CN111466369A - 肿瘤组织/或细胞冻存和复苏试剂盒及其处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种肿瘤组织/或细胞冻存和复苏试剂盒及其处理方法，包括冻存试剂盒与复苏试剂盒，冻存试剂盒包括玻璃化液，复苏试剂盒包括复苏液，其中，所述玻璃化液与所述复苏液所含成分完全清楚且稳定可控，可直接应用于活性肿瘤组织/或细胞的冻存、复苏，无需稀释或自行配制，简化了操作。使用本发明进行肿瘤组织/或细胞在玻璃化冻存前后，生物学活性和形态学特征未发生显著的改变，说明该玻璃化冻存、复苏溶液体系较好的维持了肿瘤组织/或细胞的微环境和肿瘤异质性特征，且冻存的肿瘤组织/或细胞复苏后进行原位移植，成瘤率高，可有效的冻存活性肿瘤组织/或细胞。

Description

肿瘤组织/或细胞冻存和复苏试剂盒及其处理方法
技术领域
本发明涉及肿瘤组织/或细胞的处理技术领域，具体地说，有关于重力组织冻存、复苏试剂盒及其处理方法。
背景技术
玻璃化冻存是一种新型的低温保存技术，对临床活肿瘤组织/或细胞样本应用于科研基础研究和临床领域具有潜在的应用价值。常用的活性肿瘤组织/或细胞保存方法，例如丙二醇慢速程序化冷冻法、液氮直投法(超速冷冻)及二甲基亚砜玻璃化冷冻法会使活性肿瘤组织/或细胞完全或部分失去活性，导致大量宝贵的临床活性肿瘤组织/或细胞因无法得到长期有效的高活性保存而被浪费。
玻璃化液早在1985年由Rau和Fahy研制，主要应用于卵母细胞、精子细胞以及多种干细胞的低温保存。该方法通过高浓度冻存液充分反应后快速保护剂中降温，转变为玻璃样半透明状，并予以低温保存。其过程中细胞内外无冰晶形成，避免了细胞的结构破坏，可高度保存组织活性。
发明内容
本发明的目的在于提供活肿瘤组织/或细胞冻存、复苏试剂盒及其处理方法。
为实现上述发明目的之一，本发明提供一种肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒，包括：
玻璃化液1，其组分包括：Gibco DMEM培养基65-95V/V％、二甲基亚砜 5.5-20V/V％、乙二醇3.5-15V/V％、牛血清白蛋白0.5-4W/V％、蔗糖1-5 W/V％、甲基纤维素(4000CP)0.05-0.8W/V％、羟乙基淀粉0.25-0.6W/V％和葡萄糖15-35W/V％；以及
玻璃化液2，其组分包括：Gibco DMEM培养基65-95V/V％、二甲基亚砜5.5-20V/V％、乙二醇8-20V/V％、牛血清白蛋白0.5-4W/V％、蔗糖10-20 W/V％、甲基纤维素(4000CP)0.05-0.8W/V％、聚乙烯吡咯烷酮0.25-0.6W/V％和葡萄糖15-35W/V％。
作为可选的技术方案，所述玻璃化液1的组分包括：Gibco DMEM培养基 80V/V％，二甲基亚砜10V/V％，乙二醇10V/V％，牛血清白蛋白2W/V％，蔗糖1W/V％、甲基纤维素(4000CP)0.05W/V％、羟乙基淀粉0.25W/V％和葡萄糖25W/V％；以及所述玻璃化液2的组分包括：DMEM培养基70V/V％，二甲基亚砜15V/V％，乙二醇12V/V％，牛血清白蛋白3W/V％，蔗糖20W/V％、甲基纤维素(4000CP)0.1W/V％、聚乙烯吡咯烷酮0.25W/V％和葡萄糖30 W/V％。
作为可选的技术方案，还包括肿瘤组织/或细胞切片模具，所述肿瘤组织/或细胞切片模具包括：底座，所述底座包括上表面，所述上表面设有凹陷部以及自所述上表面垂直向下，沿横向设有多条等距分布的、深度低于所述凹陷部最低点的切刀导向槽，其中，所述底座的两侧还设有把手。
作为可选的技术方案，所述凹陷部呈椭圆体，所述椭圆体的宽度为30mm，长度为35mm；所述凹陷部最低点到所述底座的上表面的垂直距离为25mm。
作为可选的技术方案，所述切刀导向槽的深度低于所述凹陷部最低点5mm；相邻两条切刀导向槽之间的间距1mm；所述切刀导向槽的数量为23条。
本发明的目的之二在于提供一种肿瘤组织/或细胞复苏试剂盒，包括：
复苏液1，其组分包括：Earl’s平衡盐溶液65-85V/V％，1x磷酸盐缓冲液 15-35V/V％，牛血清白蛋白1-3w/v％，蔗糖10-40w/v％和葡萄糖15-35w/v％；
复苏液2，其组分包括：Earl’s平衡盐溶液65-85V/V％，1x磷酸盐缓冲液 15-35V/V％，牛血清白蛋白1-3w/v％，蔗糖10-20w/v％和葡萄糖15-35w/v％；以及
