CN111434687A - 一种新型的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型的抗体及其应用，所述抗体为能够抑制或减弱IL33介导的信号传递的抗体或结合片段。所述抗体包括轻链L链和重链H链，L链和H链的序列参见说明书表1、表2和序列表。所述抗体为含有上述的序列的单克隆抗体，该单克隆抗体包括人鼠嵌合体单克隆抗体和/或鼠源化单克隆抗体。一种抑制剂或药物，所述抑制剂或药物包括以上所述的抗体。该抑制剂或药物能够治疗、预防或减轻与IL33相关疾病的药物。本申请的抗体具有高亲和力、强生物中和活性以及稳定性好的优势。

Description

一种新型的抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术医药领域，具体涉及一种新型的抗体及其应用。
背景技术
IL33是2005年发现的一个属于IL1家族的新成员。人源IL33基因定位在染色体9p24.1上，编码270个氨基酸。全长的IL33分子量大小约为30KDa，经剪切后成为大小约为18KDa的成熟蛋白。在人多种组织的平滑肌细胞，以及气管和支气管上皮细胞中，IL33是组成型表达的。而在肺组织纤维细胞及真皮的角质细胞中，IL33可被TNF-α的刺激下诱导表达。
IL33具有双重生物学功能，在正常生理情况下，IL33以全长的形式定位在细胞核中发挥转录因子的作用，调控其他基因的表达。一旦细胞受到刺激或损伤，IL33就会从细胞核中转移到胞质中，进而被剪切为成熟的蛋白，发挥细胞因子的作用。成熟的IL33与其受体ST2分子结合，激活NF-kB通路，刺激IL5、IL13等促炎因子的产生。成熟的IL33像一个“警报素”一样，在机体受体损伤时释放出来，招募并激活多种免疫细胞如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、Th2细胞等释放细胞因子引起炎症反应。
IL33/ST2信号通路与人类多种疾病相关，如哮喘、类风湿性关节炎、败血症、心脏疾病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤等。以IL33以靶标研发抗体药物，对于治疗相关疾病具有重大意义，因此，研发出具有高亲和力、强生物中和活性、稳定性好的IL33抗体序列具有重要意义。因此我们开展了本项研究工作。
发明内容
有鉴于此，发明的目的是提供一种抗体及其应用，以实现获得高亲和力、强生物中和活性、稳定性好的IL33抗体。
发明的目的是通过以下技术方案来实现：
本发明的一个目的为提供一种抗体，所述抗体为能够抑制或减弱IL33介导的信号传递的抗体或结合片段。所述抗体包括轻链L链和重链H链，所述L链的第一高变区LHVR1选自表1中SEQ1～SEQ12中的LHVR1列中的任意一个序列，所述L链的第二高变区LHVR2选自序列表1中SEQ1～SEQ12中的LHVR2列中的任意一个序列，所述L链的第三高变区LHVR3选自表1中SEQ1～SEQ12中的LHVR3列中的任意一个序列。所述H链包括高变区HHVR1、HHVR2和HHVR3，所述H链的第一高变区HHVR1选自表1中SEQ1～SEQ12中的HHVR1列中的任意一个序列，所述H链的第二高变区HHVR2选自表1中SEQ1～SEQ12中的HHVR2列中的任意一个序列，所述H链的第三高变区HHVR3选自表1中SEQ1～SEQ12中的HHVR3列中的任意一个序列。
所述抗体的轻链包括轻链第一骨架区LFR1区、轻链第二骨架区LFR2区和轻链第三骨架区LFR3区，LFR1区选自表2中SEQ(1)～SEQ(12)中的LFR1列中的任意一个序列，所述LFR2选自表2中SEQ1～SEQ12中的LFR2列中的任意一个序列，所述LFR3选自表2中SEQ1～SEQ12中的LFR3列中的任意一个序列。所述抗体的重链包括重链第一骨架区HFR1区、重链第二骨架区HFR2区和重链第三骨架区HFR3区，HFR1区选自表2中SEQ(1)～SEQ(12)中的HFR1列中的任意一个序列，所述HFR2选自表2中SEQ1～SEQ12中的HFR2列中的任意一个序列，所述HFR3选自表2中SEQ1～SEQ12中的HFR3列中的任意一个序列。
所述抗体为含有上述的序列的人鼠嵌合体单克隆抗体和/或鼠源化单克隆抗体。
本发明的另一个目的为提供一种能够编码所述抗体的基因分子，所述基因分子为能够编码所述的抗体的碱基序列。
本发明的又一个目的为提供一种表达载体，所述载体为包含所述基因片段或基因序列的表达载体。
本发明的还有一个目的为提供一种宿主细胞，所述宿主细胞为包含以上任意一项所述的抗体、以上所述的碱基序列或以上所述的表达载体的宿主细胞。
本发明的再一个目的为提供一种(IL33抗原表位)抑制剂，所述抑制剂包括以上所述的抗体。
本发明的最后一个目的为提供一种药物，所述药物包括以上所述的抗体，该药物为能够治疗、预防或减轻与IL33相关疾病的药物。
发明提供了一种抗体及其应用，其至少具有以下有益效果：本发明的抗体的亲和力非常好、生物中和活性强，且稳定性好。
该抗体的浓度可低至pmol级别，其亲和力可与赫赛汀相媲美，非常惊喜，而且结合力稳定。这对于抗体发挥药物作用具有极其重要的作用。而且本申请的中和活性也非常好，其能够中和IL33协同LPS刺激巨噬细胞(PM)诱导产生IL6和TNF-α的生物活性，抑制效果明显。还能够中和IL6在肥大细胞和骨髓细胞中的表达，并可中和OVA诱发的哮喘，其能够降低支气管肺泡灌洗液中细胞总数及蛋白含量，效果显著，等等。此外，本申请中抗体的Tm值较高，抗体热稳定性好。因此，本申请中的抗体具有极大的制备成抗体药的潜在药用价值，并可以治疗、预防或减轻与IL-33相关疾病，如哮喘、类风湿性关节炎、败血症、心脏疾病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤的药物等等。
附图说明
图1为抗体中和IL33协同LPS诱导巨噬细胞产生IL6的示意图；
图2为抗体中和IL33协同LPS诱导巨噬细胞产生TNF-α的示意图；
图3为所诱导的肥大细胞的纯度示意图；
图4为在检测IL6的量时所绘制的ELISA标准曲线图；
图5为用所诱导的肥大细胞测试IL33抗体的阻断活性的示意图；
图6为用所诱导的肥大细胞测试IL33抗体的阻断活性的另一个示意图；
图7为IL33抗体可中和IL6在骨髓细胞中的表达；
图8为反映了IL33抗体治疗OVA诱导的哮喘模型的有效性；
图9为抗体中和OVA诱发的哮喘的示意图；
图10为抗原抗体结合情况示意图；
图11为McAb-IL33的不同稀释浓度的结合状况示意图；
图12为CA-IL33的不同稀释浓度的结合状况示意图；
图13为所拟合的正态分布标准曲线；
图14为本申请中抗体的Tm值的检测示意图；
图15为轻链或重链的可变区中骨架区和高变区的相对位置设置示意图。
具体实施方式
下面对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下提供的发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的发明的范围，而是仅仅表示发明的选定实施例。基于发明中的实施例，本领域普通方法人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于发明保护的范围。
实施例1
一种抗体，所述抗体为能够抑制或减弱IL33介导的信号传递的抗体或结合片段。该抗体包括轻链L链和重链H链。
所述抗体包括具有免疫原性的高变区(HVR区)，L链的高变区包括L链第一高变区LHVR1、L链第二高变区LHVR2和L链第三高变区LHVR3；所述LHVR1选自序列SEQ1～SEQ12中LHVR1列中的任意一个序列，所述LHVR2选自序列SEQ1～SEQ12中LHVR2列中的任意一个序列，所述LHVR3选自序列SEQ1～SEQ12中LHVR3列中的任意一个序列。
H链的高变区包括H链第一高变区HHVR1、H链第二高变区HHVR2和H链第三高变区HHVR3，所述HHVR1选自序列SEQ1～SEQ12中HHVR1列中的任意一个序列，所述HHVR2选自序列SEQ1～SEQ12中HHVR2列中的任意一个序列，所述HHVR3选自序列SEQ1～SEQ12中HHVR3列中的任意一个序列。具体参见表1所示。
表1抗体轻链重链的高变区序列
Figure BDA0001946312090000041
Figure BDA0001946312090000051
作为优选的实施方式，所述抗体L链为以下(1)～(12)中任一项中所述的L链：(1)由SEQ1所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，(2)由SEQ2所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，(3)由SEQ3所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，(4)由SEQ4所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，(5)由SEQ5所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，(6)由SEQ6所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，(7)由SEQ7所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，(8)由SEQ8所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，(9)由SEQ9所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，(10)由SEQ10所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，(11)由SEQ11所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，或(12)由SEQ12所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链。
所述抗体H链为以下(1)～(12)中任一项中所述的H链：(1)由SEQ1所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，(2)由SEQ2所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，(3)由SEQ3所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，(4)由SEQ4所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，(5)由SEQ5所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，(6)由SEQ6所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，(7)由SEQ7所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，(8)由SEQ8所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，(9)由SEQ9所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，(10)由SEQ10所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，11)由SEQ11所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，或(12)由SEQ12所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链。
作为进一步优选的实施方式，所述抗体的高变区HVR区(即CDR区)为以下(1)～(12)中任一项中所述的HVR区：(1)由SEQ1所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、(2)由SEQ2所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、(3)由SEQ3所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、(4)由SEQ4所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、(5)由SEQ5所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、(6)由SEQ6所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、(7)由SEQ7所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、(8)由SEQ8所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、(9)由SEQ9所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、(10)由SEQ10所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、(11)由SEQ11所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区或(12)由SEQ12所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区。
在本实施例中，由于高变区是决定免疫原性的主要区域，故含有上述高变区的序列，则相应抗体的亲和力较好，能够与IL33进行有效结合，并可抑制或减弱IL-33介导的信号传递。
实施例2
