CN113475499A - 一种小鼠全身组织灌流固定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肾脏免疫荧光染色技术领域技术领域，公开了一种有效改善观察小鼠肾脏原纤毛免疫荧光的灌注固定方法，包括：小鼠腹腔麻醉后，迅速开胸暴露心脏，在左心尖部开口，将连接有蠕动泵的灌注针头由开口插入左心室，在40‑60ul/s的流速下行全身恒速灌流一定量的PBS清洗和一定量的10%中性福尔马林固定，待小鼠全身僵硬，将小鼠肾脏取出，在10%中性福尔马林溶液中固定一定时间，使可发现小鼠肾脏原纤毛经恒速灌流后数量分布极大提高，与传统的简易全身组织灌流固定相对比，有原纤毛的细胞比例由55%提高到90‑98%，极大地提高了研究纤毛病变性疾病发病机制试验的正确性。同时，本申请技术方案实验操作重复性好，为后续研究纤毛病变性疾病发病机制打下良好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及肾脏免疫荧光染色技术领域，特别涉及一种用于改善观察小鼠肾脏原纤毛免疫荧光的小鼠全身组织灌流固定的方法。
背景技术
细胞原生纤毛是突出在细胞质膜的动态微管结构，它可以作为细胞感受器，适应胞外环境改变，维持细胞的正常生理功能。为了研究细胞原生纤毛病变性疾病发病机制，需要对其进行固定和染色，以便观察细胞原生纤毛。在石蜡切片免疫组化实验研究中，小鼠肾脏组织中的原纤毛分布及数量仅可通过免疫组织荧光染色观察，在免疫组化实验研究中，组织灌注固定效果对小鼠实验结果至关重要，只有良好的组织灌注固定效果才能提高免疫组织荧染色质量，进而才能获得良好的荧光染色效果，进而提高观察肾脏原纤毛真实数量和分布。
传统简易的小鼠肾脏组织灌流技术，虽然适用于小鼠HE染色的形态观察，但是一旦应用到免疫组化中，仅可观察到小鼠部分原纤毛分布，很大程度上影响实验结果的正确性。申请人通过不断创新试验研究，获得了本申请的小鼠全身组织灌流固定技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种有效改善观察小鼠肾脏原纤毛免疫荧光的灌注固定方法，可明显改善原纤毛免疫荧光染色质量，具有原纤毛免疫荧光染色效果好、操作重复性好和应用价值高的特点，为后续研究纤毛病变性疾病发病机制打下良好的基础。
为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案来实现：
一种有效改善观察小鼠肾脏原纤毛免疫荧光的灌注固定方法，包括：小鼠腹腔浅麻醉后，开胸暴露心脏并立即在左心尖部开口，将连接有蠕动泵的灌注针头由开口插入左心室并止血固定，在40-60ul/s的流速下依次行全身恒速灌流一定量的磷酸盐缓冲液PBS清洗和一定量的10%中性福尔马林固定，待小鼠全身僵硬，将小鼠肾脏取出，在10%中性福尔马林溶液中固定20-30h。
优选的：所述恒速灌流的环境温度为15-30℃，所述全身恒速灌流的PBS和10%中性福尔马林温度为20-25℃。
小鼠肾脏取出后，在15-25℃的10%中性福尔马林溶液中固定。
所述小鼠腹腔麻醉采用乌拉坦腹腔麻醉，不仅麻醉效果好，而且麻醉速度快。
所述左心尖部开口的大小为1.5-2.5mm，优选2mm，一方面有效保障液体灌输量和灌输效率，另一方面有效避免血液从开口漏出。
所述灌注针头的直径为0.8-1.5mm，优选1mm。一方面有效保障液体灌输量和灌输效率，另一方面有效避免血液循环系统破裂。
所述全身恒速灌流的流速优选50ul/s，当流速为50ul/s的时候，原纤毛免疫荧光染色效果最好，有原纤毛的细胞比例可达到98.2±0.8%。
所述蠕动泵优选采用Minipuls3蠕动泵。
本申请通过采用浅麻醉恒速灌流全身组织固定，在小鼠左心尖部开口，将连接有蠕动泵的灌注针头由开口插入左心室，在40-60ul/s的流速下先后行全身恒速灌流一定量的PBS清洗和一定量的10%中性福尔马林固定，并进一步结合将小鼠肾脏取出，在10%中性福尔马林溶液中固定20-30h，使可发现小鼠肾脏原纤毛经恒速灌流后数量分布极大提高。
并结合灌流温度的控制，采用本申请的灌注固定方法完成固定后，进行常规的原纤毛免疫组织荧光染色，原纤毛免疫荧光染色效果好，与传统简易的全身组织灌流固定相对比，有原纤毛的细胞比例得到有效提高，并通过对时间温度的控制，有原纤毛的细胞比例由55%提高到90-98%，极大地提高了研究纤毛病变性疾病发病机制试验的正确性。
同时，本申请技术方案实验操作重复性好，为后续研究纤毛病变性疾病发病机制打下良好的基础，应用价值高，值得广泛推广使用。
附图说明
图1为ARL13B免疫组化荧光染色结果；
图2为H-E 染色结果；
图3为ARL13B免疫组化荧光染色结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明具体结构。