复苏液3，其组分包括：Earl’s平衡盐溶液75-95V/V％，1x磷酸盐缓冲液 5-25V/V％，牛血清白蛋白1-3w/v％和葡萄糖15-35w/v％。
作为可选的技术方案，所述复苏液1的组分包括：Earl’s平衡盐溶液 65V/V％，1x磷酸盐缓冲液35V/V％，牛血清白蛋白1w/v％，蔗糖30w/v％和葡萄糖25w/v％；所述复苏液2的组分包括：Earl’s平衡盐溶液75V/V％，1x磷酸盐缓冲液25V/V％，BSA1w/v％，蔗糖15w/v％和葡萄糖25w/v％；以及所述复苏液3的组分包括：Earl’s平衡盐溶液95V/V％，1x磷酸盐缓冲液5V/V％， BSA1w/v％，蔗糖10w/v％和葡萄糖15w/v％。
本发明的目的之三在于提供一种肿瘤组织/或细胞冻存和复苏试剂盒，所述肿瘤组织/或细胞冻存和复苏试剂盒包括如上所述的肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒和如上所述的肿瘤组织/或细胞复苏试剂盒组合而成。
本发明的目的之四在于提供一种对肿瘤组织/或细胞冻存的处理方法，利用如上所述的肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒对肿瘤组织/或细胞进行冻存，所述肿瘤组织/或细胞冻存的处理方法包括：
S1、肿瘤组织/或细胞样本经1x磷酸盐缓冲液清洗2遍，去除包膜、血管及粘液性坏死组织；
S2、用所述肿瘤切块模具将肿瘤组织/或细胞进行切片，经1x磷酸盐缓冲液再次清洗；
S3、将切片后的肿瘤组织/或细胞先浸入5ml所述玻璃化液1，浸入时间 10min；再浸入5ml所述玻璃化液2中，浸入时间10min；
S4、取出S3中玻璃化冻存后的肿瘤组织/或细胞并沥干，将肿瘤组织/或细胞迅速移入冻存管内，于无菌液氮罐中保存。
作为可选的技术方案，所述S1中将肿瘤组织/或细胞样本进行血管、包膜及坏死组织的处理过程，被处理肿瘤组织/或细胞样本需完全浸入1x磷酸盐缓冲液中，且操作轻柔，避免肿瘤组织/或细胞样本损伤。
作为可选的技术方案，所述S2中将肿瘤组织/或细胞进行切片，肿瘤组织/ 或细胞的切片为1×1×1㎜。
作为可选的技术方案，所述S4中将S3玻璃化冻存后的肿瘤组织/或细胞沥干并迅速移入冻存管，于液氮罐中保存。
本发明的目的之五在于还提供一种对肿瘤组织/或细胞复苏的处理方法，利用如上所述的肿瘤组织/或细胞复苏试剂盒对肿瘤组织/或细胞进行复苏，所述肿瘤组织/或细胞复苏的处理方法包括：
S11、将从液氮中取出的肿瘤组织/或细胞迅速浸入36-38℃水浴加热的10-20ml复苏液1中，浸入时间5-10min；
S22、将所述复苏液1处理后的肿瘤组织/或细胞取出并浸入5-10ml复苏液 2中，浸入时间5-10min；
S33、将所述复苏液2处理后的肿瘤组织/或细胞取出并浸入5-10ml复苏液 3中，浸入时间5-10min；
S44、将所述复苏液3处理后的肿瘤组织/或细胞用1x磷酸盐缓冲液清洗2 遍，浸入无菌生理盐水，获得复苏后的肿瘤组织/或细胞。
作为可选的技术方案，所述S11中将从液氮中取出的肿瘤组织/或细胞迅速浸入37℃水浴预热的10ml复苏液1中，浸入时间5min。
作为可选的技术方案，所述S22中,将所述复苏液1处理后的肿瘤组织/或细胞转入5ml室温复苏液2，浸入时间5min；所述S33中，将所述复苏液2处理后的肿瘤组织/或细胞浸入10ml室温复苏液3中，浸入时间10min。
本发明的目的之六在于，还提供一种对肿瘤组织/或细胞进行冻存和复苏的处理方法，利用如上所述的肿瘤组织/或细胞冻存和复苏试剂盒，所述肿瘤组织/ 或细胞的冻存和复苏的处理方法包括：
冻存处理，所述冻存处理包括：
S1、肿瘤组织/或细胞样本经1x磷酸盐缓冲液清洗2遍，去除包膜、血管及粘液性坏死组织；S2、用所述肿瘤切块模具将肿瘤组织/或细胞进行切片，经1x 磷酸盐缓冲液再次清洗；S3、将切片后的肿瘤组织/或细胞先浸入5ml所述玻璃化液1，浸入时间10min；再浸入5ml所述玻璃化液2中，浸入时间10min；以及S4、取出S3中玻璃化冻存后的肿瘤组织/或细胞并沥干，将肿瘤组织/或细胞迅速移入冻存管内，于无菌液氮罐中保存；
复苏处理，所述复苏处理包括：
