CN110974958A - 一种抗pd-l1单克隆抗体的注射制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体提供了一种抗PD‑L1单克隆抗体的注射制剂，该制剂包括蛋白含量为10‑60mg/ml的抗PD‑L1单克隆抗体；浓度为10‑60mM的缓冲剂；浓度为100‑150mM的稳定剂；浓度为10‑100mM的渗透压调节剂；0.005％‑0.05％(w/v)的表面活性剂；注射制剂的pH值为5.8‑6.3。本发明中抗PD‑L1单克隆抗体具有较高的亲和力和良好的生物学活性；同时本发明根据抗PD‑L1单克隆抗体的特性选择不同辅料，不仅能够保证单抗在保存过程中的安全性和有效性，而且能够保持抗PD‑L1单克隆抗体的物理稳定性、化学稳定性和生物稳定性。

Description

一种抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂。
背景技术
随着老龄化加速，环境污染等因素造成癌症已经成为人类健康的头号杀手，全球平均每6名死者中就有1人死于癌症。近十年来，我国恶性肿瘤发病率和死亡率保持每年约4％和2.5％的自然增长率。根据全球癌症负担估计结果显示，我国恶性肿瘤新发病例和死亡病例分别占全球恶性肿瘤新发病例和死亡病例的23.7％和30.2％。目前中国的癌症发病水平与世界平均水平持平，但我国的癌症预后效果相对比较差，所以，应针对性提高人群癌症防控意识，提高人群癌症生存率。
治疗癌症最常见的手段为手术切除肿瘤、化疗和抗癌药物三种为主，上述三种方式在治疗肿瘤的同时对患者自身伤害也较大。19世纪末癌症免疫疗法被提出，免疫疗法是指通过人体自身的免疫系统达到对抗癌症的治疗方式。识别并杀死异常细胞是人体免疫系统的天然属性，因此越来越多的研究不断在探索激活人体免疫系统以治疗癌症。广义的免疫治疗包括免疫检查点抑制剂，免疫细胞治疗，溶瘤病毒，治疗性抗体，癌症疫苗，以及免疫系统调节剂。免疫检查点抑制剂已逐渐成为癌症治疗领域新的研究热点，已经在包括NSCLC、黑色素瘤、肾细胞癌、膀胱癌、尿路上皮癌等多种恶性肿瘤中表现出了不错的临床疗效。
程序性死亡分子1配体(PD-L1)是免疫检查点蛋白之一，PD-L1是一种40kD的跨膜蛋白，由CD274基因编码，诱导表达于T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞、间充质干细胞、骨髓来源的肥大细胞和非造血细胞的表面上，在干扰素及其他炎症因子刺激应答的肿瘤组织和其他组织中都可能迅速上调。PD-1/PD-L1通路激活后，在癌症、妊娠、组织移植以及自身免疫病中抑制免疫系统。PD-L1还能与CD80结合，竞争性抑制CD80与配体结合的T细胞激活通路，这也成为PD-L1抑制T细胞活性的另一种作用机制。一些癌细胞含有大量的PD-L1，这能帮助它们逃避人体免疫系统的攻击。靶向PD-L1的单克隆抗体可以阻断它们与PD-1的结合并阻断癌细胞的免疫逃逸，增强对癌细胞的免疫应答。
PD-L1单抗药物的研发是癌症治疗领域的研究热点，越来越多的临床试验已经证实抗PD-L1抗体在各类肿瘤的治疗中具有良好的安全性和有效性。
抗PD-L1单克隆抗体是一种非胃肠道给药蛋白产品，包括静脉、肌肉或皮下注射等给药方式，在溶液状态下较容易降解，物理稳定性较差，易形成沉淀颗粒或凝聚物，较难获得稳定的蛋白制剂，单抗药物安全性和有效性的变化往往由于蛋白质稳定性的改变引起，这也是目前抗PD-L1单克隆抗体制剂工艺的主要难点。
发明内容
为了解决现有技术中抗PD-L1单克隆抗体制剂存在的上述难点问题，本发明经过长时间的工艺研究和摸索，公开了一种能够使抗PD-L1单克隆抗体蛋白在储存期内能保持理化性质稳定的重组抗PD-L1单克隆抗体的液体注射制剂。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，所述注射制剂包括以下含量的成分：
a)蛋白含量为10-60mg/ml的抗PD-L1单克隆抗体；
b)浓度为10-60mM的缓冲剂；
c)浓度为100-150mM的稳定剂；
d)浓度为10-100mM的渗透压调节剂；
e)0.005％-0.05％(w/v)的表面活性剂；
其中，所述注射制剂的pH值为5.8-6.3。
本发明通过噬菌体库展示技术从全合成的噬菌体库中筛选出抗PD-L1的单克隆抗体，并且为了能够保证单克隆抗体在制剂中的稳定性，通过大量的工艺研究和开发，筛选出该抗体最适宜的保存条件，不同含量的缓冲剂、稳定剂、渗透压调节剂、表面活性剂以及pH的范围选择，使抗体在存放、运输过程中能够有效保证理化性质的稳定性，从而能够保证药效。
进一步的，所述抗PD-L1单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3；所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。
优选的，所述抗PD-L1单克隆抗体的蛋白含量为18-30mg/ml。
本发明从全合成的噬菌体库中筛选出抗PD-L1的单克隆抗体，然后通过构建小容量合成噬菌体库的方法，对初筛获得的单克隆抗体的轻链CDR123区突变建库，对轻链进行亲和力成熟，通过筛选鉴定，选取亲和力较高的单克隆抗体，再对其重链CDR123区突变建库进行亲和力成熟，最终筛选出上述6株高亲和力、活性更好的抗PD-L1单克隆抗体，这6株抗PD-L1单克隆抗体的活性较高，通过实验验证能够有效抑制PD-L1与PD-1的结合，充分保证了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力，从而起到对肿瘤疾病治疗的作用。