在实施例1的基础上，所述抗体还包括骨架区(FR)，轻链的骨架区包括轻链第一骨架区(LFR1区)、轻链第二骨架区(LFR2区)和轻链第三骨架区(LFR3区)，LFR1区选自序列SEQ(1)～SEQ(12)中LFR1列中的任意一个序列，所述LFR2选自序列SEQ1～SEQ12中LFR2列中的任意一个序列，所述LFR3选自序列SEQ1～SEQ12中LFR3列中的任意一个序列。
重链的骨架区包括重链第一骨架区(HFR1区)、重链第二骨架区(HFR2区)和重链第三骨架区(HFR3区)，HFR1区选自序列SEQ(1)～SEQ(12)中HFR1列中的任意一个序列，所述HFR2选自序列SEQ1～SEQ12中HFR2列中的任意一个序列，所述HFR3选自序列SEQ1～SEQ12中HFR3列中的任意一个序列。
轻链或重链的可变区中框架区和高变区的相对设置位置如图15所示。所述H链和L链的骨架区的序列如表2所示，表2中的序列号1～序列号72的序列参见序列表。
表2可变区中骨架区的序列表
Figure BDA0001946312090000061
Figure BDA0001946312090000071
作为优选的实施方式，所述轻链的骨架区为以下(1)～(12)中任一项中所述的轻链骨架区：(1)由SEQ(1)所在行的LFR1、LFR2和LFR3构成的轻链骨架区，即序列号37、序列号38和序列号39构成的轻链骨架区；(2)由SEQ(2)所在行的LFR1、LFR2和LFR3构成的轻链骨架区，即序列号40、序列号41和序列号42构成的轻链骨架区；(3)由SEQ(3)所在行的LFR1、LFR2和LFR3构成的轻链骨架区，即序列号43、序列号44和序列号45构成的轻链骨架区；(4)由SEQ(4)所在行的LFR1、LFR2和LFR3构成的轻链骨架区，即序列号46、序列号47和序列号48构成的轻链骨架区；(5)由SEQ(5)所在行的LFR1、LFR2和LFR3构成的轻链骨架区，即序列号49、序列号50和序列号51构成的轻链骨架区；(6)由SEQ(6)所在行的LFR1、LFR2和LFR3构成的轻链骨架区，即序列号52、序列号53和序列号54构成的轻链骨架区；(7)由SEQ(7)所在行的LFR1、LFR2和LFR3构成的轻链骨架区，即序列号55、序列号56和序列号57构成的轻链骨架区；(8)由SEQ(8)所在行的LFR1、LFR2和LFR3构成的轻链骨架区，即序列号58、序列号59和序列号60构成的轻链骨架区；(9)由SEQ(9)所在行的LFR1、LFR2和LFR3构成的轻链骨架区，即序列号61、序列号62和序列号63构成的轻链骨架区；(10)由SEQ(10)所在行的LFR1、LFR2和LFR3构成的轻链骨架区，即序列号64、序列号65和序列号66构成的轻链骨架区；(11)由SEQ(11)所在行的LFR1、LFR2和LFR3构成的轻链骨架区，即序列号67、序列号68和序列号69构成的轻链骨架区；或(12)由SEQ(12)所在行的LFR1、LFR2和LFR3构成的轻链骨架区，即序列号70、序列号71和序列号72构成的轻链骨架区。
所述重链的骨架区为以下(1)～(12)中任一项中所述的骨架区：(1)由SEQ(1)所在行的HFR1、HFR2和HFR3构成的重链骨架区，即序列号1、序列号2和序列号3构成的重链骨架区；(2)由SEQ(2)所在行的HFR1、HFR2和HFR3构成的重链骨架区，即序列号4、序列号5和序列号6构成的重链骨架区；(3)由SEQ(3)所在行的HFR1、HFR2和HFR3构成的重链骨架区，即序列号7、序列号8和序列号9构成的轻链骨架区；(4)由SEQ(4)所在行的HFR1、HFR2和HFR3构成的重链骨架区，即序列号10、序列号11和序列号12构成的重链骨架区；(5)由SEQ(5)所在行的HFR1、HFR2和HFR3构成的重链骨架区，即序列号13、序列号14和序列号15构成的重链骨架区；(6)由SEQ(6)所在行的HFR1、HFR2和HFR3构成的重链骨架区，即序列号16、序列号17和序列号18构成的重链骨架区；(7)由SEQ(7)所在行的HFR1、HFR2和HFR3构成的重链骨架区，即序列号19、序列号20和序列号21构成的重链骨架区；(8)由SEQ(8)所在行的HFR1、HFR2和HFR3构成的重链骨架区，即序列号22、序列号23和序列号24构成的重链骨架区；(9)由SEQ(9)所在行的HFR1、HFR2和HFR3构成的重链骨架区，即序列号25、序列号26和序列号27构成的重链骨架区；(10)由SEQ(10)所在行的HFR1、HFR2和HFR3构成的重链骨架区，即序列号28、序列号29和序列号30构成的重链骨架区；(11)由SEQ(11)所在行的HFR1、HFR2和HFR3构成的重链骨架区，即序列号31、序列号32和序列号33构成的重链骨架区；或(12)由SEQ(12)所在行的HFR1、HFR2和HFR3构成的重链骨架区，即序列号34、序列号35和序列号36构成的重链骨架区。
作为进一步优选的实施方式，所述抗体的骨架区为以下(1)～(12)中任一项中所述的骨架区：(1)由SEQ(1)所在行的L链骨架区(即包括LFR1、LFR2和LFR3)和H链骨架区(即包括HFR1、HFR2和HFR3)构成的骨架区、(2)由SEQ(2)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、(3)由SEQ(3)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、(4)由SEQ(4)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、(5)由SEQ(5)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、(6)由SEQ(6)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、(7)由SEQ(7)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、(8)由SEQ(8)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、(9)由SEQ(9)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、(10)由SEQ(10)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、(11)由SEQ(11)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区，或(12)由SEQ(12)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区。本自然段所述的L链骨架区包括其所在行的LFR1、LFR2和LFR3，H链骨架区包括其所在行的HFR1、HFR2和HFR3。
作为进一步优选的实施方式，所述抗体为包含以下(1)～(12)中任一项中所述的可变区的抗体：(1)所述抗体包括由SEQ1所在行中的高变区(HVR区)和SEQ(1)所在行中的骨架区构成的可变区，即由SEQ1和SEQ(1)构成的H链可变区和对应L链可变区的序列分别见序列101和序列121所示；(2)所述抗体包括由SEQ2中的CDR区(即HVR区，下同)和SEQ(2)中的骨架区构成的可变区，即由SEQ2和SEQ(2)构成的H链可变区和对应L链可变区的序列分别见序列102和序列122所示；(3)所述抗体包括由SEQ3中的CDR区和SEQ(3)中的骨架区构成的可变区，即由SEQ3和SEQ(3)构成的H链可变区和对应L链可变区的序列分别见序列103和序列123所示；(4)所述抗体包括由SEQ4中的CDR区和SEQ(4)中的骨架区构成的可变区，即由SEQ4和SEQ(4)构成的H链可变区和对应L链可变区的序列分别见序列104和序列124所示；(5)所述抗体包括由SEQ5中的CDR区和SEQ(5)中的骨架区构成的可变区，即由SEQ5和SEQ(5)构成的H链可变区和对应L链可变区的序列分别见序列105和序列125所示；(6)所述抗体包括由SEQ6中的CDR区和SEQ(6)中的骨架区构成的可变区，即由SEQ6和SEQ(6)构成的H链可变区和对应L链可变区的序列分别见序列106和序列126所示；(7)所述抗体包括由SEQ7中的CDR区和SEQ(7)中的骨架区构成的可变区，即由SEQ7和SEQ(7)构成的H链可变区和对应L链可变区的序列分别见序列107和序列127所示；(8)所述抗体包括由SEQ8中的CDR区和SEQ(8)中的骨架区构成的可变区，即由SEQ8和SEQ(8)构成的H链可变区和对应L链可变区的序列分别见序列108和序列128所示；(9)所述抗体包括由SEQ9中的CDR区和SEQ(9)中的骨架区构成的可变区，即由SEQ9和SEQ(9)构成的H链可变区和对应L链可变区的序列分别见序列109和序列129所示；(10)所述抗体包括由SEQ10中的CDR区和SEQ(10)中的骨架区构成的可变区，即由SEQ10和SEQ(10)构成的H链可变区和对应L链可变区的序列分别见序列110和序列130所示；(11)所述抗体包括由SEQ11中的CDR区和SEQ(11)中的骨架区构成的可变区，即由SEQ11和SEQ(11)构成的H链可变区和对应L链可变区的序列分别见序列111和序列131所示；(12)所述抗体包括由SEQ12中的CDR区和SEQ(12)中的骨架区构成的可变区，即由SEQ12和SEQ(12)构成的H链可变区和对应L链可变区的序列分别见序列112和序列132所示。序列101-序列112以及序列121-132参见序列表中的序列。
作为更进一步优选的实施方式，所述抗体为包括由SEQ5所在行中的HVR区和SEQ(5)所在行中的骨架区构成的可变区(即包括序列105和序列125构成的可变区)、由SEQ6所在行中的HVR区和SEQ(6)所在行中的骨架区构成的可变区(即包括序列106和序列126构成的可变区)、由SEQ7所在行中的HVR区和SEQ(7)所在行中的骨架区构成的可变区(即包括序列107和序列127构成的可变区)或由SEQ8所在行中的HVR区和SEQ(8)所在行中的骨架区构成的可变区的抗体(即包括序列108和序列128构成的可变区)。
实施例3
在实施例1的基础上，所述抗体为人鼠嵌合体单克隆抗体或鼠源化单克隆抗体，该人鼠嵌合抗体或鼠源化单克隆抗体的序列包含实施例1中的高变区的序列或包含实施例2中所述的可变区的序列。即无论人鼠嵌合抗体还是鼠源化单克隆抗体，其可变区的序列为实施例1或2中所述的蛋白序列。
鼠源单克隆抗体的恒定区来源于鼠源抗体的恒定区，人鼠嵌合抗体的恒定区为人源抗体的恒定区。但无论鼠源还是人源，由于其恒定区通常没有不具有识别结合抗原的作用，且鼠源单克隆抗体的恒定区与鼠源其它抗体的序列一致，人鼠嵌合抗体的恒定区与人源其它抗体的恒定区序列一致，故恒定区的序列参见现有技术的便可，其对本申请中抗体与抗原的结合没有影响。
实施例4
在实施例1-3中任意一项的基础上，一种能够编码所述抗体的核酸分子，所述基核酸分子为能够编码所述的抗体的碱基序列或基因片段。
实施例5
在实施例4中任意一项的基础上，一种表达载体，所述载体为包含所述基因片段或基因序列的表达载体。
实施例6
在实施例5中任意一项的基础上，一种宿主细胞，所述宿主细胞为包含以上任意一个实施例所述的抗体、实施例4所述的碱基序列或实施例5所述的表达载体的宿主细胞。
实施例7
一种IL33抗原表位的抑制剂，所述抑制剂包括实施例1或2或3中所述的抗体。
实施例8
一种药物，所述药物包括实施例1～4中任一项所述的抗体，该药物为能够治疗、预防或减轻与IL-33相关疾病的药物。
所述药物可包括治疗或减缓哮喘、类风湿性关节炎、败血症、心脏疾病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤的药物。
实施例9
在实施例1-3中任意一项的基础上，所述抗体的制备方法为：根据上述任意实施例所述的抗体序列，进行人工合成，合成方法按目前常规方法便可，只要能够保证该序列与上述实施例中的抗体序列一致便可。当然，采用其它方法合成也可以，如生物方法或生物和化学方法结合等等均可，只要保证起序列与本申请所要保护的序列一致便可。
实施例10
在实施例3的基础上，抗人源IL33的鼠源单克隆抗体的制备方法可参见如下方法：
1、免疫小鼠
主要实验材料：PBS、人源IL33抗原、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、6～8周大雌鼠、注射器、ELISA检测相关试剂。
步骤如下所示：(1)第一次免疫：将含有25～100ug抗原的PBS溶液与等体积的弗氏完全佐剂乳化，总体积200～400ul，皮下注射1只小鼠。每次免疫一般需要3～5只鼠。(2)3周后进行第二次加强免疫：每只小鼠抗原量10ug～50ug，与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，免疫方法同步骤1)。(3)2周后第三次免疫：每只小鼠抗原量10ug～50ug，与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，免疫方法同步骤1)。(4)1周后尾部取血100ul左右，取血清进行抗体的滴度检测，若抗体的滴度偏低，要每两周继续免疫。免疫后1周取血检测。(5)当抗体滴度达到2万，进行加强免疫。一般需要在最后一次免疫后2周，融合前3天进行，腹腔注射含10～50ug抗原的PBS。3天后，准备取脾脏进行下一步的细胞融合。
2、骨髓瘤细胞的准备
实验材料：Sp2/0鼠骨髓瘤细胞系、DMEM完全培养基、20ug/ml 8-氮鸟嘌呤、T25，T75培养瓶、37℃，8％CO2培养箱、倒置显微镜。实验步骤：(1)从液氮中复苏Sp2/0；(2)用完全培养基在37℃，8％CO2培养箱培养过夜；(3)倒置显微镜观察细胞，确保细胞正常生长；(4)为了保证sp2/0细胞对氨蝶呤的敏感性，在培养时添加20ug/ml 8-氮鸟嘌呤，在融合前1周不加8-氮鸟嘌呤。Sp2/0细胞的接种浓度为2.5～5x104个/ml最佳，其生长的最大浓度是9x105个/ml，倍增时间是10～15h，当达到此浓度时，细胞活力急剧下降，2～3d传一次代，1:10～1:20的比例。(5)融合前用新鲜培养基将细胞稀释至2x105个/ml保证次日细胞处于生长期，台盼蓝染色测试活性，融合需要的细胞总量1x107个/ml。
3、饲养层细胞的准备