S11、将从液氮中取出的肿瘤组织/或细胞迅速浸入36-38℃水浴加热的 10-20ml复苏液1中，浸入时间5-10min；S22、将所述复苏液1处理后的肿瘤组织/或细胞取出并浸入5-10ml复苏液2中，浸入时间5-10min；S33、将所述复苏液2处理后的肿瘤组织/或细胞取出并浸入5-10ml复苏液3中，浸入时间 5-10min；以及S44、将所述复苏液3处理后的肿瘤组织/或细胞用1x磷酸盐缓冲液清洗2遍，浸入无菌生理盐水，获得复苏后的肿瘤组织/或细胞。
与现有技术相比，本发明的冻存、复苏试剂盒包括了组织玻璃化液与复苏液，其所含溶液体系中各组分清楚、稳定。利用本发明的冻存、复苏试剂盒冻存、复苏的肿瘤组织/或细胞，保证了肿瘤组织/或细胞自身活性的同时，能够维持肿瘤组织/或细胞异质性和肿瘤微环境特征。且在建立皮下肿瘤种植PDX模型和肿瘤原位移植瘤PDOX模型上，肿瘤组织/或细胞学特征和生物学特征均未发生改变。此外，该肿瘤组织/或细胞玻璃化冻存、复苏试剂盒处理方法简便明了，涉及的仪器设备均为常用，利于操作和普及应用。
附图说明
图1是人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞经本发明冻存、复苏后，接种免疫缺陷性小鼠一个月后，PDX、PDOX造模情况的示意图。
图2是人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞经本发明冻存、复苏后，接种免疫缺陷性小鼠一个月后，PDX、PDOX小鼠模型肿瘤组织/或细胞HE染色形态学特征的示意图。
图3A为肿瘤组织/或细胞切片模具的立体图；图3B为肿瘤组织/或细胞切块模组的俯视图。
具体实施方式
以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。
本发明提供一种适用于肿瘤组织/或细胞的冻存和复苏的试剂盒，其包括冻存试剂盒与复苏试剂盒，所述冻存试剂盒对所述肿瘤组织/或细胞进行冻存处理，所述复苏试剂盒对经所述冻存试剂盒冻存处理后的肿瘤组织/或细胞进行复苏处理。
本发明提供的一种肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒，其包括玻璃化液1和玻璃化液2，其中，玻璃化液1，其组分包括：Gibco DMEM培养基65-95 V/V％、二甲基亚砜5.5-20V/V％、乙二醇3.5-15V/V％、牛血清白蛋白 0.5-4W/V％、蔗糖1-5W/V％、甲基纤维素(4000CP)0.05-0.8W/V％、羟乙基淀粉0.25-0.6W/V％和葡萄糖15-35W/V％；以及玻璃化液2，其组分包括：Gibco DMEM培养基65-95V/V％、二甲基亚砜5.5-20V/V％、乙二醇 8-20V/V％、牛血清白蛋白0.5-4W/V％、蔗糖10-20W/V％、甲基纤维素 (4000CP)0.05-0.8W/V％、聚乙烯吡咯烷酮0.25-0.6W/V％和葡萄糖15-35 W/V％。
本发明还提供一种肿瘤组织/或细胞复苏试剂盒，包括：复苏液1、复苏液2 及复苏液3，其中，复苏液1，其组分包括：Earl’s平衡盐溶液65-85V/V％，1x 磷酸盐缓冲液15-35V/V％，牛血清白蛋白1-3w/v％，蔗糖10-40w/v％和葡萄糖 15-35w/v％；复苏液2，其组分包括：Earl’s平衡盐溶液65-85V/V％，1x磷酸盐缓冲液15-35V/V％，牛血清白蛋白1-3w/v％，蔗糖10-20w/v％和葡萄糖15-35 w/v％；以及复苏液3，其组分包括：Earl’s平衡盐溶液75-95V/V％，1x磷酸盐缓冲液5-25V/V％，牛血清白蛋白1-3w/v％和葡萄糖15-35w/v％。
以下将通过具体的实施例说明，上述肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒和肿瘤组织/或细胞复苏试剂盒各自的制备过程及对肿瘤组织/或细胞的处理方法。
实施例1、肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒的制备
配制肿瘤组织/或细胞冻存所需的玻璃化液，具体配方组分如下：
玻璃化液1包括：Gibco DMEM培养基80V/V％，二甲基亚砜(DMSO) 10V/V％，乙二醇(EG)10V/V％，牛血清白蛋白(BSA)2W/V％，蔗糖1W/V％、甲基纤维素(4000CP)0.05W/V％、羟乙基淀粉0.25W/V％和葡萄糖25W/V％。