进一步的，所述抗PD-L1单克隆抗体还包括重链恒定区，所述重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种；
优选的，所述重链恒定区为人的IgG1。
进一步的，所述缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲液、组氨酸盐酸盐缓冲液或琥珀酸盐缓冲液；
优选的，所述缓冲剂为组氨酸盐酸盐缓冲液。
通过缓冲剂的选择能够为抗PD-L1单克隆抗体提供适宜的存储环境，同时在筛选缓冲剂的同时应尽量避免辅料的加入不影响药物长期保存的稳定性，且能够保证制剂的pH值，本发明通过大量实验筛选出上述三种缓冲液，但在同等条件下，能够显著保证抗体稳定性的缓冲剂为组氨酸盐酸盐缓冲液。
进一步的，所述稳定剂包括蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、蛋氨酸、精氨酸中的一种或多种混合；
优选的，所述稳定剂为甘氨酸。
本发明通过实验筛选出上述最适宜抗PD-L1单克隆抗体保存过程中需要的稳定剂，最优选的，通过选择使用甘氨酸，能够有效避免抗体在保存过程中蛋白聚集和沉淀。
进一步的，所述渗透压调节剂包括氯化钠、氯化镁、葡萄糖、山梨醇、柠檬酸钠中的一种或多种混合。
渗透压调节剂对于抗体药物而言尤其重要，不同药物制剂应筛选出最适宜的渗透压调节剂，本发明通过大量的实验筛选出上述最适宜抗PD-L1单克隆抗体的渗透压调节剂，其能够避免溶血或刺激性，有效保证了注射制剂的使用安全性和稳定性。
优选的，所述渗透压调节剂为所述氯化钠和所述柠檬酸钠的混合物，所述氯化钠与所述柠檬酸钠的含量比为3:1。
本发明通过大量实验筛选出最佳的渗透压调节剂为特定含量比例的氯化钠和柠檬酸钠的混合物，此混合物不仅能够起到调节渗透压的作用，而且两种均为钠盐，避免非作用分子的加入影响药效，此外柠檬酸钠对抗PD-L1单克隆抗体有一定的保护作用。
进一步的，所述表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80、TritonX100、聚乙二醇中的一种或多种混合；
进一步的，所述表面活性剂为所述TritonX100和所述聚山梨酯80的混合物，所述TritonX100和所述聚山梨酯80的含量比为1:1。
本发明通过大量实验筛选了适宜抗PD-L1单克隆抗体注射制剂的表面活性剂，为了能够保证抗体的长期活性和稳定性，表面活性剂最优选择TritonX100和聚山梨酯80的混合物。
本发明还提供了一种抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂用于制备治疗癌症疾病药物中的应用；
优选的，所述癌症疾病包括膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤或黑色素瘤。
本发明的有益效果如下：在本发明提供的注射制剂中的抗PD-L1单克隆抗体具有较高的亲和力和良好的生物学活性，在体外能够很好地抑制PD-L1与PD-1的结合，保证了T细胞的正常增殖、活化和细胞因子的分泌，进而保证了T细胞对肿瘤细胞的识别能力和杀伤能力，避免肿瘤细胞免疫逃逸的发生，能够有效用于治疗癌症疾病，开发前景广阔；此外，本发明根据抗PD-L1单克隆抗体的特性选择不同辅料制备注射制剂，不仅能够保证单抗在保存过程中的安全性和有效性，而且能够保持抗PD-L1单克隆抗体的物理稳定性、化学稳定性和生物稳定性，生物制剂的稳定性对于保证产品的质量以及安全有效性具有重要的意义，此外，本发明提供的注射制剂主要用于治疗癌症疾病，癌症疾病包括但不限于膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤或黑色素瘤等。
附图说明
图1、为本发明实施例1的pScFvDisb-s质粒图谱；
图2、为本发明实验一中梯度稀释phage ELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力的线条图；
图3、为本发明实验二中pTSE质粒载体图；
图4、为本发明实验二中全抗体SDS-PAGE电泳图；
图5、为本发明实验三中全抗体与PD-L1在分子水平上结合能力对比图；
图6、为本发明实验四中全抗体与PD-1的竞争抑制能力对比图；
图7、为本发明实验五中混合淋巴细胞反应(MLR)测试PD-L1单克隆抗体活性对比图。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供的一种抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，注射制剂包括以下含量的成分：
a)蛋白含量为10-60mg/ml的抗PD-L1单克隆抗体；
b)浓度为10-60mM的缓冲剂；
c)浓度为100-150mM的稳定剂；
d)浓度为10-100mM的渗透压调节剂；
e)0.005％-0.05％(w/v)的表面活性剂；
其中，注射制剂的pH值为5.8-6.3。
