CN112912380B - 一种mek抑制剂的晶型、无定形及其应用 - Google Patents
一种mek抑制剂的晶型、无定形及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
公开了一种作为MEK抑制剂的式(Ⅰ)化合物的多晶型、无定形及其制备方法和应用。
Description
本申请主张如下优先权：
CN201811573858.1，申请日：2018.12.21。
技术领域
本发明涉及到一种作为MEK抑制剂的式(I)化合物的多晶型、无定形及其制备方法和应用。
背景技术
MAPK通路存在于细胞增殖，分化，凋亡与应激反应等一系列细胞进程中。目前已知的MAPK通路有四条：ERK1/2，JNK，p38与ERK5。其中最重要且最广为人知的MAPK通路之一，是Ras/Raf激酶通路。该通路首先由细胞外生长因子(即PDGF或EGF等)与跨膜受体(即PDGFR或EGFR或ErbB2等)结合，活化受体，而活化的受体通过鸟苷酸交换因子(如SOS)使膜内的Ras与GTP结合并活化；被激活的Ras进一步间接磷酸化并活化Raf(此通路中的MAPKKK)；然后，活化的Raf在MEK1/2(此通路中的MAPKK)的两个丝氨酸残基上进行磷酸化(MEK1对应S218与S222；MEK2对应S222与S226)(Ahn et al.，Methods in Enzymology，2001，332，417-431)。磷酸化的ERK二聚后移向细胞核内并积聚(Khokhlatchev et al.，Cell，1998，93，605-615)。在细胞核内的ERK涉及到许多细胞功能，包括但不限于核转运，信号转导，DNA修复，核小体组装与迁移以及mRNA加工与翻译(Ahn et al.，Molecular Cell，2000，6，1343-1354)。
RAF-MEK-ERK通路能传导由生长因子与致癌因子发出的增殖与抗凋亡信号，从而促进细胞的生长，发展与转移；若通路涉及的基因发生突变或生长因子、下游信号蛋白或蛋白激酶过表达，将会导致细胞增殖失控并最终导致肿瘤形成。举例来说，癌细胞突变引起生长因子过表达，从而导致其内部的MAPK通路的持续激活；或因突变导致激活的Ras复合物的无法去活化，同样也会造成MAPK通路的持续激活；近来，人们已从超过60％的黑素瘤中识别出bRaf变异(Davies，H.et al.，Nature，2002，417，949-954)。这些bRaf变异导致了自发活化的MAPK级联的产生。人们在胰腺癌，结肠癌，肺癌，卵巢癌与肾癌等原发性肿瘤样本与细胞系的研究中，也观察到了MAPK通路的自发性或者过度活化现象(Hoshino，R.et al.，Oncogene，1999，18，813-822)。因此，由于基因突变引起的MAPK通路过度活化与癌症之间有很强的相关性。
因为MAPK通路处于细胞增殖与分化中的中枢位置，抑制该通路将有利于治疗多种过度增殖疾病，而该通路中处于Ras与Raf下游的MEK则成为了该通路中的关键角色。此外，目前已知可由MEK磷酸化并激活的底物仅有MAPK，即ERK1与ERK2，这种严格的选择性及其双功能激酶独特能力，使其成为了很具吸引力的药物靶标，具有潜在而广泛的治疗应用，比如，恶性与良性过度增殖疾病，免疫调节与炎症。
针对MAPK信号通路，目前已有多个Raf和MEK抑制剂处于临床和上市阶段。如05年12月FDA批准上市的sorafenib(Bay 43-9006)，是非特异性的丝/苏氨酸和酪氨酸激酶抑制剂，其作用靶点包含Raf，MEK，VEGFR2/3，Flt-3，PDGFR，c-Kit等。B-Raf特异性抑制剂如dabrafenib(GSK21 18436)和vemurafenib(PLX4032)均有良好的临床效果，但持续时间较短，且临床研究发现，B-Raf抑制剂的长期治疗会导致患者产生获得性耐药性。因此，临床上常将MEK抑制剂与B-Raf抑制剂联用。特异性抑制MEK1/2抑制剂Trametinib(GSK-1 120212)已于2013年5月经FDA批准上市，并于2014年1月获批与dabrafenib联合治疗晚期黑色素瘤；特异性抑制MEK1/2抑制剂cobimetinib于2015年被FDA批准用于和vemurafenib联合用药，用于黑色素瘤治疗。Binimetinib在2016年，向FDA申请注册用于N-RAS突变的的黑色素瘤治疗。此外，还有Selumetinib，refametinibd等MEK1/2抑制剂处于临床阶段。
目前公开了一系列的MEK抑制剂的专利申请，其中包括WO2007/096259，WO2010/003022和WO2012/162293，WO2014/169843，WO2015/058589等。
