA0000289954050000123
将115毫克式(I)化合物加入到8毫升玻璃瓶中，加入4毫升的四氢呋喃，超声助溶，成混悬液；然后缓慢加入1.05当量的甲磺酸。将上述悬浊样品置于磁力搅拌器上(40℃)进行搅拌16小时。将样品液离心，取出固体置于35℃真空干燥箱中干燥16小时得到式(VI)化合物。
实施例6式(I)化合物晶型A的制备
取式(I)化合物10克置于乙醇(80毫升)和水(40毫升)的混合溶剂中，加热至70～75℃并搅拌至澄清后趁热过滤，滤液减压蒸馏至剩余溶液体积约50毫升，随后降温静置析晶，过滤，所得滤饼减压干燥，得到的固体即为式(I)化合物晶型A。
实施例7式(II)化合物晶型B的制备
称取192毫克式(I)化合物加入到玻璃瓶中。加入10毫升的四氢呋喃：醋酸(v/v＝9/1)混合溶剂，超声助溶30分钟后，样品溶解为澄清溶液。置于磁力搅拌器上(40℃)进行搅拌。缓慢加入1.05当量一水合对甲苯磺酸后，将样品搅拌过夜。自然冷却至室温后，离心弃去上清液，加入10毫升四氢呋喃搅拌半个小时，再离心弃去上清液，同样的方法再重复两遍。所得固体置于40℃真空干燥箱中干燥1小时，碾碎后继续置于30℃真空干燥箱中干燥16小时，得到式(II)化合物晶型B。
实施例8 TGFβ-RI体外受体结合活性筛选方案
1.实验方法：
1)待测化合物：采用10个梯度点每个梯度稀释三倍的方法检测IC50，起始浓度为5μM。
2)反应体系中含有10μM的ATP。
3)样品最高浓度条件下酶活百分比(与溶剂组相比)低于65％时进行曲线拟合计算IC50值。
2.实验结果见下表：
样品 TGF-βRI IC<sub>50</sub>(nM)
LY2157299 208
式(I)化合物 40
结论：在上述相同实验条件下，式(I)化合物的TGF-βRI的抑制活性优于LY2157299。
实施例9式(I)化合物不同盐型在生物媒介中的溶解度研究
分别移取1毫升生物媒介溶液(FaSSIF，FeSSIF和SGF)加入到1.5毫升的玻璃瓶中，然后以2毫克的梯度加入到上述溶液中，直至呈现饱和状态或达到10毫克。平行配置2份后，在37℃下振荡。分别在4小时和24小时后取样。将所取样品快速离心，上清液测定其pH值并用稀释剂稀释合适的倍数，然后用HPLC测定其浓度。检测结果如下表3所示。
表3式(I)化合物不同盐型在生物媒介中的溶解度
Figure GPA0000289954050000131
Figure GPA0000289954050000141
【注】：SGF代表模拟胃液；FaSSIF代表空腹状态下模拟肠液；FeSSIF代表饱腹状态下模拟肠液。
结论：从上表结果可知，相对于式(I)化合物，其式(II)化合物化合物在生物媒介中的溶解度显著提高。
实施例10式(I)和式(II)化合物在水中的溶解度研究
称取约2毫克样品加入到1.5毫升的玻璃小瓶中，用移液枪加入一定体积纯水，适当超声溶解。在室温下进行，测试溶解情况，其近似溶解度结果如下表：
样品 纯水加入量(μL) 近似溶解度S(mg/mL)
式(I)化合物 ＞1000 S＜1.9
式(II)化合物 20～40 49.0＜S＜98.0
结论：式(II)化合物的在纯水中的近似溶解度相对于式(I)化合物显著提高。
实施例11式(II)化合物晶型B的吸湿性研究
1、实验材料：SMS DVS Advantage动态蒸汽吸附仪
2、实验方法：取式(II)化合物B晶型适量置于DVS样品盘内进行DVS分析。
3、实验结果：式(II)化合物B晶型的DVS谱图如图7所示，ΔW＝0.673％。
结论：式(II)化合物B晶型在在25℃/80％RH下引湿增重0.673％，略有引湿性。
实施例12式(I)化合物晶型A的高温稳定性试验
依据《原料药与药物制剂稳定性试验指导原则》(中国药典2010版附录XIXC)，考察式(I)化合物的晶型A在加速试验高温(60℃)条件下的稳定性。
将式(I)化合物的晶型A置于开口洁净容器中，60℃下放置，分别于第30、60和90天取样检测，检测结果与第0天的初始检测结果进行比较，试验结果见下表4所示。
表4式(I)化合物的结晶高温稳定性试验
取样时间(天) 外观 含量(％) 总杂质(％) 晶型研究
0 类白色粉末 99.0 0.57 晶型A