玻璃化液2包括：DMEM培养基70V/V％，二甲基亚砜(DMSO)15V/V％，乙二醇(EG)12V/V％，牛血清白蛋白(BSA)3W/V％，蔗糖20W/V％、甲基纤维素(4000CP)0.1W/V％、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)0.25W/V％和葡萄糖 30W/V％。
其中，表1中列出了各试剂的中文、英文名称及购买厂商：
表1
Figure RE-GDA0002531490540000071
实施例2、肿瘤组织/或细胞的冻存处理
将配制完成的冻存试剂，过滤分装冻存于-4℃冰箱内储存；若配制完成的冻存试剂需要长期保存，需冻存于-20℃冰箱内。
对肿瘤组织/或细胞进行冻存处理，冻存处理的处理方法包括：
步骤S1、肿瘤组织/或细胞样本经1x磷酸盐缓冲液(英文缩写：1xPBS)清洗2遍，去除包膜、血管及粘液性坏死组织；其中，操作过程中动作要轻柔，避免肿瘤组织/或细胞块损伤。另外，将肿瘤组织/或细胞样本进行血管、包膜及坏死组织的处理过程，被处理肿瘤组织/或细胞样本需完全浸入1x磷酸盐缓冲液中。
步骤S2、用所述肿瘤切块模具将肿瘤组织/或细胞进行切片，经1x磷酸盐缓冲液再次清洗。其中，经肿瘤切片模具切片处理后，获得大小为1×1×1mm的组织片块，并用1x磷酸盐缓冲液再次清洗。
其中，步骤S2中肿瘤组织/或细胞切片模具如图3A和图3B所示，所述肿瘤组织/或细胞处理模具包括，底座1，底座1包括上表面2，上表面2上设有凹陷部3及切刀导向槽4，切刀导向槽4自上表面2垂直向下，沿横向设有多条等间距分布的、深度低于凹陷部3最低点。
本实施例中，底座1中的切刀导向槽4为304不锈钢切刀导向槽；底座1 的两侧的把手5为ABS塑料注塑把手，其嵌设于底座1的两侧。
在一较佳的实施方式中，凹陷部3呈椭圆体，椭圆体的宽度为30mm，长度为35mm；其中，凹陷部3的最低点到底座1的上表面2的垂直距离为 25mm。
在一较佳的实施方式中，切刀导向槽4的深度低于凹陷部3的最低点月 5mm，任意相邻两条切刀导向槽之间的间距约为1mm。较佳的，切刀导向槽4的数量为23条，但不以此为限。
步骤S3、将切片后的肿瘤组织/或细胞先浸入5ml所述玻璃化液1，浸入时间10min；再浸入5ml所述玻璃化液2中，浸入时间10min。
其中，分别取按照上述实施例1中的各组分含量配置的玻璃化液1和玻璃化液2各5ml，将肿瘤组织/或细胞切片分别依次浸入5ml玻璃化液1中浸入10min；再转入5ml玻璃化液2中浸入10min。
步骤S4、取出S3中玻璃化冻存后的肿瘤组织/或细胞并沥干，将肿瘤组织/ 或细胞迅速移入冻存管内，于无菌液氮罐中保存。
在本发明其他实施方式中，步骤S4中也可将肿瘤组织/或细胞迅速移入冻存管内，于液氮罐中保存。
实施例3、肿瘤组织/或细胞复苏试剂盒的制备
配置肿瘤组织/或细胞复苏所需的复苏液，具体配方组分如下：
复苏液1的组分包括：Earl’s平衡盐溶液65V/V％，1x磷酸盐缓冲液35 V/V％，牛血清白蛋白1w/v％，蔗糖30w/v％和葡萄糖25w/v％；
复苏液2的组分包括：Earl’s平衡盐溶液75V/V％，1x磷酸盐缓冲液 25V/V％，牛血清白蛋白1w/v％，蔗糖15w/v％和葡萄糖25w/v％；以及
复苏液3的组分包括：Earl’s平衡盐溶液95V/V％，1x磷酸盐缓冲液5V/V％，牛血清白蛋白1w/v％，蔗糖10w/v％和葡萄糖15w/v％。
其中，表2中列出了各试剂的中文、英文名称及购买厂商：
表2
序号 英文名 中文名 厂商
1 Earl’s平衡盐溶液 厄尔平衡盐溶液 Gibco
2 1xPBS 1x磷酸盐缓冲液 Invitrogen
3 BSA 牛血清白蛋白 Invitrogen
4 - 蔗糖 上海生工
5 - 葡萄糖 上海生工
实施例4、肿瘤组织/或细胞的复苏处理
步骤S11、将从液氮中取出的肿瘤组织/或细胞迅速浸入36-38℃水浴加热的 10-20ml复苏液1中，浸入时间5-10min。其中，较佳的，将从液氮中取出的肿瘤组织/或细胞迅速浸入37℃水浴预热的10ml复苏液1中，浸入时间5min。
步骤S22、将所述复苏液1处理后的肿瘤组织/或细胞取出并浸入5-10ml复苏液2中，浸入时间5-10min。其中，较佳的，将所述复苏液1处理后的肿瘤组织/或细胞转入5ml室温复苏液2，浸入时间5min。
步骤S33、将所述复苏液2处理后的肿瘤组织/或细胞取出并浸入5-10ml复苏液3中，浸入时间5-10min。其中，较佳的，将所述复苏液2处理后的肿瘤组织/或细胞浸入10ml室温复苏液3中，浸入时间10min。