发明内容
本发明提供了式(I)化合物的A晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：12.31±0.2°、15.45±0.2°和18.96±0.2°。
本发明的一些方案中，上述A晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：12.31±0.2°、13.08±0.2°、15.45±0.2°、18.96±0.2°、21.63±0.2°、24.47±0.2°、27.17±0.2°和28.73±0.2°。
本发明的一些方案中，上述A晶型的XRPD图谱如图1所示。
本发明的一些方案中，上述A晶型的的XRPD图谱解析数据如表1所示：
表1：A晶型的XRPD图谱解析数据
本发明的一些方案中，上述A晶型的差示扫描量热曲线(DSC)在188.10±3℃处具有吸热峰的起始点。
本发明的一些方案中，上述A晶型的DSC图谱如图2所示。
本发明的一些方案中，上述A晶型的热重分析曲线(TGA)在197.79±3℃时失重达0.3606％。
本发明的一些方案中，上述A晶型的TGA图谱如图3所示。
本发明还提供了式(I)化合物的B晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：6.25±0.2°、12.43±0.2°和21.89±0.2°。
本发明的一些方案中，上述B晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：6.25±0.2°、12.43±0.2°、18.74±0.2°、21.89±0.2°、23.46±0.2°、24.99±0.2°、29.75±0.2°和31.44±0.2°。
本发明的一些方案中，上述B晶型的XRPD图谱如图4所示。
本发明的一些方案中，上述B晶型的的XRPD图谱解析数据如表2所示：
表2：B晶型的XRPD图谱解析数据
本发明的一些方案中，上述B晶型的差示扫描量热曲线(DSC)在171.21±3℃处具有吸热峰的起始点。
本发明的一些方案中，上述B晶型的DSC图谱如图5所示。
本发明的一些方案中，上述B晶型的热重分析曲线(TGA)在180.52±3℃时失重达0.4681％。
本发明的一些方案中，上述B晶型的TGA图谱如图6所示。
本发明还提供了式(I)化合物的C晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：12.55±0.2°、18.79±0.2°和25.10±0.2°。
本发明的一些方案中，上述C晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：6.33±0.2°、12.55±0.2°、15.22±0.2°、17.68±0.2°、18.79±0.2°、20.07±0.2°、25.10±0.2°和26.76±0.2°。
本发明的一些方案中，上述C晶型的XRPD图谱如图7所示。
本发明的一些方案中，上述C晶型的的XRPD图谱解析数据如表3所示：
表3：C晶型的XRPD图谱解析数据
本发明的一些方案中，上述C晶型的差示扫描量热曲线(DSC)在168.06±3℃处具有一个吸热峰的起始点。
本发明的一些方案中，上述C晶型的DSC图谱如图8所示。
本发明的一些方案中，上述C晶型的热重分析曲线(TGA)在176.32±3℃时失重达0.7482％。
本发明的一些方案中，上述C晶型的TGA图谱如图9所示。
本发明还提供了式(I)化合物的D晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：18.94±0.2°、24.83±0.2°和26.15±0.2°。
本发明的一些方案中，上述D晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：12.45±0.2°、14.86±0.2°、17.13±0.2°、18.41±0.2°、18.94±0.2°、22.83±0.2°、24.83±0.2°和26.15±0.2°。
本发明的一些方案中，上述D晶型的XRPD图谱如图10所示。
本发明的一些方案中，上述D晶型的的XRPD图谱解析数据如表4所示：
表4：D晶型的XRPD图谱解析数据
本发明的一些方案中，上述D晶型的差示扫描量热曲线(DSC)在163.80±3℃处具有一个吸热峰的起始点。
本发明的一些方案中，上述D晶型的DSC图谱如图11所示。
本发明的一些方案中，上述D晶型的热重分析曲线(TGA)在121.34±3℃时失重达0.9987％；在174.58℃时失重达1.1087％。