实验材料：0.34M蔗糖溶液，无菌预冷(或者DMEM)、小鼠(任何品系)、70％乙醇、HAT预冷的培养基、无菌的PBS、10ml注射器，18G针头、50ml离心管、解剖板、无菌镊子剪刀、96孔板、8％CO2培养箱。实验步骤：(1)在杀小鼠前，用10ml注射器(18G针头)抽取8ml预冷的蔗糖溶液。(2)50ml离心管置于冰上预冷。(3)颈脱臼处死小鼠；(4)将小鼠浸没在70％乙醇溶液中100ml小烧杯中；(5)将小鼠摆在解剖板上；(6)剪断隔膜层，将皮肤拨到后面，暴露出肋骨和腹腔较低的部分。(7)将针头插入胸骨底部的腹腔，将针头的尖端停留在肝脏的上面，推进蔗糖溶液，轻轻挤压腹部2～3次。(8)尽量多的吸取溶液，收集腹膜饲养细胞。(注意不要刺穿消化道器官，防止排泄物的污染)；(9)转移包含饲养细胞的蔗糖溶液至50ml离心管中；(10)在超净台中加入20ml预冷的HAT培养基；(11)室温100g离心5min；(12)用1ml预冷的HAT培养基重悬细胞沉淀，通过台盼蓝染色判断细胞的活力。(13)用预冷的HAT培养基重悬细胞，稀释至终浓度为1x105个/ml；(14)96孔板，周围36孔加100ul无菌PBS，内部60孔加细胞悬液100ul每孔。(15)将孔板置于37℃，8％CO2，湿度是98％的培养箱中。
4、脾细胞与骨髓瘤细胞的融合及培养
实验材料：免疫过的小鼠、对数生长期的Sp2/0细胞、70％酒精、完全的DMEM培养基、PEG4000(Merck)溶液或者PEG1500(sigma)、HAT培养基、HT培养基、PBS、15ml和50ml离心管、玻璃或金属的有盖容器、解剖板、10.5cm无菌剪刀、10.5cm无菌镊子、直径为60mm和100mm的细胞培养皿、无菌的不锈钢细胞过滤筛、带有26G号针头的3ml玻璃注射器、5ml移液管、37度水浴锅、秒表、8％CO2，湿度培养箱、96孔板、倒置显微镜。
实验步骤：
一、骨髓瘤和脾细胞的准备：(1)在杀小鼠取脾细胞之前，转移1x107个鼠的骨髓瘤细胞至50ml离心管，台盼蓝染色检测活细胞的比例。(2)猝死小鼠前眼球取血，收集血液样品至离心管保存。(3)将猝死的小鼠浸没到70％的酒精中，并放置在解剖板上。(4)用无菌的镊子提起胸腔区域的皮肤，用无菌剪剪断，将两边的皮肤都剥开，暴露出左边的胸腔。(5)用另外一套无菌的剪刀镊子将小鼠的脾脏从腹腔的左上方取出，脾脏是一个小而黑红色的器官。(6)将脾脏置于含有3ml完全DMEM培养基的60mm直径的培养皿中。(7)将盛放脾脏的培养皿转移至超净台，用一套无菌的剪刀镊子小心地将脾脏表面的脂肪和其他组织剥离干净。(8)将脾脏转移到细胞过滤筛中，将筛子置于含有10ml DMEM的100mm的培养皿中。(9)使用3ml注射器带有26G针头，将2ml DMEM注射到脾脏的不同位置。(10)用无菌剪将充满DMEM的脾脏剪3～4处。(11)用3ml注射器的栓塞将脾脏撵至只剩下纤维组织保留在筛子的表面，被碾压通过筛子的组织被收集在下面的无菌培养皿中。(12)用2ml完全DMEM培养基漂洗筛子一次。(13)将脾细胞悬液转移到15ml离心管中，用5ml的移液管吹打几次使结团分开。(14)将悬液在室温静置3min。(15)转移95％的细胞悬液至15ml离心管中。(16)使用台盼蓝染色检测活细胞的数目，记录活细胞的比例。忽略掉红细胞，其大小明显小于有核细胞。(17)转移1x108个活的脾细胞至15ml离心管中。(18)用完全DMEM培养基将杂交瘤细胞漂洗2遍，200g离心5min，5ml完全培养基重悬细胞。(19)将脾细胞加到骨髓瘤细胞的50ml离心管中，加满DMEM。(20)200g室温离心5min。(21)同上用50ml DMEM重悬细胞沉淀，离心。(22)将离心管放在小烧杯中，置于37度水浴锅温浴2min。(23)轻弹管底使沉淀松散。
二、细胞融合：(24)使用无菌的PEG溶液融合脾细胞和骨髓瘤细胞：①在第1min内，加1ml37度预热的PEG溶液，轻轻混合，边旋转管子边加PEG溶液。②2min中内，100g离心，离心总时间2min。③3min内逐滴加入4.5ml完全DMEM。④2min内再加入5ml完全DMEM。⑤加满完全DMEM。(25)100g室温离心5min。(26)除去上清；(27)使用35ml HAT选择培养基重悬细胞沉淀；(28)将细胞悬液置于37度，8％CO2，98％湿度的培养箱中，至少30min。
三、融合后细胞的铺板和培养：(29)96孔板中心的60个，每孔加100ul细胞悬液，周围的30孔，每孔加100ul无菌的PBS。24h前，每孔要接种1x104个饲养细胞，100ul HAT培养基。(30)将96孔板在37度，8％CO2，98％相对湿度的培养箱中培养，此为第1d。(31)在培养的第5d，每孔加100ul的HAT培养基。(32)在培养的第7d，每孔弃掉100ul旧的培养基，补加100ul新鲜培养基。(33)每隔1天，重复第32步，直到每孔内细胞的汇合率达到10％～50％，此时可开始检测抗体。(34)用HAT选择培养基培养杂交瘤细胞2周；(35)两周后换成HT培养基；(36)在前两轮克隆培养杂交瘤细胞的过程中均使用HT培养基。
5、有限稀释法克隆杂交瘤细胞
将细胞稀释成8个/ml的浓度挑单克隆，能获得36％孔有单细胞，当细胞汇合率达到10％～50％时做ELISA检测抗体。
实验材料：HAT培养基、HT培养基、完全培养基、96孔板、CO2培养箱、冻存管、2,5,10ml移液管、移液器和枪头、倒置显微镜、额外的试剂和仪器：小鼠饲养层细胞，ELISA，台盼蓝染色。
实验步骤：
(1)在做细胞克隆前一天，分离小鼠饲养层细胞并用适合的培养基接种饲养层细胞至96孔板。(培养基的选择要根据不同的克隆阶段，第一次克隆要用HAT培养基，第二次克隆要用HT培养基，之后的克隆用完全培养基)。(2)用ELISA检测出上清中含有识别特异抗原的抗体的孔，并将每个阳性孔内细胞吹打重悬，血球计数板进行密度的测定。取出需要的细胞量，剩余的阳性细胞可以冻存起来。(3)对细胞悬液进行逐级稀释，每次稀释的倍数不要超过100倍；直到最小浓度8个细胞/ml。(4)将第1步准备好的96孔板，用排枪将里面60孔的上面50个加100ul/孔的8个/ml浓度的细胞悬液，底面10个孔加80个/ml浓度的细胞悬液，100ul/孔。(5)37℃，8％CO2，98％的相对湿度培养。(6)第6天每孔补加100ul的培养基，如果必需，隔天可换液，弃100ul旧培养基，再补加100ul新鲜培养基。(7)当细胞的汇合率达到10％-5％时，挑选仅有单个克隆细胞簇的孔，ELISA检测上清中的特异性抗体。
6、杂交瘤细胞的冻存：一般要经过2～3轮的克隆，才能得到真正单克隆杂交瘤细胞。将获得的单克隆细胞株扩大培养，并冻存至液氮，以备后需。
7、腹水制备单抗
主要采用对小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，然后通过多次收集腹腔液的方法收集抗体，通过加热失活，测滴定度储存。
材料：①6到8周的无特殊抗原的裸鼠或同源宿主；②降植烷或弗氏不完全佐剂、完全DMEM培养基加10mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，和1mM丙酮酸钠；③无FBS(胎牛血清)的PBS(磷酸盐缓冲液)或HBSS(Hank's Balanced Salt Solution，Hank's平衡盐溶液)；④针头；⑤175平方厘米培养瓶；⑥无菌离心管；⑦56度水浴；⑧0.45um过滤器。
方法：(1)在腹腔注射杂交瘤细胞前，用22G针头每只鼠腹腔注射0.5～1mlpristane(姥鲛烷)(可以同时注射，间隔一周是为了防止两个针头的伤口发生渗漏)。(2)将细胞放置到175cm2的培养瓶中培养，加入完全DMEM培养基指导生长的对数期。(3)将培养液转移至50ml离心管中，500g或者1500转离心5min室温，弃去上清液。(4)将细胞重悬到50ml无菌PBS或者HBSS中(无FBS)在500g下离心5min室温去掉上清液重复两次将细胞重悬到5mlPBS中。不加入FBS是防止小鼠产生FBS抗体；(5)台盼蓝细胞计数细胞存活率应该接近百分之百；(6)PBS调节细胞浓度到2.5*106个/ml；(7)用10ml的无菌注射器吸取细胞，用22G针头注射，每只裸鼠2ml细胞腹腔注射，等待1到2周。可以一次注射3只鼠；(8)收取腹腔液时单手抓住老鼠以保持老鼠腹部皮肤紧绷。另一只手用18G针头的注射器插入小鼠腹部1到2cm，插入下腹部，防止针头戳到上腹部以及腹部中线附近的组织器官。腹腔液滴入15ml的离心管中。(9)离心腹腔液10min 1500g或2700rpm室温离心。收集上清液弃掉沉淀，将腹腔液收集并在4度冰箱保存。直到所有收集工作结束。让小鼠继续分泌腹腔液(2-3天)，继续重复第8步。按照第9步收集，重复上述步骤直到没有腹腔液积累。(10)将不同时间收集的腹腔液倒到一起。在56度水浴45分；(11)用适当的方法检测腹腔液中单克隆抗体的滴定度。(12)稀释大于1:10之后在0.45um滤器滤过除菌，在-70度冻存，避免重复冷冻。
8、proG(G蛋白)纯化单抗：(1)样品的准备：将腹水用结合缓冲液稀释10倍；
(2)柱子的准备：轻轻地颠倒几次proG的瓶子，混合悬浮液直到树脂完全悬浮起来。吸取1mlproG柱料至预先加有1ml结合缓冲液的柱子中。待柱料沉淀下来，原有的结合缓冲液排走后，再用5ml体积的结合缓冲液平衡柱子。(3)抗体纯化：将样品轻轻地加入柱料中，维持1ml/min的流速，再用30ml结合缓冲液洗涤柱子。(4)用10～15ml的洗脱缓冲液洗脱抗体，立即用1M的tris-HCl中和抗体至pH 8.5～7.4；(5)再生柱子：先用10mlelutionbuffer洗柱子，再用5ml的bindingbuffer平衡柱子，柱子可以反复再生10次，结合能力不会下降太多。(6)柱料保存：保存proG柱料于含有20％乙醇的bindingbuffer中，置于2～8度，勿冻存。结合缓冲液：NaCl 0.15M,Na2HPO420mM,pH 7.4；洗脱缓冲液：Citric acid0.1M,pH 2.5-3.0。
实施例11
在上述任一实施例的基础上，人鼠嵌合抗体的制备方法可为：全长人鼠嵌合抗体的重链包括位于可变区前端的H链信号肽区、H链可变区和位于可变区后端的H链Fc端保守区，所述H链信号肽区的序列如序列113所示，所述的H链可变区如实施例1-3中任意实施例所述的可变区的序列(如序列101～序列112中的任意一个序列)，所述H链Fc端保守区的序列如序列114所示。通过人工合成或融合PCR的方法将这三个序列连接或融合在一起，形成了人鼠嵌合抗体的重链。
全长人鼠嵌合抗体的轻链包括位于可变区前端的L链信号肽区、L链可变区和位于可变区后端的L链Fc端保守区，所述L链信号肽区的序列如序列115所示，所述的L链可变区如实施例1-4中任意实施例所述的可变区的序列(如序列121～序列132中的任意一个序列)，所述L链Fc端保守区的序列如序列116所示。通过人工合成或融合PCR的方法将这三个序列连接或融合在一起，形成了人鼠嵌合抗体的轻链。
本实施例中的序列113～116的具体序列参见序列表所示。
实施例12
在实施例3的基础上，抗人源IL33的人鼠嵌合单克隆抗体的制备方法可参见如下方法：
一、抗体CDR区DNA序列的调取：
1、阳性单克隆杂交瘤RNA提取：(1)离心收集杂交瘤细胞，弃培养基；(2)5～10*106个细胞，加trizal试剂0.5ml裂解；(3)异丙醇沉淀法抽提细胞总RNA。
2、反转录cDNA获得：按照takara反转录试剂盒的说明书，以oligoT引物反转录获得抗体的cDNA模板。
3、根据小鼠抗体保守区设计引物，PCR扩增IL33单抗的重链、轻链的可变区(即包括高变区HVR和框架区在内的可变区)，即扩增如实施例2所述的重链和轻链的可变区。
4、PCR产物测序
5、IgGblast比对重链、轻链的可变区，通过比对可以看出每个框架区(FR区)和每个CDR区分别包括哪些个氨基酸等。
二、表达纯化IL33人鼠嵌合抗体
1、构建真核表达载体：1)通过融合PCR的方法得到全长人鼠嵌合抗体的重链、轻链：
全长人鼠嵌合抗体的重链包括位于可变区前端的H链信号肽区、H链可变区和位于可变区后端的H链Fc端保守区，所述H链信号肽区的序列如序列113所示，所述的H链可变区如实施例1-3中任意实施例所述的可变区的序列，所述H链Fc端保守区的序列如序列114所示。
全长人鼠嵌合抗体的轻链包括位于可变区前端的L链信号肽区、L链可变区和位于可变区后端的L链Fc端保守区，所述L链信号肽区的序列如序列115所示，所述的L链可变区如实施例1-3中任意实施例所述的可变区的序列，所述L链Fc端保守区的序列如序列116所示。序列113～116的具体序列参见实施例11或序列表所示。
2)同源重组将重轻链分别插入载体pvitro-hygro-mcs；3)菌落PCR鉴定，挑选阳性菌落；4)提质粒，测序；
2、转染293F细胞，细胞工程表达抗体：1)转染前24h传代细胞，密度5x105～6x105个/ml，130～150rpm，37℃，8％CO2。2)转染前台盼蓝染色确定活细胞数目，活力必须在95％以上。注：细胞若有结团会降低转染效率，使用40um的细胞滤膜过滤细胞，得到均一的单细胞悬液。3)用预热的293F无血清培养基稀释细胞，以1x106个/ml的密度接种至新的摇瓶，体积是30ml。置于摇床，准备转染使用。4)轻轻的颠倒FreeStyle MAX试剂数次以混匀。5)使用5ml离心管，加50ug质粒，OptiPROSFM培养基补齐至1.5ml，轻轻混匀。6)另取一新的5ml离心管，加50ulFreeStyle MAX试剂，OptiPRO SFM培养基补齐至1.5ml，轻轻混匀。7)立即将稀释的FreeStyle MAX溶液加入到质粒稀释溶液中，将枪头完全浸入到质粒溶液中，边搅拌边慢慢释放转染试剂溶液。8)轻轻涡旋混匀，室温静置10min以形成DNA-脂质体复合物。孵育时间不要超过20min。9)将3mlDNA-脂质体溶液逐滴地加入细胞摇瓶，边加边轻轻地晃动摇瓶。130～150rpm，37℃，8％CO2，培养细胞。
3、纯化抗体。
在本实施例中，若以由序列107构成的重链可变区和由序列127构成的轻链可变区为抗体作为示例，则设计的所述引物序列如下表3所示。
表3引物序列
Figure BDA0001946312090000171
Figure BDA0001946312090000181
实施例13：IL33抗体生物学中和活性检测
IL33协同LPS(lipopolysaccharide，脂多糖)诱导巨噬细胞表达更多的IL6和TNF-α(肿瘤坏死因子α)：小鼠巨噬细胞被IL33预刺激后，LPS的受体复合物MD2、TLR4、MyD88的表达量增加，去除IL33再用LPS刺激巨噬细胞，下游细胞因子的表达量增加。