步骤S44、将所述复苏液3处理后的肿瘤组织/或细胞用1x磷酸盐缓冲液清洗2遍，浸入无菌生理盐水，获得复苏后的肿瘤组织/或细胞。
实施例5、人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞冻存实验
步骤S1、人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞样本经1x磷酸盐缓冲液清洗2 遍，完全浸入1x磷酸盐缓冲液中，进行去除包膜、血管及粘液性坏死组织；其中，操作过程中动作要轻柔，避免肿瘤组织/或细胞块损伤。
步骤S2、用肿瘤切块模具将人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞进行切片，获得大小为1×1×1mm的组织片块，经1x磷酸盐缓冲液再次清洗。
步骤S3、将切片后的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞先浸入5ml预先配置的玻璃化液1(各组分及用量见实施例1)，浸入时间10min；再浸入 5ml预先配置的玻璃化液2(各组分及用量见实施例1)中，浸入时间10min。
步骤S4、取出S3中玻璃化冻存后的肿瘤组织/或细胞并沥干，将肿瘤组织/ 或细胞迅速移入冻存管内，于无菌液氮罐中保存。
实施例6、人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞的复苏实验
步骤S11、将从液氮中取出的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞迅速浸入 36-38℃水浴加热的10ml复苏液1中，浸入时间5min。
步骤S22、将将所述复苏液1处理后的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞转入5ml室温复苏液2，浸入时间5min。
步骤S33、将所述复苏液2处理后的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞浸入 10ml室温复苏液3中，浸入时间10min。
步骤S44、将所述复苏液3处理后的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞用1x 磷酸盐缓冲液清洗2遍，浸入无菌生理盐水，获得复苏后的肿瘤组织/或细胞。
步骤S55、将复苏后的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞经皮下种植或者原位移植于免疫缺陷小鼠体内建立新一代的PDX、PDOX模型，用于后续的医疗或科研研究。
如图1所示，人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞用本发明的冻存、复苏方法复苏后，经皮下种植或者原位移植于免疫缺陷小鼠一个月后，用本发明冻存方法的实验组的荷瘤仍旧存在，且呈渐进性增长变大，PDX、PDOX造模成功。
图1中左上图片为新鲜人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞移植建立PDX 模型，右上图片为新鲜人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞移植建立PDOX模型；左下图片为本发明中冻存复苏后的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞移植后建立PDX模型；右下图片为本发明中冻存复苏后的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞移植后建立PDOX模型。
经本发明的试剂盒及处理方法冻存复苏后的人体原代乳腺癌肿瘤组织/ 或细胞，能够成功移种于免疫缺陷小鼠身上，建立有效的PDX、PDOX小鼠模型。经验证，人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞冻存、复苏后经皮下种植或者原位移植于免疫缺陷小鼠一个月后，解剖可见肿瘤组织/或细胞长入新生血管，且组织呈渐进性增殖变大。结果说明：经本发明的试剂盒及处理方法冻存复苏后的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞移种于免疫缺陷小鼠身上后，成功建立了PDX、PDOX小鼠模型，肿瘤组织/或细胞在小鼠体内活化。