本发明的一些方案中，上述D晶型的TGA图谱如图12所示。
本发明还提供了式(I)化合物的E晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：22.81±0.2°、24.93±0.2°和25.82±0.2°。
本发明的一些方案中，上述E晶型的X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：12.41±0.2°、15.02±0.2°、17.48±0.2°、18.69±0.2°、22.81±0.2°、23.61±0.2°、24.93±0.2°和25.82±0.2°。
本发明的一些方案中，上述E晶型的XRPD图谱如图13所示。
本发明的一些方案中，上述E晶型的的XRPD图谱解析数据如表5所示：
表5：E晶型的XRPD图谱解析数据
本发明的一些方案中，上述E晶型的差示扫描量热曲线(DSC)在167.83±3℃处具有一个吸热峰的起始点。
本发明的一些方案中，上述E晶型的DSC图谱如图14所示。
本发明的一些方案中，上述E晶型的热重分析曲线(TGA)在99.83±3℃时失重达0.6462％；在176.84±3℃时失重达0.73118％。
本发明的一些方案中，上述E晶型的TGA图谱如图15所示。
本发明还提供了式(I)化合物的无定形，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱如图16所示。
本发明还提供式(I)化合物B晶型的制备方法，包括：
(a)将式(I)化合物加入醇类溶剂中使其成悬浊液；
(b)悬浊液25～60℃下搅拌8～120小时；
(c)离心后干燥8～16小时；
本发明的一些方案中，上述醇类溶剂包含乙醇。
本发明还提供式(I)化合物无定形的制备方法，包括：
(a)将式(I)化合物加入溶剂或者混合溶剂中溶解；
(b)将溶液旋干，或者喷雾干燥，或者冻干等。
其中，所述溶剂选自丙酮、四氢呋喃和乙腈。
本发明还提供了上述A晶型、B晶型、C晶型、D晶型或E晶型在制备治疗MEK相关病症的药物上的应用。
本发明还提供了上述无定形在制备治疗MEK相关病症的药物上的应用。
技术效果
本发明中的无定形及各晶型，性质稳定，吸湿性弱，适宜长期保存，适于成药。式(I)化合物无定形各个剂量组均可有效抑制HT-29肿瘤生长。
定义和说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在含有下列含义。一个特定的短语或术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文出现商品名时，旨在指代其对应的商品或其活性成分。
本发明的中间体化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。
本发明具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本发明的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本发明的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。
下面会通过实施例具体描述本发明，这些实施例并不意味着对本发明的任何限制。
本发明所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。
本发明所使用的溶剂可经市售获得。本发明采用下述缩略词：EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；TFA代表三氟乙酸；TsOH代表对甲苯磺酸；mp代表熔点；EtSO3H代表乙磺酸；MeSO3H代表甲磺酸；THF代表四氢呋喃；EtOAc代表乙酸乙酯；THF代表四氢呋喃；EA代表乙酸乙酯；DMAP代表4-二甲氨基吡啶；DCM代表二氯甲烷；DIPEA代表N，N-二异丙基乙胺；Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2代表[1，1′-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)二氯甲烷络合物。
本发明粉末X-射线衍射(X-ray powder diffractometer，XRPD)方法
仪器型号：Bruker D8 advance X射线粉末衍射仪(XRPD)
测试条件：
光管：Cu，K-Alpha，(u，)
光管电压：40kV，光管电流：40mA
散射狭缝：0.60mm
探测器狭缝：10.50mm
反散射狭缝：7.10mm