方法：1)C57小鼠8周，腹腔注射2ml 4％肉汤；2)4天后，PBS或者加双抗(双抗指的是青霉素和链霉素)的1640培养基冲洗腹腔，收集腹腔巨噬细胞；3)漂洗2遍后，计数，接种1x106个细胞至24孔板，0.5ml/孔，所用培养基是1640+10％FBS+双抗；4)37摄氏度5％CO2培养箱中，培养2h，弃原培养基上清，每孔再用0.5ml培养基漂洗一遍，去除未贴壁的细胞，换液0.5ml/孔；5)加50ng/ml终浓度IL33或者被抗体孵育后的IL33预刺激，6h检测TNF，8h检测IL6。IL33与抗体孵育条件：室温下1h；此处的抗体即为本申请中请求保护的单克隆抗体，即Anti-IL33；6)预刺激后，弃上清，换液0.5ml/孔，加终浓度是100ng/ml的LPS刺激24h，收集上清；7)ELISA检测IL6、TNF-α。
结果：参见附图1-2所示，由图可知，Anti-IL33可中和IL33协同LPS刺激巨噬细胞(PM)诱导产生IL6和TNF-α的生物活性，抑制效果明显。
实施例14：IL33抗体生物学中和活性检测
IL33诱导原代肥大细胞表达大量IL6：肥大细胞表达IL33的受体ST2分子，是IL33的主要靶细胞，IL33可激活肥大细胞产生促炎因子IL6。
方法：1)常规方法取骨髓单核细胞；2)1x106个/ml接种1640完全培养基，胚胎细胞因子(SCF)50ng/ml，IL3 30ng/ml共刺激培养两周；3)IL3 30ng/ml单独刺激培养5周；4)细胞培养过程中，每周收集悬浮细胞，离心换液，转移到新的培养皿，弃掉已贴壁细胞；5)7周后用抗体FcεR1-FITC和抗体CD117-APC染肥大细胞，流式检测纯度；6)调节mast cell的浓度至1x106个/ml，200ul/孔，铺96孔板；7)IL33刺激浓度100ng/ml，刺激时间24h；8)抗体组与IL33室温预孵育20min；此处的抗体组包括鼠源的单克隆抗体MCAB和人鼠嵌合抗体CA，其中，McAb-IL33 10UL(1mg/ml)，人鼠嵌合抗体CA-IL33 20UL(30ug/ml)；9)4h后收集上清，ELISA检测IL6的表达量。
结果：参见附图3-6所示，由图3可知，未诱导时，两个蛋白CD117-APC和FcεR1-FITC均在靠下靠左的阴性区域，而诱导后，两个蛋白的量分别有上移和右移，即肥大细胞增加，说明已经有效地诱导出了肥大细胞。由图4可知，在检测IL6的量时，绘制了ELISA的标准曲线图，其为线性的结果，即本次试验的结果具有有效性和可信性。由图5可知，本申请人用所诱导的肥大细胞来测试IL33抗体的阻断活性。由于IL33可以刺激mast cell表达IL6，而预先孵育IL33抗体就能阻断这种刺激产生的IL6，说明抗体有活性，而通过图5可知，本申请中的单克隆抗体MCAB-IL33和人鼠嵌合抗体CA-IL33的活性非常好，能够极大的阻断IL6的表达，即本申请中的抗体能够中和IL6在肥大细胞中的表达。图6为诱导肥大细胞两周时的阻断效果，由此可知，MCAB-IL33和CA-IL33的活性非常好，能够极大的阻断IL6的表达。
此外，图7为IL33抗体可中和IL6在骨髓细胞中的表达示意图，由此可知，MCAB-IL33和CA-IL33的活性非常好，能够极大的阻断IL6在骨髓细胞中的表达。
实施例15：IL33抗体生物学中和活性检测
IL33单抗缓解OVA诱导的哮喘模型：
1)OVA(卵清蛋白)诱导的哮喘模型的建立方法如下：①第0天，每只小鼠按照75ugOVA的量计算，将100ul，75ug的OVA溶液与100ul铝剂，充分乳化后皮下注射200ul。②第10天，同第0天的操作；③第21、22、23天，气管给药，每只鼠50ug的OVA；④第25天取材；⑤抗体治疗组与同型对照组，在每次给药OVA前30min，腹腔注射抗体150ug。此处的抗体即为鼠源单克隆抗体McAb-IL33。
2)统计肺灌洗液中的总细胞的量
血清计数板计数
3)检测肺灌洗液中总蛋白的浓度
BCA法检测蛋白浓度
4)流式分析肺灌洗液中嗜酸性粒细胞的比例
用流式抗体CD11C-APC和SiglecF-PE标记肺灌洗液中的细胞，双阳型标记巨噬细胞，siglecF阳性、CD11C阴性代表嗜酸性粒细胞。
结果：如图8-9所示，图8反映了IL33抗体治疗OVA诱导的哮喘模型的有效性。左上图“con”是正常小鼠的肺灌洗液细胞的流式图，CD11C和siglecF这两个标记蛋白，如果都是阳性，则代表了巨噬细胞，所以在正常小鼠的肺灌洗液中的细胞大部分都是巨噬细胞。右上图是OVA给药组，其没有抗体的治疗，细胞流式的结果是有大量siglecF阳性，CD11C阴性的细胞，代表了嗜酸性粒细胞，这是具有哮喘的标志，说明造模成功。左下图是IL33抗体治疗组(Ova+anti-IL33)，即加入了McAb-IL33，则图示显示其和正常小鼠类似，肺灌洗液中巨噬细胞占大部分，嗜酸性粒细胞占小部分，则说明哮喘程度显著减轻，效果明显。右下图是小鼠IgG对照治疗组(Ova+mIgG)，嗜酸性粒细胞的比例也很大，说明治疗无效。图9为抗体中和OVA诱发的哮喘的示意图，具体为BALF(支气管肺泡灌洗液)中浸润细胞浓度的比较，由图9可知，抗体anti-IL33能够降低支气管肺泡灌洗液中细胞总数，与对照组mIgG相比，效果显著。
实施例16：抗体亲和力的鉴定
表面等离子共振(SPR)是一种光学物理现象，可以生物传感芯片为中心，应用于检测分子之间的相互作用，实时监测生物分子的相互作用的整个过程。主要原理是当一束平行光射入棱镜端面，在棱镜与金属薄膜中间会产生等离子波，当光波的传播常数与等离子波的传播常数相匹配时，就会引起金属膜内自由电子产生共振，即表面等离子共振。
将抗原IL33包被在金属薄膜上，检测其与IL33单抗McAb-IL33和IL33嵌合抗体CA-IL33的亲和力。抗原抗体结合情况示意图如图10所示。
图11和12中的，两个图中的不同的曲线是将抗体等倍稀释后，去结合。理论上，图11和12应该先上升再到一个平台期，再降下来，但是由于本申请的抗体结合力太强，故导致曲线没有降下来。在图11中，对于McAb-IL33，其Ka(1/Ms)：1.469E+5，Kd(1/s):2.541E-5，KD＝Kd/Ka＝1.730E-10(M)＝173.0pM；在图12中，对于CA-IL33，Ka(1/Ms)：1.447E+5，Kd(1/s):1.691E-6，KD＝Kd/Ka＝1.169E-11(M)＝11.69pM；KD值能够直接、有力的反映抗体与抗原的结合力的强弱，浓度越低反映的结合力越高，本申请中McAb-IL33的KD值为173.0pmol，CA-IL33的KD值为11.69pmol，由这些数据可知，本申请的抗体已经低至pmol的级别了，反映了其结合力非常好，该结合力基本不低于目前已经上市的赫赛汀，效果惊喜。
实施例17：抗体Tm值的检测
使用TA公司的NANO DSC仪器，单抗浓度约1mg/ml，体积约1ml。20～95℃范围，1℃/min逐渐升温，对照组是PBS溶液。
Tm值的图，如图13-14所示，其是通过DSC(differential scanning calorimetry,差示扫描量热法)原理检测的抗体的热稳定性，图13是拟合的一个正态分布标准曲线。图14是本申请测定Tm值的图，其与图13的曲线基本一致，并在图14中直接标记出了Tm的温度值。由该Tm值的检测可知，本申请的Tm值较高，抗体热稳定性好。
还需要说明的是本申请中的中和活性检测、亲和力检测以及Tm值的检测等(即实施例13-17中的检测)均是以以下抗体为例进行检测的，即抗体为由表1中SEQ7中的HVR区和表2中SEQ(7)中的骨架区构成的可变区的鼠源单克隆抗体和/或人鼠嵌合抗体，即抗体为由序列107(序列见序列表)构成的H链可变区和由序列127构成的L链可变区的鼠源单克隆抗体和/或人鼠嵌合抗体。其他序列的抗体效果也很好，但由于篇幅关系，我们只用其中一种抗体进行了说明。
本申请所给出的抗体序列、引物序列、以及表达抗体的基因序列、含有基因序列的载体和细胞以及含有抗体的抑制剂和药物等等均属于本申请的发明点。
以上所述仅为发明的优选实施例，并不用于限制发明，对于本领域技术人员而言，发明可以有各种改动和变化。凡在发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京赛新生物科技有限公司
<120> 一种新型的抗体及其应用
<130> 1800008-I
<160> 100
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 1
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Asp Trp Gly Gly Asp Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser His Trp Trp Gly Ala Ala Tyr Asp Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gln Arg Cys Tyr Ala Asn Gln Val Ser
100 105
<210> 2
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 2
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Trp Asn Asn Asp Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ala Lys Tyr Thr Leu Pro Tyr Asp Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Arg Asp Ala Ala Val Val Ser
100 105
<210> 3
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 3
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Ser Phe Leu Phe Ile Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Gln Gln Gly Gly Arg Trp Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Cys Leu Pro Ala Pro His Val Ser
100 105
<210> 4
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 4
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Met Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Asp Gly
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Val Gln Thr Pro Glu Lys Ile Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Cys Gly Gly Arg Tyr Ile Tyr Tyr Pro Pro Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Met Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Pro Arg Leu Pro Trp Pro Phe Val Ala
100 105
<210> 5
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 5
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ala Thr Phe Asn Trp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Val Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Leu Pro Lys Pro Phe Val Ser
100 105
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 6
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ser Lys Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ile Arg Ser Gly Gly Leu Ile Phe Tyr Leu Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Met Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Val Tyr Tyr Pro Tyr Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
<210> 7
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 7
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Leu Pro Ala Pro Phe Val Ser
100 105
<210> 8
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 8
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Asp Trp Asn Gly Asp Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser His Thr Trp Gly Ala Ala Tyr Asp Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gln Arg Cys Pro Ala Asn Gln Val Ser