实施例7：人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞冻存、复苏后苏木精-伊红染色(HE染色)实验
1、试验方法
(1)超净工作台中，常规准备待冻存的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞沉淀；准备过程中注意防止用力夹或尖锐器具造成部分人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞死亡；
(2)待冻存人体原代乳腺肿瘤组织/或细胞用样本保存液重悬后分装至容量2ml冻存管中，在容量2ml冻存管中，加入1ml组织冻存液，放入程序降温盒内降温至-80℃，24h后转移至液氮罐中保存；
(3)人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞经本发明提供的冻存和复苏试剂盒冻存、复苏后用4％多聚甲醛固定处理后，用OCT包埋剂(optimal cutting temperature compound)包埋；常规冰冻组织切片，切片厚度一般为14μm，切片短期内在-20℃保存，切片可置于-80℃冻存长期保存；
(4)染色：苏木精浸染3～10min，自来水冲洗片刻，1％盐酸酒精分化 3～5sec，自来水冲洗数分钟至数小时，碳酸锂饱和水溶液1～2min，自来水冲洗15min，0.5％伊红溶液浸染1～2min；脱水：第一次95％乙醇1～ 2min，第二次95％乙醇1～2min，100％乙醇1～2min；透明：二甲苯-石碳酸混合液2min，第一次二甲苯1～2min，第二次二甲苯1～2min，第三次二甲苯1～2min；封固：中性树胶封片；在Olympus显微镜下观察，并拍照片。
2、结果
如图3所示，A代表新鲜的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞的HE染色结果，B代表经冻存复苏的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞的HE染色结果，显示冻存复苏后的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞与新鲜的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞具有相似的形态结构，提示冻存和复苏过程未明显影响肿瘤特性。结果说明了冻存和复苏过程未明显影响肿瘤特性。
此外，本发明还提供一种肿瘤组织/或细胞冻存和复苏试剂盒，所述肿瘤组织/或细胞冻存和复苏试剂盒包括如上所述的肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒和如上所述的肿瘤组织/或细胞复苏试剂盒组合而成。
另外，本发明还提供一种对肿瘤组织/或细胞进行冻存和复苏的处理方法，利用上述肿瘤组织/或细胞冻存和复苏试剂盒，所述肿瘤组织/或细胞的冻存和复苏的处理方法包括：
冻存处理，所述冻存处理包括：
S1、肿瘤组织/或细胞样本经1x磷酸盐缓冲液清洗2遍，去除包膜、血管及粘液性坏死组织；
S2、用所述肿瘤切块模具将肿瘤组织/或细胞进行切片，经1x磷酸盐缓冲液再次清洗；
S3、将切片后的肿瘤组织/或细胞先浸入5ml所述玻璃化液1，浸入时间 10min；再浸入5ml所述玻璃化液2中，浸入时间10min；以及
S4、取出S3中玻璃化冻存后的肿瘤组织/或细胞并沥干，将肿瘤组织/或细胞迅速移入冻存管内，于无菌液氮罐中保存；
复苏处理，所述复苏处理包括：
S11、将从液氮中取出的肿瘤组织/或细胞迅速浸入36-38℃水浴加热的 10-20ml复苏液1中，浸入时间5-10min；
S22、将所述复苏液1处理后的肿瘤组织/或细胞取出并浸入5-10ml复苏液 2中，浸入时间5-10min；
S33、将所述复苏液2处理后的肿瘤组织/或细胞取出并浸入5-10ml复苏液 3中，浸入时间5-10min；以及
S44、将所述复苏液3处理后的肿瘤组织/或细胞用1x磷酸盐缓冲液清洗2 遍，浸入无菌生理盐水，获得复苏后的肿瘤组织/或细胞。