扫描范围：4-40deg
步长：0.02deg
速率：0.1S
样品盘转速：15rpm
本发明差热分析(Differential Scanning Calorimeter，DSC)方法
仪器型号：TA Q2000差示扫描量热仪(DSC)
测试条件：在50mL/min N2条件下，以10℃/min升温速率，加热样品从30℃到300℃。
本发明热重分析(Thermal Gravimetric Analyzer，TGA)方法
仪器型号：TA Q5000热重分析仪(TGA)
测试条件：在25mL/min N2条件下，以10℃/min升温速率加热样品从室温到300℃。
本发明动态蒸汽吸附分析(Dynamic Vapor Sorption，DVS)方法
将样品10mg～15mg置动态水蒸气吸附仪(DVS)样品盘内测定。
仪器型号：SMS DVS Advantage动态蒸汽吸附仪
测试条件：温度：25℃
平衡dm/dt：0.01％/min：(时间：10min最大180min)
干燥：0％RH，120min
RH(％)测量梯度：10％
RH(％)测量梯度范围：0％～90％～0％
引湿性评价分类如下：
ΔW％表示受试品在25±1℃和80±2％RH下的吸湿增重
附图说明
图1：式(I)化合物A晶型的XRPD图谱；
图2：式(I)化合物A晶型的DSC谱图；
图3：式(I)化合物A晶型的TGA谱图；
图4：式(I)化合物B晶型的XRPD图谱；
图5：式(I)化合物B晶型的DSC谱图；
图6：式(I)化合物B晶型的TGA谱图；
图7：式(I)化合物C晶型的XRPD图谱；
图8：式(I)化合物C晶型的DSC谱图；
图9：式(I)化合物C晶型的TGA谱图；
图10：式(I)化合物D晶型的XRPD图谱；
图11：式(I)化合物D晶型的DSC谱图；
图12：式(I)化合物D晶型的TGA谱图；
图13：式(I)化合物E晶型的XRPD图谱；
图14：式(I)化合物E晶型的DSC谱图；
图15：式(I)化合物E晶型的TGA谱图；
图16：式(I)化合物无定形的XRPD图谱；
图17：式(I)化合物无定形的DVS谱图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例来做进一步的说明，但具体的实施方式并不是对本发明的内容所做的限制。
中间体A
合成路线：
步骤1：化合物BA-2的合成。
将化合物A-1(249.70g，1.98mol，1.00eq)溶于水(500.00mL)中，于60～80℃下加入环丙胺(113.04g，1.98mol，1.00eq)。升温至100℃，搅拌反应6小时后，有沉淀生成。反应完毕后，反应液冷却至室温。加入甲醇(100mL)，搅拌30分钟。过滤收集滤饼，用乙酸乙酯(50mL*3)洗涤，旋干得到化合物A-2。MS m/z：205.0[M+H]+
步骤2：化合物A-3的合成。
将化合物A-2(31.85g，192.81mmol，1.00eq)与甲基丙二酸(33.59g，192.81mmol，1.00eq，)混合于二苯醚(180.00mL)中，在氮气保护下升温至220-230℃，搅拌反应6小时。反应完毕后，反应液冷却后加入石油醚(1L)稀释，收集滤饼，用石油醚(50mL*3)洗涤，旋干后，用二氯甲烷(500mL)搅拌30分钟，过滤并用二氯甲烷(50mL*3)洗涤，合并有机相旋干得粗品，经柱色谱(DCM/EA＝1/1)纯化，得到目标化合物A-3。1H NMR(400MHz，CDCl3-d)δ12.85(s，1H)，6.25(s，1H)，2.91-2.89(m，1H)，2.60(s，3H)，1.99(s，3H)，1.37-1.35(m，2H)，1.00-0.99(m，2H)。MS m/z：247.9[M+H]+
步骤3：化合物A-4的合成。
将化合物A-3(4.83g，19.53mmol，1.00eq)，三乙胺(3.95g，39.06mmol，2.00eq)和DMAP(47.72mg，390.60μmol，0.02eq)溶于二氯甲烷(120.00mL)中，于15℃下加入4-甲基苯磺酰氯(3.72g，19.53mmol，1.00eq)。15℃下搅拌反应16小时。反应完毕后，反应液依次用水(50mL)与饱和的氯化钠溶液(50mL)洗涤，经过无水硫酸钠干燥，旋干得到粗品。粗品经柱色谱(DCM，DCM/EA＝5/1)纯化，得到目标化合物A-4。1H NMR(400MHz，CDCl3-d)δ7.96-7.94(m，2H)，7.41-7.39(m，2H)，6.07(s，1H)，2.85(s，1H)，2.54(m，3H)，2.49(s，3H)，1.67(s，3H)，1.32-1.30(m，2H)，0.87-0.86(m，2H).