100 105
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 9
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Lys Asp Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Val Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Trp Gly Leu Ile Phe Tyr Leu Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Pro Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Met His Val Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Cys Val Ile Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Phe Val Ser
100 105 110
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 10
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe Thr Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly Leu Ile Phe Tyr Leu Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Met Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Val Ile Ser Tyr Tyr Gly Gly Ser Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
100 105 110
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 11
Glu Val Ser Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gly Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Val Ala Ala Ala Gly Phe Thr Phe His Arg Asp
20 25 30
Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Thr Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ser Ile Ser Phe Gly Gly Gly Leu Ile Phe Tyr Leu Asp Ser
50 55 60
Leu Lys Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Trp Lys Asn Thr Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Gln Ser Leu Met Ser Glu Asp Thr Ser Phe Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Val Ile Gln Tyr Tyr Gly Gly Ser Pro Trp Tyr Phe Asp
100 105 110
Tyr
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 12
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Ser Trp Gly Gly Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile His Asn Met Trp Thr Leu Ile Phe Tyr Leu Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Met Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Val Ile Ser Tyr Tyr Val Ile Ser Asn Thr Tyr Val Ser Tyr
100 105 110
<210> 13
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 13
Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg
1 5 10 15
Val Thr Val Thr Cys Gln Gln Asn Gln Ser Val Asn Asn Asp Val Ala
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ser Ser Val Ser Phe
35 40 45
Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly
50 55 60
Gly Val Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Leu Ala Val Tyr Phe Cys Ser Trp Val Tyr Ser Phe Pro Leu Ala
85 90 95
<210> 14
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 14
Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg
1 5 10 15
Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val His Val Asp Val Ala
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Phe
35 40 45
Ala Ser Asn Arg Trp Lys Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly
50 55 60
Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Val Val Ser Lys Ala Leu Ala
85 90 95
<210> 15
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 15
Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg
1 5 10 15
Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Asp Val Ala
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Phe
35 40 45
Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly
50 55 60
Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Phe Pro Leu Ala
85 90 95
<210> 16
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 16
Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg
1 5 10 15
Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Thr Thr Ser Trp Val Asp Val Ala
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Phe
35 40 45
Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly
50 55 60
Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Leu Ala Val Tyr Phe Cys Ser Ser Asp Tyr Ser Phe Leu Cys Thr
85 90 95
<210> 17
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 17
Val Met Val Val Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg
1 5 10 15
Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Thr Thr Ser Asp Val Ala
20 25 30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Phe
35 40 45
Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly
50 55 60
Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Phe Pro Leu Ala
85 90 95
<210> 18
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 18
Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Lys Asn Ser Ala Gly Asp Arg
1 5 10 15
Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Asp Val Ala
20 25 30
Trp Tyr Gln Val Ser Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Ser Phe
35 40 45
Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Phe Arg Phe Thr Gly Gly Gly
50 55 60
Tyr Gly Thr Trp Ser Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ala Glu Asp
65 70 75 80
Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Ile Asp Tyr Ser Phe Pro Leu Arg
85 90 95
<210> 19
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 19
Asp Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Arg Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Thr
100
<210> 20
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 20
Asp Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser His Asn Val Asp Gly Tyr
20 25 30
Ser Asn Ser Ala Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Cys Asp Pro Leu Ala
100
<210> 21
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 21
Asp Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser His Asn Ser Asp Gly Tyr
20 25 30
Ser Asn Ser Ala Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Lys Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Cys Asp Pro Trp Ser
100
<210> 22
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 22
Asp Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Trp Ser Val Asp Arg Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Trp Ile Tyr Arg Ala Val Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val His Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Leu Trp
100
<210> 23
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 23
Asp Ile Val Val Phe Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Cys Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Val Arg Ala Ser Glu Ser Val Trp Arg Tyr
20 25 30
Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Cys Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Val Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Trp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asn Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser Asn
85 90 95
Ala Asp Pro Leu Ser
100
<210> 24
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 24
Asp Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gly Gly Val Asp Arg Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Val Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Cys Ser Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg His Ser Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Thr Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Ser Thr Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Val Asn Leu Thr
100
<210> 25
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 25
atggcctggg tctggaccct gcctttcctg atggccgctg cccagtccgt gcaggcc 57
<210> 26
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 26
tggggacagg gcaccctggt gacagtgagt tcagccagta cgaagggccc gtctgtattt 60
cccctagctc catcgagcaa aagcacatct ggaggtactg ccgccctggg atgcctcgtc 120
aaggattact tcccggagcc tgttacagtt tcatggaact caggggcctt aacatctggc 180
gtccatacat ttcctgctgt gttgcaatca tctgggctgt attcactcag tagtgtggtg 240
actgttccgt catcttccct gggtactcaa acatatattt gtaatgtgaa ccacaagccg 300
tctaacacaa aggtggacaa gaaggtcgag cccaagtctt gtgacaaaac acatacctgt 360
cctccctgtc cggcacctga gttactgggc ggaccctcag tgtttctttt tcctcccaaa 420
cccaaggata cactgatgat ctcacggacc cccgaggtta cttgtgtggt tgtcgatgtc 480
tctcacgaag accccgaagt gaaattcaac tggtacgtgg acggtgttga ggtgcacaac 540
gccaaaacta agcccagaga agaacagtac aacagcactt accgtgtcgt cagcgtgctg 600
acagtgctgc atcaggattg gctgaatggc aaggaatata agtgtaaggt ctccaacaag 660
gctctgcccg cacccattga gaaaaccatt tccaaggcaa agggacagcc aagggagccc 720
caggtttaca cacttccccc aagtcgcgat gagctgacca aaaaccaggt atcactgact 780
tgcctggtga aaggctttta tccaagcgac atcgcagtgg aatgggagtc caacggtcag 840
ccagagaata attacaagac aacacccccg gtgctggatt cagatggatc tttttttctc 900
tacagcaagc tgacagtaga caagtctaga tggcagcaag ggaacgtttt ctcctgttcg 960
gtgatgcatg aggcgctcca caatcactat acccagaaga gcctttcact ttctcccggt 1020
aagtga 1026
<210> 27
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 27
atgtccgtgc tgacccaggt gctggccctg ctgctgctgt ggctgaccgg caccagatgc 60
<210> 28
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 28
ttcggacaag gcacgaaggt cgagattaag aggaccgtgg cagcgccttc tgtctttata 60
ttccccccgt cagacgaaca actcaaaagc ggcaccgcca gcgtcgtgtg cctgctcaac 120
aatttctatc cacgcgaggc aaaggtgcaa tggaaggtgg acaacgccct gcagagtgga 180
aactctcagg aatctgtcac cgagcaggac tccaaggatt ctacctatag cctttcaagc 240
acacttacat tgtctaaggc agattacgag aagcataaag tttacgcatg cgaagtcacc 300
caccaggggc tgagcagccc cgtgaccaag tcttttaaca ggggcgagtg ttga 354
<210> 29
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 29
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 31
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 31
Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Val Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 32
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 32
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 33
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 34
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 34
Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Val Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 35
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 35
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 36
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 37
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 37
Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Val Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 38
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 38
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Met Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 39
Met Ser Trp Val Val Gln Thr Pro Glu Lys Ile Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 40
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 40
Tyr Tyr Pro Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Val Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Met Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 41
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 41
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 42
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 43
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 43
Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Val Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 44
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ser Lys
20 25
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 45
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 46
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 46
Phe Tyr Leu Asp Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Met Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
35
<210> 47
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 47
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 48
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 49
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 49
Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Val Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 50
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 50
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser
20 25
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 51
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 52
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 52
Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Val Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 53
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 53
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ala
20 25
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 54
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Val Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 55
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 55
Phe Tyr Leu Asp Ser Leu Lys Pro Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Met His Val Asp
20 25 30
Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
35
<210> 56
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 56
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ala
20 25
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 57
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 58
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 58
Phe Tyr Leu Asp Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Met Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
35
<210> 59
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 59
Glu Val Ser Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gly Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Val Ala Ala Ala
20 25
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 60
Met Ser Trp Val Arg Thr Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 61
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 61
Phe Tyr Leu Asp Ser Leu Lys Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn
1 5 10 15
Trp Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Gln Ser Leu Met Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ser Phe Tyr Tyr Cys
35
<210> 62
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 62
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ala
20 25
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 63
Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Ser Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 64
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 64
Phe Tyr Leu Asp Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Met Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
35
<210> 65
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 65
Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg
1 5 10 15
Val Thr Val Thr Cys Gln Gln Asn
20
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 66
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ser Ser Val
1 5 10 15
Ser
<210> 67
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 67
Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly Gly Val
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Phe Cys
35
<210> 68
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 68
Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg
1 5 10 15
Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser
20
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 69
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser
<210> 70
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 70
Asn Arg Trp Lys Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Phe Cys
35
<210> 71
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 71
Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg
1 5 10 15
Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser
20
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 72
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser
<210> 73
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 73
Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Phe Cys
35
<210> 74
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 74
Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg
1 5 10 15
Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser
20
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 75
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser
<210> 76
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 76
Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Phe Cys
35
<210> 77
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 77
Val Met Val Val Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg
1 5 10 15
Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser
20
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 78
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser
<210> 79
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 79
Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Phe Cys
35
<210> 80
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 80
Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Lys Asn Ser Ala Gly Asp Arg
1 5 10 15
Val Thr Val Thr Cys Lys Ala Ser
20
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 81
Val Ala Trp Tyr Gln Val Ser Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser
<210> 82
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 82
Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Phe Arg Phe Thr Gly Gly Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Thr Trp Ser Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Phe Cys
35
<210> 83
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 83
Asp Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 84
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 84
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 85
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 85
Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 86
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 86
Asp Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 87
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 88
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 88
Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 89
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 89
Asp Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 90
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 90
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Lys Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 91
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 91
Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 92
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 92
Asp Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 93
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 93
Met His Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Trp Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 94
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 94
Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Arg
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val His Ala Asp Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 95
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 95
Asp Ile Val Val Phe Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Cys Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Val Arg Ala Ser