传统简易小鼠全身灌注固定，即深度麻醉后打开胸腔，用小针头插入左心室，同时右心房开一孔放血，先用生理盐水洗涤注入血管洗涤，再将固定液注入。因此法较简，是小鼠组织HE染色观察组织形态结构常用手段，因此大多数研究人员，在观察肾脏形态变化或其他免疫组化实验时，会首选传统简易小鼠全身灌注固定方法。申请人以传统简易小鼠全身灌注固定方法为对比实验例，并采用相同的PBS缓冲液清洗代替传统简易小鼠全身灌注固定中所采用的生理盐水洗涤。
对比实验实施例
本实施例为传统简易全身组织灌流固定方案：用乌拉坦腹腔深度麻醉小鼠（8-10周），迅速开胸暴露心脏；处理灌注针头，剪除针尖，左手捏持心脏，右手持眼科剪在左心尖部剪开一小口，将灌注针沿小口插入左心室，止血钳固定。然后剪开右心房约0.3cm，利用50 ml 一次性注射器缓慢注射100ml PBS缓冲液清洗，最后再用100ml 10%中性福尔马林固定液灌注固定。
本申请技术方案优选实施例
一种有效改善观察小鼠肾脏原纤毛免疫荧光的灌注固定方法，包括：小鼠（8-10周）用乌拉坦腹腔浅麻醉后，迅速开胸暴露心脏，在左心尖部开0.15-0.25cm的小口，本实施例优选采用左心尖部开0.2cm的小口，将连接有蠕动泵的灌注针头由开口插入左心室，并用止血钳固定，在右心房用手术剪开口，直径约0.2cm，所述灌注针头的直径为0.8-1.6mm，本实施例优选采用1mm的灌注针头，并剪除其针尖，蠕动泵采用Minipuls3蠕动泵。
在15-30℃的环境温度下，以40-60ul/s的流速先后行全身恒速灌流温度为20-25℃的一定量的PBS清洗和一定量的10%中性福尔马林固定，本实施例中，在25℃的环境温度下，以50ul/s的流速先行全身恒速灌流50ml 25℃的PBS清洗，再在50ul/s的流速下行全身恒速灌流50ml 25℃的10%中性福尔马林固定。
待小鼠全身僵硬，将小鼠肾脏取出，在15-25℃的10%中性福尔马林溶液中固定20-30h，本实施例采用在20℃的10%中性福尔马林溶液中固定24h。
对比结果分析：
（一）共聚焦显微镜原纤毛观察结果：
肾脏经ARL13B免疫组化荧光染色，细胞核呈蓝色，原纤毛呈绿色。
参看图1，对比实验例传统简易全身组织灌流对照组（图1 A）中细胞原纤毛比例非常少（仅55.4±2.2%）与真实的肾脏原纤毛分布有非常大区别；而50ul/s恒速灌注固定组（图1B）中可以观察到正常数量的原纤毛（98.5±0.3%）。结果用均数±标准差 （mean±SD）表示， 采用单因素方差分析比较，差异具有显著性，P<0. 05。
说明本申请的恒速灌流固定技术是观察肾脏原纤毛的正确条件。
（二）H-E 染色光镜观察：
通常认为固定液流速对组织形态结构不会产生影响，然而恒速灌流却可以观察到清晰完整的原纤毛分布。其具体影响机制需进一步探讨，可能和影响肾脏原纤毛相关蛋白的稳定性相关。
参看图2，苏木精—伊红即H-E 染色光镜观察：细胞核呈蓝色，细胞质呈红色。通过图片对比可以发现，传统简易灌注（图2A）或50ul/s恒速（图2B）灌注固定对肾脏形态观察没有影响。
（三）不同流速对小鼠肾脏原纤毛细胞的影响：
申请人在本申请实施例方案基础上，以8组不同流速对小鼠行全身组织恒速灌流，每组6只小鼠，原纤毛免疫荧光染色结果如下：
| 有原纤毛细胞比例（%） | 55.3±4.2 | 69.2±3.6 | 75.5±3.1 | 90.3±1.5 | 98.2±0.8 | 92.3±2.1 | 68.5±1.3 | 59.2±1.3 |
| 流速（ul/s） | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 80 | 100 |
由上表对比结果，恒速灌流的流速在40-60ul/s时染色效果相对最好，有原纤毛的细胞比例可以达到90%以上，当恒速灌流的流速为50ul/s的时候，原纤毛免疫荧光染色效果最好，有原纤毛的细胞比例可达到98.2±0.8%。结果用均数±标准差 （mean±SD） 表示，采用单因素方差分析比较，40ul/s、50ul/s、60ul/s组与10ul/s、20ul/s、30ul/s、80ul/s、100ul/s组相比，差异具有显著性，P<0. 05。
（四）小鼠肾脏固定时间的影响：
全身恒速灌流结束之后，肾脏需用10%中性福尔马林溶液固定20-30h。参看图3，低于20h（12h，图3B），肾脏组织固定不充分，原纤毛细胞比例仅（54±3.6%）；多于30h（48h, 图3C），肾脏原纤毛相关蛋白活性下降，原纤毛细胞比例为75±2.8%。在24h（图3A）固定时间内，原纤毛细胞比例为97±3.5%，原纤毛显色良好。结果用均数±标准差 （mean±SD） 表示， 采用单因素方差分析比较，24h组与12h组和48h组相比，差异具有显著性，P<0. 05。
（五）全身恒速灌流环境温度的影响：
申请人在本申请实施例方案基础上，以不同环境温度下对小鼠行全身组织50ul/s恒速灌流，原纤毛免疫荧光染色结果如下：