步骤4：化合物A-5的合成。
将化合物A-4(6.97g，17.36mmol，1.00eq)溶于乙腈(25.00mL)和二氯甲烷(25.00mL)中，分批加入N-溴代琥珀酰亚胺(4.63g，26.04mmol，1.50eq)。15℃下搅拌反应1小时。反应完毕后，将反应液旋干得到粗品。粗品经乙腈(50mL)打浆30分钟，过滤并用乙腈(10mL*3)洗涤，收集滤饼，旋干得到目标化合物A-5。1H NMR(400MHz，CDCl3-d)δ7.92-7.90(m，2H)，7.40-7.38(m，2H)，2.95(m，1H)，2.75(s，3H)，2.47(s，3H)，1.64(s，3H)，1.40.1.30(m，2H)，0.87-0.85(m，2H)。MSm/z：481.9[M+H]+
步骤5：化合物A的合成。
将化合物A-5(5.30g，11.03mmol，1.00eq)与邻氟苯胺(5.30g，47.65mmol，4.32eq)溶于乙醇(120.00mL)中，升温至85℃搅拌反应16小时。反应完毕后，反应液冷却后，过滤并用乙醇(30mL*3)洗涤，收集滤饼，旋干后得到目标化合物A。1H NMR(400MHz，CDCl3-d)δ11.01(s，1H)，7.12-7.10(m，3H)，7.03-7.01(m，1H)，2.97(s，3H)，1.61(m，3H)，1.38-1.36(t，3H)，0.91-0.90(t，3H)。MS m/z：420.8[M+H]+
中间体B
合成路线：
步骤1：化合物B-2的合成。
将化合物B-1(5.00g，26.87mmol，1.00eq)溶于吡啶(100.00mL)中，于0℃氮气保护下加入甲烷磺酰氯(11.87g，103.62mmol，3.86eq)。升温至60℃搅拌反应1小时。反应完毕后，旋除溶剂。残留物溶于二氯甲烷(100mL)，加入盐酸(1M，100mL)洗涤，再加入饱和的碳酸氢钠溶液(100mL)洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得粗品。粗品经柱色谱(PE/EA＝10/1-2/1)纯化得化合物B-2。1H NMR(400MHz，CDCl3-d)δ7.47(d，J＝8.0Hz，1H)，7.43(d，J＝8.0Hz，1H)，7.10(t，J＝8.0H，1H)，6.39(s，1H)，3.03(s，3H)，2.45(s，3H)。MS m/z：264.0[M+H]+
步骤2：化合物B的合成。
将化合物B-2(3.00g，11.36mmol，1.00eq)和频哪醇硼酯(4.33g，17.04mmol，1.50eq)溶于二氧六环(60.00mL)中，于20℃氮气保护下加入Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(927.51mg，1.14mmol，0.10eq)和醋酸钾(3.34g，34.08mmol，3.00eq)，升温至85℃搅拌反应3小时。反应完毕后，冷却到室温，加入水(100mL)，用二氯甲烷(100mL*2)萃取。收集有机相，经饱和氯化钠溶液(100mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，旋干得粗品。粗品经制备TLC(PE/EA＝1/1)纯化，得到化合物BB-9。1H NMR(400MHz，CDCl3-d)δ7.70-7.65(m，1H)，7.61-7.56(m，1H)，7.25(t，J＝7.6Hz，1H)，6.29(s，1H)，3.00(s，3H)，2.55(s，3H)，1.37(s，12H)。MS m/z：311.9[M+H]+
实施例1：式(I)化合物的制备
步骤1：
将化合物A(2g，6.43mmol)与化合物B(2.16g，5.14mmol)溶于二氧六环(30mL)与水(15mL)的混合溶剂中，于氮气保护下加入2-双环己基膦-2′，6′-二甲氧基联苯(S-Phos)(527.94mg，1.29mmol)磷酸钾(2.73g，12.86mmol)以及Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(525.1mg，643.0μmol)。反应升至100℃搅拌12小时。LCMS显示底物已消耗完目标产物已生成。反应液经硅藻土滤除不溶物，滤液旋干得粗品。粗品用硅胶柱色谱(石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1至1∶1)分离纯化得到化合物C。1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 11.13(s，1H)，7.53(d，J＝8.4Hz，1H)，7.31(t，J＝8.0Hz，1H)，7.09-7.11(m，3H)，6.97-7.02(m，2H)，6.29-6.37(m，1H)，3.12(s，3H)，2.91-2.99(m，1H)，2.56(s，3H)，2.30(s，3H)，2.09(s，3H)，0.91-0.97(m，3H)。LCMS(ESI)：m/z：524.1[M+1]+。