综上，本发明的冻存、复苏试剂盒包括了组织玻璃化液与复苏液，玻璃化液与复苏液所含各组分清楚、稳定。利用本发明的冻存、复苏试剂盒冻存、复苏的人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞，保证了人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞自身活性的同时，能够维持肿瘤组织/或细胞异质性和肿瘤微环境特征。且在建立皮下肿瘤种植PDX模型和肿瘤原位移植瘤PDOX模型上，人体原代乳腺癌肿瘤组织/或细胞学特征和生物学特征均未发生改变。
此外，本发明提供的肿瘤组织/或细胞玻璃化冻存、复苏试剂盒处理方法简便明了，涉及的仪器设备均为常用，利于操作和普及应用。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒，其特征在于，所述肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒包括：
玻璃化液1，其组分包括：Gibco DMEM培养基65-95V/V％、二甲基亚砜5.5-20V/V％、乙二醇3.5-15V/V％、牛血清白蛋白0.5-4W/V％、蔗糖1-5W/V％、甲基纤维素(4000CP)0.05-0.8W/V％、羟乙基淀粉0.25-0.6W/V％和葡萄糖15-35W/V％；以及
玻璃化液2，其组分包括：Gibco DMEM培养基65-95V/V％、二甲基亚砜5.5-20V/V％、乙二醇8-20V/V％、牛血清白蛋白0.5-4W/V％、蔗糖10-20W/V％、甲基纤维素(4000CP)0.05-0.8W/V％、聚乙烯吡咯烷酮0.25-0.6W/V％和葡萄糖15-35W/V％。
2.如权利要求1所述的肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒，其特征在于，
所述玻璃化液1的组分包括：Gibco DMEM培养基80V/V％，二甲基亚砜10V/V％，乙二醇10V/V％，牛血清白蛋白2W/V％，蔗糖1W/V％、甲基纤维素(4000CP)0.05W/V％、羟乙基淀粉0.25W/V％和葡萄糖25W/V％；以及
所述玻璃化液2的组分包括：DMEM培养基70V/V％，二甲基亚砜15V/V％，乙二醇12V/V％，牛血清白蛋白3W/V％，蔗糖20W/V％、甲基纤维素(4000CP)0.1W/V％、聚乙烯吡咯烷酮0.25W/V％和葡萄糖30W/V％。
3.如权利要求1所述的肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒，其特征在于，还包括肿瘤组织/或细胞切片模具，所述肿瘤组织/或细胞切片模具包括：底座，所述底座包括上表面，所述上表面设有凹陷部以及自所述上表面垂直向下，沿横向设有多条等距分布的、深度低于所述凹陷部最低点的切刀导向槽，其中，所述底座的两侧还设有把手。
4.如权利要求3所述的肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒，其特征在于，所述凹陷部呈椭圆体，所述椭圆体的宽度为30mm，长度为35mm；所述凹陷部最低点到所述底座的上表面的垂直距离为25mm。
5.如权利要求3所述的肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒，其特征在于，所述切刀导向槽的深度低于所述凹陷部最低点5mm；相邻两条切刀导向槽之间的间距1mm；所述切刀导向槽的数量为23条。
6.一种肿瘤组织/或细胞复苏试剂盒，其特征在于，所述肿瘤组织/或细胞复苏试剂盒包括：
复苏液1，其组分包括：Earl’s平衡盐溶液65-85V/V％，1x磷酸盐缓冲液15-35V/V％，牛血清白蛋白1-3w/v％，蔗糖10-40w/v％和葡萄糖15-35w/v％；
复苏液2，其组分包括：Earl’s平衡盐溶液65-85V/V％，1x磷酸盐缓冲液15-35V/V％，牛血清白蛋白1-3w/v％，蔗糖10-20w/v％和葡萄糖15-35w/v％；以及
复苏液3，其组分包括：Earl’s平衡盐溶液75-95V/V％，1x磷酸盐缓冲液5-25V/V％，牛血清白蛋白1-3w/v％和葡萄糖15-35w/v％。
7.如权利要求6所述的肿瘤组织/或细胞复苏试剂盒，其特征在于，
所述复苏液1的组分包括：Earl’s平衡盐溶液65V/V％，1x磷酸盐缓冲液35V/V％，牛血清白蛋白1w/v％，蔗糖30w/v％和葡萄糖25w/v％；
所述复苏液2的组分包括：Earl’s平衡盐溶液75V/V％，1x磷酸盐缓冲液25V/V％，牛血清白蛋白1w/v％，蔗糖15w/v％和葡萄糖25w/v％；以及