其中，缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲液、组氨酸盐酸盐缓冲液或琥珀酸盐缓冲液；稳定剂包括蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、蛋氨酸、精氨酸中的一种或多种混合；渗透压调节剂包括氯化钠、氯化镁、葡萄糖、山梨醇、柠檬酸钠中的一种或多种混合；表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80、TritonX100、聚乙二醇中的一种或多种混合。
其中，本发明提供的制剂中，抗PD-L1单克隆抗体是利用噬菌体库展示技术从全合成的噬菌体库中筛选出来的，然后通过构建小容量合成噬菌体库的方法，对初筛获得的单克隆抗体的轻链CDR123区突变建库，对轻链进行亲和力成熟，通过筛选鉴定，选取亲和力较高的单克隆抗体，再对其重链CDR123区突变建库进行亲和力成熟，最终筛选到了高亲和力的抗PD-L1的单克隆抗体。具有的生物淘选方法步骤如下：
步骤一：采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名为pScFvDisb-s，其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建全合成噬菌体库。
步骤二：以PD-L1为抗原包被免疫管，抗原包被量为5μg/500μl/管，4℃包被过夜，再用4％脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和全合成噬菌体库，室温封闭1h。封闭后的全合成噬菌体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为109～1012个，室温反应1h后，使用PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，通过0.1M、pH2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5M、pH8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH7.0左右。
步骤三：将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量，剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
步骤四：将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体超感染，28℃，220rpm培养过夜制备噬菌体，PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行三轮噬菌体库富集筛选。
步骤五：PD-L1噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选：经过三轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，37℃，220rpm的条件下培养至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30min。在4000rpm，离心15min，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，在28℃且220rpm的条件下培养过夜。在4000rpm，4℃的条件下离心15min后，吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定，筛选得到亲和力较高的抗PD-L1单链抗体。
步骤六：对步骤五中初筛得到的抗PD-L1单链抗体进行体外亲和力成熟，具体步骤如下：以初筛得到的抗PD-L1单链抗体轻链为基础，首先合成轻链CDR123突变库，按照步骤二-五进行筛选鉴定，得到两种亲和力较高的克隆；再分别对上述两种轻链合成并构建重链CDR123突变库，按照步骤二-五进行筛选鉴定，最终得到六种亲和力较高的单克隆抗体，分别命名为AH10-B11、AC9-B11、BH2-B11、AH10-E3、AC9-E3、BH2-E3，将上述得到的单克隆抗体送至擎科生物科技有限公司进行基因测序确定为正确的抗体序列。
经过测序，上述筛选到的6株单克隆抗体序列如下：
AH10-B11的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；
AC9-B11的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；
BH2-B11的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；
AH10-E3的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5；
AC9-E3的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5；
BH2-E3的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