30 类白色粉末 97.5 0.56 晶型A
60 类白色粉末 100.0 0.58 晶型A
90 类白色粉末 99.9 0.55 晶型A
结论：高温稳定性试验显示，式(I)化合物的晶型A在高温条件下有着良好的稳定性。
实施例13式(I)化合物晶型A的高湿稳定性试验
依据《原料药与药物制剂稳定性试验指导原则》(中国药典2010版附录XIXC)，考察式(I)化合物的晶型A在加速试验高湿(40℃/75％湿度(敞口))条件下的稳定性。
将式(I)化合物的晶型A开口置于恒温恒湿容器中进行加速试验，条件为40℃/75％湿度(敞口)，于第30、60和90天取样检测，检测结果与第0天的初始检测结果进行比较，试验结果见下表5所示：
表5式(I)化合物的结晶高湿稳定性试验
Figure GPA0000289954050000151
结论：高湿稳定性试验显示，式(I)化合物的晶型A在高湿条件下有着良好的稳定性。

Claims (19)

1.式(I)化合物的晶型A，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：11.894°±0.2°、17.502°±0.2°、19.785°±0.2°、24.072°±0.2°、24.664°±0.2°
Figure FDA0003174042130000011
2.如权利要求1所述的晶型A，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.553°±0.2°、11.894°±0.2°、15.370°±0.2°、17.502°±0.2°、19.785°±0.2°、20.283°±0.2°、24.072°±0.2°、24.664°±0.2°。
3.根据权利要求2所述的晶型A，其X射线粉末衍射图谱如图1所示。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的晶型A，其差示扫描量热曲线在271.79℃±3℃处具有吸热峰。
5.根据权利要求4所述的晶型A，其差示扫描量热曲线图谱如图2所示。
6.根据权利要求1～3任意一项所述的晶型A，其热重分析曲线在110.82℃±3℃时失重达0.1075％，在229.08℃±3℃时失重达1.105％。
7.根据权利要求6所述的晶型A，其热重分析曲线图谱如图3所示。
8.式(II)化合物
Figure FDA0003174042130000012
9.如权利要求8所述的式(II)化合物的晶型B，其特征在于，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.349±0.2°，19.012±0.2°，20.235±0.2°，23.370±0.2°。
10.如权利要求9所述的晶型B，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.349±0.2°，15.066±0.2°，16.782±0.2°，19.012±0.2°，20.235±0.2°，22.027±0.2°，23.370±0.2°，27.253±0.2°。
11.根据权利要求10所述的晶型B，其X射线粉末衍射图谱如图4所示。
12.根据权利要求9～11任意一项所述的晶型B，其差示扫描量热曲线在234.43℃±3℃处具有吸热峰。
13.根据权利要求12所述的晶型B，其差示扫描量热曲线图谱如图5所示。
14.根据权利要求9～11任意一项所述的晶型B，其热重分析曲线在120℃±3℃时失重达0.3043％，在238.46℃±3℃时失重达1.599％。
15.根据权利要求14所述的晶型B，其热重分析曲线图谱如图6所示。
16.式(IV)化合物
Figure FDA0003174042130000021
17.式(V)化合物
Figure FDA0003174042130000022
18.式(VI)化合物
Figure FDA0003174042130000023
19.根据权利要求1～18任意一项所述的化合物或晶型在制备治疗癌症药物中的应用。
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