所述复苏液3的组分包括：Earl’s平衡盐溶液95V/V％，1x磷酸盐缓冲液5V/V％，牛血清白蛋白1w/v％，蔗糖10w/v％和葡萄糖15w/v％。
8.一种肿瘤组织/或细胞冻存和复苏试剂盒，其特征在于，所述肿瘤组织/或细胞冻存和复苏试剂盒包括如权利要求1-5中任一项所述的肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒和如权利要求6-7任一项所述的肿瘤组织/或细胞复苏试剂盒组合而成。
9.一种对肿瘤组织/或细胞冻存的处理方法，其特征在于利用如权利要求1-5中任一项所述的肿瘤组织/或细胞冻存试剂盒对肿瘤组织/或细胞进行冻存，所述肿瘤组织/或细胞冻存的处理方法包括：
S1、肿瘤组织/或细胞样本经1x磷酸盐缓冲液清洗2遍，去除包膜、血管及粘液性坏死组织；
S2、用所述肿瘤切块模具将肿瘤组织/或细胞进行切片，经1x磷酸盐缓冲液再次清洗；
S3、将切片后的肿瘤组织/或细胞先浸入5ml所述玻璃化液1，浸入时间10min；再浸入5ml所述玻璃化液2中，浸入时间10min；
S4、取出S3中玻璃化冻存后的肿瘤组织/或细胞并沥干，将肿瘤组织/或细胞迅速移入冻存管内，于无菌液氮罐中保存。
10.如权利要求9中所述肿瘤组织/或细胞冻存的处理方法，其特征在于：
所述S1中将肿瘤组织/或细胞样本进行血管、包膜及坏死组织的处理过程，被处理肿瘤组织/或细胞样本需完全浸入1x磷酸盐缓冲液中，且操作轻柔，避免肿瘤组织/或细胞样本损伤。
11.如权利要求9中所述肿瘤组织/或细胞冻存的处理方法，其特征在于：
所述S2中将肿瘤组织/或细胞进行切片，肿瘤组织/或细胞的切片为1×1×1mm。
12.如权利要求9中所述肿瘤组织/或细胞冻存的处理方法，其特征在于：
所述S4中将S3玻璃化冻存后的肿瘤组织/或细胞沥干并迅速移入冻存管，于液氮罐中保存。
13.一种对肿瘤组织/或细胞复苏的处理方法，其特征在于利用如权利要求6-7中任一项所述的肿瘤组织/或细胞复苏试剂盒对肿瘤组织/或细胞进行复苏，所述肿瘤组织/或细胞复苏的处理方法包括：
S11、将从液氮中取出的肿瘤组织/或细胞迅速浸入36-38℃水浴加热的10-20ml复苏液1中，浸入时间5-10min；
S22、将所述复苏液1处理后的肿瘤组织/或细胞取出并浸入5-10ml复苏液2中，浸入时间5-10min；
S33、将所述复苏液2处理后的肿瘤组织/或细胞取出并浸入5-10ml复苏液3中，浸入时间5-10min；
S44、将所述复苏液3处理后的肿瘤组织/或细胞用1x磷酸盐缓冲液清洗2遍，浸入无菌生理盐水，获得复苏后的肿瘤组织/或细胞。
14.如权利要求13中所述肿瘤组织/或细胞复苏的处理方法，其特征在于，
所述S11中将从液氮中取出的肿瘤组织/或细胞迅速浸入37℃水浴预热的10ml复苏液1中，浸入时间5min。
15.如权利要求13中所述肿瘤组织/或细胞复苏的处理方法，其特征在于，
所述S22中,将所述复苏液1处理后的肿瘤组织/或细胞转入5ml室温复苏液2，浸入时间5min；
所述S33中，将所述复苏液2处理后的肿瘤组织/或细胞浸入10ml室温复苏液3中，浸入时间10min。
16.一种对肿瘤组织/或细胞进行冻存和复苏的处理方法，利用如权利要求8所述的肿瘤组织/或细胞冻存和复苏试剂盒，所述肿瘤组织/或细胞的冻存和复苏的处理方法包括：
冻存处理，所述冻存处理包括：
S1、肿瘤组织/或细胞样本经1x磷酸盐缓冲液清洗2遍，去除包膜、血管及粘液性坏死组织；
S2、用所述肿瘤切块模具将肿瘤组织/或细胞进行切片，经1x磷酸盐缓冲液再次清洗；
S3、将切片后的肿瘤组织/或细胞先浸入5ml所述玻璃化液1，浸入时间10min；再浸入5ml所述玻璃化液2中，浸入时间10min；以及
S4、取出S3中玻璃化冻存后的肿瘤组织/或细胞并沥干，将肿瘤组织/或细胞迅速移入冻存管内，于无菌液氮罐中保存；
复苏处理，所述复苏处理包括：
S11、将从液氮中取出的肿瘤组织/或细胞迅速浸入36-38℃水浴加热的10-20ml复苏液1中，浸入时间5-10min；
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S44、将所述复苏液3处理后的肿瘤组织/或细胞用1x磷酸盐缓冲液清洗2遍，浸入无菌生理盐水，获得复苏后的肿瘤组织/或细胞。
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