| 有原纤毛细胞比例（%） | 90.3±1.2 | 94.5±0.9 | 98.6±0.7 | 98.7±0.5 | 98.6±0.6 | 97.2±0.2 | 93.3±0.4 | 91.2±0.5 |
| 灌流环境温度 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 |
由上表对比结果来看，环境温度恒速灌流的影响不大，但15-30℃的环境温度，灌流固定效果更好，结果用均数±标准差 （mean±SD） 表示， 采用单因素方差分析比较，优选组15、20、30℃组与其他组相比，差异具有显著性，P<0. 05。
（六）全身恒速灌流的PBS和10%中性福尔马林的温度的影响：
申请人在本申请实施例方案基础上，以不同温度的PBS和10%中性福尔马林对小鼠行全身组织50ul/s恒速灌流，原纤毛免疫荧光染色结果如下：
| 有原纤毛细胞比例（%） | 85.2±0.5 | 88.1±0.6 | 92.8±0.3 | 97.9±0.4 | 98.8±0.2 | 90.2±0.4 | 91.6±0.2 | 62.3±0.9 |
| PBS和10%中性福尔马林温度（℃） | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 |
由上表对比结果，全身恒速灌流的PBS和10%中性福尔马林的温度在20-25℃时，原纤毛免疫荧光染色固定效果更好。结果用均数±标准差 （mean±SD） 表示， 采用单因素方差分析比较，优选20、25℃组与其他组相比，差异具有显著性，P<0. 05。
（七）小鼠肾脏固定温度的影响：
申请人在本申请实施例方案基础上，以不同固定液温度对小鼠行全身组织恒速灌流后取出的肾脏进行固定24h，原纤毛免疫荧光染色结果如下：
| 有原纤毛细胞比例（%） | 94.2±1.2 | 95.6±0.8 | 97.3±0.6 | 98.8±0.3 | 98.6±0.4 | 94.6±0.5 | 93.5±0.6 | 84.6±1.7 | 69.5±1.2 |
| 肾脏固定用10%中性福尔马林温度（℃） | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 |
由上表对比结果来看，10%中性福尔马林的温度对小鼠肾脏固定的影响不大，但在15-25℃温度下固定效果更好。不建议温度超过40℃。结果用均数±标准差 （mean±SD） 表示， 采用单因素方差分析比较，优选组15、20、25℃组与5、10、40、45℃组相比，差异具有显著性，P<0. 05。
上述实施例仅描述了本发明的部分实施例，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化、等同替换和改进，这些变化、等同替换和改进都落入本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种有效改善观察小鼠肾脏原纤毛免疫荧光的灌注固定方法，其特征在于：包括以下操作：小鼠腹腔浅麻醉后，开胸暴露心脏并立即在左心尖部开口，将连接有蠕动泵的灌注针头由开口插入左心室并止血固定，在40-60ul/s的流速下依次行全身恒速灌流一定量的PBS清洗和一定量的10%中性福尔马林固定，待小鼠全身僵硬，将小鼠肾脏取出，在10%中性福尔马林溶液中固定20-30h。
2.如权利要求1所述的灌注固定方法，其特征在于：所述恒速灌流的环境温度为15-30℃。
3.如权利要求1所述的灌注固定方法，其特征在于：所述全身恒速灌流的PBS和10%中性福尔马林温度为20-25℃。
4.如权利要求1所述的灌注固定方法，其特征在于：小鼠肾脏取出后，在15-25℃的10%中性福尔马林溶液中固定。
5.如权利要求1所述的灌注固定方法，其特征在于：所述左心尖部开口的大小为1.5-2.5mm，优选所述左心尖部开口的大小为2mm。
6.如权利要求1所述的灌注固定方法，其特征在于：所述灌注针头的直径为0.8-1.6mm，优选所述灌注针头的直径为1mm。
7.如权利要求1所述的灌注固定方法，其特征在于：所述全身恒速灌流的流速优选50ul/s。
8.如权利要求1所述的灌注固定方法，其特征在于：所述蠕动泵优选采用Minipuls3蠕动泵。
9.如权利要求1所述的灌注固定方法，其特征在于：小鼠肾脏取出，在10%中性福尔马林溶液中固定24h。
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| CN114323878A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-04-12 | 上海益诺思生物技术股份有限公司 | 一种用于肝微核试验的福尔马林固定法 |
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