步骤2：
将化合物C(800mg，1.53mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(8mL)，于0℃氮气保护下加入三氟乙酸(6.16g，4.00mL)与N-碘代琥珀酰亚胺(688.44mg，3.06mmol)。反应于20℃搅拌12小时。LCMS显示底物有剩余，目标产物已生成。反应液用饱和碳酸氢钠水溶液(30mL)与饱和硫代硫酸钠水溶液(10mL)淬灭。混合液用二氯甲烷(30mL*2)萃取，有机相依次用水(20mL)，饱和氯化钠水溶液(30mL)洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥后滤除固体旋干得粗品。粗品用制备高效液相色谱分离纯化得到化合物D。1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 11.11(s，1H)，7.54(d，J＝7.6Hz，1H)，7.46(dd，J＝9.6Hz，1.6Hz，1H)，7.41(d，J＝8.4Hz，1H)，6.99(d，J＝7.2Hz，1H)，6.70(t，J＝8.4Hz，1H)，6.23(s，1H)，3.12(s，3H)，2.91-2.98(m，1H)，2.30(s，3H)，2.08(s，3H)，1.59(s，3H)，1.38(td，J＝7.2Hz，2.8Hz，2H)，0.95(q，J＝4.0Hz，2H)。LCMS(ESI)：m/z：650.1[M+1]+。
步骤3：
将化合物D(1.44g，2.22mmol)送手性SFC分离纯化(分离条件：色谱柱：OJ(250mm x50mm，10um)；流动相：A：二氧化碳，B：乙醇+0.1％氨水；洗脱梯度：起始B：35％，结束B：35％；流速：200mL/min。)。馏分在45℃下减压浓缩干，得到式(I)化合物。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 11.29(s，1H)，9.19(s，1H)，7.71(dd，J＝10.0Hz，J＝1.6Hz，1H)，7.51(d，J＝8.0Hz，1H)，7.38(d，J＝7.2Hz，1H)，7.31(t，J＝8.0Hz，1H)，7.10(d，J＝7.6Hz，1H)，6.87(t，J＝8.4Hz，1H)，3.06-3.01(m，1H)，3.00(s，3H)，2.22(s，3H)，2.05(s，3H)，1.43(s，3H)，1.25-1.13(m，2H)，0.97-0.83(m，2H)。LCMS(ESI)：m/z：650.0[M+1]+。
实施例2：式(I)化合物各晶型的制备
称量如表6中重量的式(I)化合物于2.0mL样品瓶中，加入一定体积表6中的溶剂，制备不同单一溶剂和混合溶剂的悬浊液(为保证溶液浑浊，且能搅动，采取多次补加化合物或溶剂方式进行)。混悬液在40℃条件下持续振摇2天后，离心后将残留固体放入真空干燥箱，在40℃条件下真空干燥过夜去除残留溶剂。干燥之后的样品用XRPD检测。实验结果如表6所示：
表6：化合物晶型筛选实验结果
实施例3：式(I)化合物无定形的制备
称量如表7中重量的式(I)化合物于2.0mL样品瓶中，加入一定体积表7中的溶剂，制备不同单一溶剂和混合溶剂的悬浊液(为保证溶液浑浊，且能搅动，采取多次补加化合物或溶剂方式进行)。混悬液在40℃条件下持续振摇2天后，离心后将残留固体放入真空干燥箱，在40℃条件下真空干燥过夜去除残留溶剂。干燥之后的样品用XRPD检测。实验结果如表7所示：
表7：化合物无定形筛选实验结果
将式(I)化合物的粗品(101.85g)加入乙醇(1.13L)中于22℃打浆16小时。过滤，滤饼用乙醇(500mL*3)洗涤，并于40℃真空干燥20小时，得到式(I)化合物的B晶型。将式(I)化合物的B晶型(80.92g)和丙酮(250.00mL)依次加入1L反应瓶，搅拌15分钟至固体完全溶解。减压浓缩至干后继续浓缩30分钟。收集固体至结晶皿碾碎为粉末和细小颗粒，于95～100℃、P≤-0.085MPa真空干燥48小时，得到式(I)化合物无定形。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm11.31(s，1H)，9.21(s，1H)，7.72(dd，J＝10.0Hz，1.8Hz，1H)，7.52(d，J＝8.6Hz，1H)，7.40(d，J＝7.6Hz，1H)，7.33(t，J＝7.3Hz，1H)，7.11(d，J＝6.5Hz，1H)，6.88(t，J＝8.7Hz，1H)，3.07～3.04(m，1H)，3.02(s，3H)，2.24(s，3H)，2.07(s，3H)，1.45(s，3H)，1.24～1.20(m，2H)，0.96～0.90(m，2H)。
实施例4：式(I)化合物无定形的吸湿性研究
实验材料：
SMS DVS Advantage动态蒸汽吸附仪
实验方法：
取式(I)化合物无定形10～15mg置于DVS样品盘内进行测试。
实验结果：
式(I)化合物无定形的DVS谱图如图17所示，ΔW＝1.577％。