20 25
<210> 96
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 96
Met His Trp Tyr Gln Cys Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 97
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 97
Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Val Ser Gly Ser Arg
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Trp Pro Val Glu Ala Asp Asn Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 98
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 98
Asp Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 99
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 99
Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Cys Ser Pro Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 100
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Synthesis)
<400> 100
Asn Leu Asp Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Thr Ala Asp Asp Val Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Ser
35

Claims (18)

1.一种抗体，其特征在于：所述抗体为能够抑制或减弱IL33介导的信号传递的抗体或结合片段。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于：所述抗体包括轻链L链和重链H链，所述L链包括高变区LHVR1、LHVR2、LHVR3；所述LHVR1选自序列SEQ1～SEQ12中LHVR1列中的任意一个序列，所述LHVR2选自序列SEQ1～SEQ12中LHVR2列中的任意一个序列，所述LHVR3选自序列SEQ1～SEQ12中LHVR3列中的任意一个序列；
所述H链包括高变区HHVR1、HHVR2和HHVR3，所述HHVR1选自序列SEQ1～SEQ12中HHVR1列中的任意一个序列，所述HHVR2选自序列SEQ1～SEQ12中HHVR2列中的任意一个序列，所述HHVR3选自序列SEQ1～SEQ12中HHVR3列中的任意一个序列。
Figure FDA0001946312080000011
Figure FDA0001946312080000021
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述抗体L链为由SEQ1所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，由SEQ2所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，由SEQ3所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，由SEQ4所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，由SEQ5所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，由SEQ6所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，由SEQ7所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，由SEQ8所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，由SEQ9所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，由SEQ10所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，由SEQ11所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链，或由SEQ12所在行的LHVR1、LHVR2和LHVR3组成的L链。
4.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述抗体H链为由SEQ1所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，由SEQ2所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，由SEQ3所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，由SEQ4所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，由SEQ5所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，由SEQ6所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，由SEQ7所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，由SEQ8所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，由SEQ9所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，由SEQ10所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，由SEQ11所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链，或由SEQ12所在行的HHVR1、HHVR2和HHVR3组成的H链。
5.根据权利要求3或4所述的抗体，其特征在于：所述抗体的HVR区包括由SEQ1所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、由SEQ2所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、由SEQ3所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、由SEQ4所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、由SEQ5所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、由SEQ6所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、由SEQ7所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、由SEQ8所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、由SEQ9所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、由SEQ10所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区、由SEQ11所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区或由SEQ12所在行的L链HVR区和H链HVR区构成的HVR区。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其特征在于：所述抗体的轻链包括轻链第一骨架区LFR1区、轻链第二骨架区LFR2区和轻链第三骨架区LFR3区，LFR1区选自SEQ(1)～SEQ(12)中LFR1列中的任意一个序列，所述LFR2选自SEQ1～SEQ12中LFR2列中的任意一个序列，所述LFR3选自SEQ1～SEQ12中LFR3列中的任意一个序列；
Figure FDA0001946312080000031
Figure FDA0001946312080000041
所述抗体的重链包括重链第一骨架区HFR1区、重链第二骨架区HFR2区和重链第三骨架区HFR3区，HFR1区选自SEQ(1)～SEQ(12)中HFR1列中的任意一个序列，所述HFR2选自SEQ1～SEQ12中HFR2列中的任意一个序列，所述HFR3选自SEQ1～SEQ12中HFR3列中的任意一个序列。
7.根据权利要求6所述的抗体，其特征在于：所述抗体中轻链的骨架区为SEQ(1)～SEQ(12)中各行中的LFR1、LFR2和LFR3构成的骨架区；
所述抗体中重链的骨架区为SEQ(1)～SEQ(12)中各行中的HFR1、HFR2和HFR3构成的骨架区。
8.根据权利要求7所述的抗体，其特征在于：所述抗体的骨架区为由SEQ(1)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、由SEQ(2)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、由SEQ(3)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、由SEQ(4)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、由SEQ(5)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、由SEQ(6)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、由SEQ(7)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、由SEQ(8)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、由SEQ(9)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、由SEQ(10)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区、由SEQ(11)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区或由SEQ(12)所在行的L链骨架区和H链骨架区构成的骨架区。
9.根据权利要求8所述的抗体，其特征在于：所述抗体为包含由SEQ1～SEQ12中任意一行的高变区和SEQ(1)～SEQ(12)中任意一行的骨架区构成的可变区的抗体。
10.根据权利要求9所述的抗体，其特征在于：所述抗体为包含由SEQ1所在行中的HVR区和SEQ(1)所在行中的骨架区构成的可变区、由SEQ2所在行中的HVR区和SEQ(2)所在行中的骨架区构成的可变区、由SEQ3所在行中的HVR区和SEQ(3)所在行中的骨架区构成的可变区、由SEQ4所在行中的HVR区和SEQ(4)所在行中的骨架区构成的可变区、由SEQ5所在行中的HVR区和SEQ(5)所在行中的骨架区构成的可变区、由SEQ6所在行中的HVR区和SEQ(6)所在行中的骨架区构成的可变区、由SEQ7所在行中的HVR区和SEQ(7)所在行中的骨架区构成的可变区、由SEQ8所在行中的HVR区和SEQ(8)所在行中的骨架区构成的可变区、由SEQ9所在行中的HVR区和SEQ(9)所在行中的骨架区构成的可变区、由SEQ10所在行中的HVR区和SEQ(10)所在行中的骨架区构成的可变区、由SEQ11所在行中的HVR区和SEQ(11)所在行中的骨架区构成的可变区或由SEQ12所在行中的HVR区和SEQ(12)所在行中的骨架区构成的可变区。
11.根据权利要求10所述的抗体，其特征在于：所述抗体为包括由SEQ5所在行中的HVR区和SEQ(5)所在行中的骨架区构成的可变区、由SEQ6所在行中的HVR区和SEQ(6)所在行中的骨架区构成的可变区、由SEQ7所在行中的HVR区和SEQ(7)所在行中的骨架区构成的可变区或由SEQ8所在行中的HVR区和SEQ(8)所在行中的骨架区构成的可变区的抗体。
12.根据权利要求1-4中任一项或7-11中任意一项所述的抗体，其特征在于：所述抗体包括含有权利要求1-9中任意一项所述的序列的人鼠嵌合体单克隆抗体和/或鼠源化单克隆抗体。
13.一种能够编码所述抗体的基因分子，其特征在于：所述基因分子为能够编码权利要求1-12中任意一项所述的抗体的碱基序列。
14.一种表达载体，其特征在于：所述载体为包含权利要求13所述的碱基序列的表达载体。
15.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为包含权利要求1-12中任意一项所述的抗体、权利要求13所述的碱基序列或权利要求14所述的表达载体的宿主细胞。
16.一种IL33抗原表位抑制剂，其特征在于：所述抑制剂包括权利要求1-12中所述的抗体。
17.一种药物，其特征在于：所述药物包括权利要求1-12中所述的抗体，该药物为能够治疗、预防或减轻与IL33相关疾病的药物。
18.根据权利要求17所述的药物，其特征在于：所述药物包括治疗或减缓哮喘、类风湿性关节炎、败血症、心脏疾病、动脉粥样硬化、恶性肿瘤的药物。
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