具体的，SEQ ID NO:1：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGWTLSDSLQHWVRQAPGKGLEWVGFQSAYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHYYTAWDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:2：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGCTWSDSWDHWVRQAPGKGLEWVD YESTYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWNA TFDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:3：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTWSDSYKHWVRQAPGKGLEWVHWNSTYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHFASTWDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:4：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIHNSLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERRVPWTFGQGTKVEIK；
SEQ ID NO:5：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIHNYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLPSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGLHTPPTFGQGTKVEIK。
上述筛选的抗PD-L1单克隆抗体还包括重链恒定区，重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种；优选的，重链恒定区为人的IgG1。
实施例2
本发明实施例2提供了一种抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂在实施例1的基础上进一步限定了抗PD-L1单克隆抗体的蛋白含量为18-30mg/ml。
实施例3
本发明实施例3提供了一种抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂在实施例1的基础上进一步限定了缓冲剂为组氨酸盐酸盐缓冲液。
实施例4
本发明实施例4提供了一种抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂在实施例1的基础上进一步限定了稳定剂为甘氨酸。
实施例5
本发明实施例5提供了一种抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂在实施例1的基础上进一步限定了渗透压调节剂为氯化钠和柠檬酸钠的混合物，氯化钠与柠檬酸钠的含量比为3:1。
实施例6
本发明实施例6提供了一种抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂在实施例1的基础上进一步限定了表面活性剂为TritonX100和聚山梨酯80的混合物，TritonX100和聚山梨酯80的含量比为1:1。
实施例7
本发明实施例7提供了一种抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂用于制备治疗癌症疾病药物中的应用；癌症疾病包括但不限于膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤或黑色素瘤等。
实验一、梯度稀释ELISA比较抗PD-L1噬菌体单克隆抗体的亲和力
将实施例1中获得的6株单克隆抗体(AH10-B11，AC9-B11，BH2-B11，AH10-E3，AC9-E3，BH2-E3)进行单克隆噬菌体的展示和纯化，然后进行噬菌体梯度稀释ELISA实验鉴定亲和力，选择上市产品atezolizumab的核心专利CN102245640A提供的抗PD-L1单克隆抗体作为阳性对照，具体方法如下：
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被PD-L1，100ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包被过夜，使用PBST洗涤三次，将实施例1中筛选得到的6株噬菌体单克隆抗体和专利CN102245640A提供的抗PD-L1噬菌体单克隆抗体分别用PBST三倍梯度稀释，每孔加入100μl稀释后的样品，在室温下静置1小时。用PBST洗涤ELISA板，将PBST稀释后的HRP-anti-M13单克隆抗体加入ELISA板中，在室温放置1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色10分钟，用2M H2SO4终止后，在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
表1抗PD-L1噬菌体单克隆抗体的亲和力测试的EC50值
克隆 AH10-B11 AC9-B11 BH2-B11 AH10-E3 AC9-E3 BH2-E3 CN102245640A
EC50 8.134 5.133 2.008 9.191 9.28 5.604 35.46