实验结论：
式(I)化合物无定形在25℃和80％RH下的吸湿增重为1.577％，略有吸湿性。
实施例5：式(I)化合物无定形的长期固体稳定性试验
1.5g样品分别装入双层LDPE袋，每层LDPE袋分别扎扣密封，再将LDPE袋子放入铝箔袋中并热封，分别放入40℃/75％RH(6包)条件下考察。试验结果见下表8所示：
表8：式(I)化合物无定形的固体稳定性试验结果
结论：式(I)化合物无定形具有良好的稳定性。
实施例6：式(I)化合物B晶型的稳定性试验
准确称重式(I)化合物B晶型约10mg置于干燥洁净的玻璃瓶中，摊成薄薄一层，作为正式供试样品，放置于加速试验条件下(40℃/75％RH和60℃/75％RH)，其样品为完全暴露放样，用铝箔纸盖上，扎上小孔。试验在15天，1月取样分析，分析方法见表9，实验结果见表10。
稀释剂及流动相的制备
稀释剂：乙腈∶水(20∶10)作为稀释剂
如：取100mL纯水和200mL纯乙腈相混合于玻璃瓶中，超声脱气10min，冷至室温。
流动相A：0.04％TFA水溶液
如：量取0.4mL磷酸加入到4000mL水中，超声10分钟，混匀，放冷至室温，作为流动相A。
流动相B：乙腈
取乙腈作为流动相B。
对照品溶液的制备(0.8mg/mL)
0天的样品S1.S2，加入稀释剂12.5mL，超声5mm，混合均匀，后标记为STD-1和STD-2。
灵敏度样品溶液的制备
取对照品溶液STD-1(0天的S1样品)稀释2000倍，记作LOQ(检测限)。
样品溶液的制备(0.8mg/mL)
于冰箱取出样品，恢复至室温后加入12.5mL稀释剂溶解，超声5min，混合均匀。待系统稳定后进液相。
表9：高效液相色谱分析方法
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表10：式(I)化合物B晶型的稳定性结果
注：“-”表示未检测到。
结论：式(I)化合物B晶型具有较好的稳定性。
实施例7：式(I)化合物无定形的稳定性试验
各称取式(I)化合物无定形约2g置于干燥洁净的玻璃瓶中，摊成薄薄一层，作为正式供试样品，放置于加速试验条件下(40℃/75％RH和60℃/75％RH)，其样品为完全暴露放样，用铝箔纸盖上，扎上小孔。试验在3月取样分析，分析方法参见B晶型的分析方法，结果见表11。
表11：式(I)化合物无定形的稳定性结果
结论：式(I)化合物无定形具有良好的稳定性。
实施例8：式(I)化合物无定形在人结肠癌HT-29细胞皮下异种移植肿瘤BALB/c裸小鼠模型的体内药效学研究
实验材料：
购自北京维通利华实验动物技术有限公司的BALB/c裸小鼠，雌性，6～8周，70只(不包含分组剩余鼠)。动物在SPF级动物房以IVC(独立送风系统)笼具饲养(每笼5只)。将鼠保持在一个特殊的无病原体的环境中，且在单个通风笼中(4只每笼)。所有笼具、垫料及饮水在使用前均灭菌。笼具、饲料及饮水每周更换两次。所有的动物都可以自由获取标准认证的商业实验室饮食。
实验方法：
动物到达后在实验环境饲养10天后方开始实验。将0.1mL(5×106个)HT-29细胞皮下接种于每只裸小鼠的右后背。肿瘤平均体积达到165mm3时开始根据肿瘤体积随机分组给药。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)或相对肿瘤增殖率T/C(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝【(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积-该处理组开始给药时平均瘤体积))/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积-溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)】×100％。
各组间比较用one-way ANOVA进行分析，如果F值有显著性差异，应用Games-Howell法进行检验。如果F值无显著性差异，应用Tukey法进行分析。用SPSS 17.0进行所有数据分析。p＜0.05认为有显著性差异。
实验结果：见表12所示。
表12：药效学测试结果
注：
a.平均值±SEM。
b.肿瘤生长抑制由TRTV/CRTV和TGI(TGI(％)＝[1-(T25RTV-T0RTV)/(V25RTV-V0RTV)]×100)计算。
c. p值根据相对肿瘤体积计算。
实验结论：
式(I)化合物无定形各个剂量组均可有效抑制HT-29肿瘤生长。
Claims (36)
1.式(Ⅰ)化合物的A晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：12.31±0.2°、13.08±0.2°、15.45±0.2°、18.96±0.2°、21.63±0.2°、24.47±0.2°、27.17±0.2°和28.73±0.2°。
2.根据权利要求1所述的A晶型，其XRPD图谱如图1所示。