通过表1数据及如图2所示，筛选出的6株不同的单克隆抗体均能够与PD-L1进行结合，而且相对专利CN102245640A提供的抗PD-L1单克隆抗体，本发明提供的单克隆抗体与PD-L1结合能力更强，具有更高的亲和力，而且通过上述数据发现，BH2-B11单抗的亲和力最高。
实验二、抗PD-L1全抗体的制备
将实施例1筛选出来的6株单克隆抗体的重链vH和轻链vκ基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，重链恒定区为人IgG1恒定区(氨基酸序列见SEQ ID NO：6)，轻链恒定区为κ链恒定区(氨基酸序列见SEQ ID NO：7)，pTSE载体结构如图3所示，制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段。
SEQ ID NO：6(人的IgG1的恒定区序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；
SEQ ID NO：7(κ链的轻链恒定区序列)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；
瞬时转染HEK293E细胞，进行全抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得6株单克隆抗体的全抗体蛋白，同时使用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图4所示，从左侧到右侧依次为蛋白质分子量Marker、AH10-B11、AC9-B11、BH2-B11、AH10-E3、AC9-E3、BH2-E3及上市产品atezolizumab的核心专利CN102245640A提供的抗PD-L1单克隆抗体，每条带的分子量大小与理论一致。
实验三、全抗体与PD-L1的结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被PD-L1，100ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBS在37℃温度条件下封闭2h，加入实验二中不同稀释浓度的全抗AH10-B11、AC9-B11、BH2-B11、AH10-E3、AC9-E3、BH2-E3和专利CN102245640A中的抗PD-L1全抗体，7种全抗体的起始最高浓度均是1μg/ml，分别经过3倍稀释后每个全抗体均做8个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBS 1∶10000稀释的Anti-Human Fc-HRP，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色8min，然后用2M H2SO4终止显色。在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
表2全抗体与PD-L1的结合实验测量的EC50值
克隆 AH10-B11 AC9-B11 BH2-B11 AH10-E3 AC9-E3 BH2-E3 CN102245640A
EC50(ng/ml) 1.425 0.5744 0.5351 1.909 2.174 1.228 12.26
通过表2数据及实验结果如图5所示，筛选出来的6株不同的单克隆抗体的全抗体均能与PD-L1进行结合，本发明提供的6株不同的单克隆抗体的全抗体的EC50值均明显低于专利CN102245640A中的抗PD-L1全抗体，说明本发明提供的单克隆抗体与PD-L1结合的亲和力较高，具有较好的活性，此外，从图5及表2数据中还可以得出，这6株不同的单克隆抗体中BH2-B11的全抗体的活性最好，而且EC50值最低，说明其与PD-L1结合能力最好，亲和力最高，活性最好。
实验四、全抗体竞争抑制PD-L1与PD-1结合
用pH9.6的碳酸盐包被PD-L1-Fc 200ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下包被过夜，用PBST洗涤五次，在37℃温度条件下，在1％BSA-PBS中封闭2h，用5μg/ml的PD-1-His分别稀释AH10-B11、AC9-B11、BH2-B11、AH10-E3、AC9-E3、BH2-E3全抗体及专利CN 102245640A提供的全抗体，所有抗体的起始最高浓度均是50μg/ml，分别经过3倍梯度稀释后，每个全抗体均做12个稀释梯度，在37℃温度条件下孵育1h，用PBST洗涤五次，加入用1％BSA-PBS稀释的HRP标记的小鼠抗His抗体，在37℃温度条件下孵育1h，经过TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色8min，最后用10％H2SO4终止显色，在450nm/630nm下读数，数据如下：
表3全抗体竞争抑制PD-L1与PD-1结合测量的IC50值
克隆 AH10-811 AC9-B11 BH2-B11 AH10-E3 AC9-E3 BH2-E3 CN102245640A
IC50(ng/ml) 108.2 82.04 61.18 136 138 92.73 510
通过表3数据及结果如图6所示，7种全抗均能抑制PD-L1与PD-1的结合，但本发明中筛选出的6株全抗体抑制能力明显强于专利CN 102245640A中的全抗体，此外，从图6和表3数据中还可以得出，这6株不同的单克隆抗体中BH2-B11对于PD-L1与PD-1结合的抑制能力最强。