3.根据权利要求1或2所述的A晶型，其差示扫描量热曲线(DSC)在188.10±3℃处具有吸热峰的起始点。
4.根据权利要求3所述的A晶型，其DSC图谱如图2所示。
5.根据权利要求1或2所述的A晶型，其热重分析曲线(TGA)在197.79±3℃时失重达0.3606％。
6.根据权利要求5所述的A晶型，其TGA图谱如图3所示。
7.式(Ⅰ)化合物的B晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：
6.25±0.2°、12.43±0.2°、18.74±0.2°、21.89±0.2°、23.46±0.2°、24.99±0.2°、29.75±0.2°和31.44±0.2°；
8.根据权利要求7所述的B晶型，其XRPD图谱如图4所示。
9.根据权利要求7或8所述的B晶型，其差示扫描量热曲线(DSC)在171.21±3℃处具有吸热峰的起始点。
10.根据权利要求9所述的B晶型，其DSC图谱如图5所示。
11.根据权利要求7或8所述的B晶型，其热重分析曲线(TGA)在180.52±3℃时失重达0.4681％。
12.根据权利要求11所述的B晶型，其TGA图谱如图6所示。
13.式(Ⅰ)化合物的C晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：
6.33±0.2°、12.55±0.2°、15.22±0.2°、17.68±0.2°、18.79±0.2°、20.07±0.2°、25.10±0.2°和26.76±0.2°；
14.根据权利要求13所述的C晶型，其XRPD图谱如图7所示。
15.根据权利要求13或14所述的C晶型，其差示扫描量热曲线(DSC)在168.06±3℃处具有吸热峰的起始点。
16.根据权利要求15所述的C晶型，其DSC图谱如图8所示。
17.根据权利要求13或14所述的C晶型，其热重分析曲线(TGA)在176.32±3℃时失重达0.7482％。
18.根据权利要求17所述的C晶型，其TGA图谱如图9所示。
19.式(Ⅰ)化合物的D晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：12.45±0.2°、14.86±0.2°、17.13±0.2°、18.41±0.2°、18.94±0.2°、22.83±0.2°、24.83±0.2°和26.15±0.2°；
20.根据权利要求19所述的D晶型，其XRPD图谱如图10所示。
21.根据权利要求19或20所述的D晶型，其差示扫描量热曲线(DSC)在163.80±3℃处具有一个吸热峰的起始点。
22.根据权利要求21所述的D晶型，其DSC图谱如图11所示。
23.根据权利要求19或20所述的D晶型，其热重分析曲线(TGA)在121.34±3℃时失重达0.9987％；在174.58℃时失重达1.1087％。
24.根据权利要求23所述的D晶型，其TGA图谱如图12所示。
25.式(Ⅰ)化合物的E晶型，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：
12.41±0.2°、15.02±0.2°、17.48±0.2°、18.69±0.2°、22.81±0.2°、23.61±0.2°、24.93±0.2°和25.82±0.2°；
26.根据权利要求25所述的E晶型，其XRPD图谱如图13所示。
27.根据权利要求25或26所述的E晶型，其差示扫描量热曲线(DSC)在167.83±3℃处具有一个吸热峰的起始点。
28.根据权利要求27所述的E晶型，其DSC图谱如图14所示。
29.根据权利要求25或26所述的E晶型，其热重分析曲线(TGA)在99.83±3℃时失重达0.6462％；在176.84±3℃时失重达0.73118％。
30.根据权利要求29所述的E晶型，其TGA图谱如图15所示。
31.式(I)化合物的无定形，其X射线粉末衍射(XRPD)图谱如图16所示；
32.根据权利要求7所述的式(I)化合物B晶型的制备方法，包括：
(a)将式(I)化合物加入醇类溶剂中使其成悬浊液；
(b)悬浊液25～60℃下搅拌8～120小时；
(c)离心后干燥8～16小时；
33.根据权利要求32所述的制备方法，其中，所述醇类溶剂包含乙醇。
34.式(I)化合物无定形的制备方法，包括：
(a)将式(I)化合物加入溶剂或者混合溶剂中溶解；
(b)将溶液旋干、喷雾干燥或者冻干；
其中，所述的溶剂选自丙酮、四氢呋喃和乙腈
35.根据权利要求1所述的式(I)化合物的A晶型、根据权利要求7所述的B晶型、根据权利要求13所述的C晶型、根据权利要求19所述D晶型或根据权利要求25所述的E晶型在制备治疗MEK相关病症的药物上的应用；
36.式(I)化合物的无定形在制备治疗MEK相关病症的药物上的应用；
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| GR01 | Patent grant | ||
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