实验五、混合淋巴细胞反应(MLR)测试抗PD-L1单克隆抗体活性
按密度梯度离心法分离新鲜外周血PBMC，磁珠分选CD14+T细胞；用20ng/mL GM-CSF与10ng/mL IL-4的培养基培养CD14+T细胞，每2天换液，7-10天后诱导成为树突状DC细胞。在树突状DC细胞使用前两天，加入25ng/mL的TNF-α诱导树突状DC细胞为成熟的DC细胞，收集成熟的DC细胞，配制成细胞密度为1x105个/mL细胞悬液。从新鲜PBMC中磁珠分选出CD4+T细胞，计数，制成细胞密度为1x106个/mL细胞悬液。将CD4+T细胞与DC细胞各取100μl，按比例5：1加入96孔板。
将实验二制备的6株抗PD-L1全抗体和专利CN102245640A提供的抗PD-L1全抗体作为阳性对照，用人的IgG(hIgG)作为同型对照，分别进行4倍梯度稀释，每株全抗体均设置6个梯度，各取50μl加入到96孔板中，5天后，cck8测试CD4+T细胞增殖，在450nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
表4混合淋巴细胞反应(MLR)测试抗PD-L1单克隆抗体活性测量的EC50值
克隆 AH10-B11 AC9-B11 BH2-B11 AH10-E3 AC9-E3 BH2-E3 CN102245640A hlqG
EC50(ng/ml) 9.876 7.576 6.728 11.37 11.87 7.706 22.57 -
通过表4数据及如图7所示，本发明筛选出的6株不同的抗PD-L1全抗体的EC50值均明显低于专利CN102245640A提供的抗PD-L1的全抗体，所以本发明提供的抗PD-L1全抗体的活性均高于专利CN102245640A提供的抗PD-L1全抗体，同时说明本发明提供的抗PD-L1单克隆抗体的活性较好，亲和力较强。此外，从图7及表4数据还可以看出，本发明筛选出的6株单克隆抗体中，BH2-B11的活性最高。
实验六、稳定性实验测试
抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂的制备方法：首选通过实验一至五中选择与PD-L1单克隆抗体的结合能力最高、活性最好的抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11作为药效分子备用，然后通过超滤管将分离纯化好的抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11换液至缓冲溶液样品中，并将缓冲溶液样品浓缩后稀释至20mg/ml，用0.22μm过滤器无菌过滤，分装至20ml西林瓶中，10ml/瓶。
(1)不同缓冲剂对制剂稳定性的影响
通过上述方法配置成不同成分含量的9种抗PD-L1单克隆抗体注射制剂作为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的4种抗PD-L1单克隆抗体注射制剂作为对照例样品，不同实验例和对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
表5不同pH值和不同缓冲盐制备的抗PD-L1单克隆抗体注射制剂的具体成分含量表
实验例 抗PD-L1单克隆抗体 缓冲剂 稳定剂 渗透压调节剂 表面活性剂 pH值
实验例1 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM柠檬酸盐缓冲液 125mM海藻糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 5.8
实验例2 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM柠檬酸盐缓冲液 125mM海藻糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例3 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM柠檬酸盐缓冲液 125mM海藻糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.3
实验例4 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM海藻糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 5.8
实验例5 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM海藻糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例6 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM海藻糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.3
实验例7 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM琥珀酸盐缓冲液 125mM海藻糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 5.8
实验例8 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM琥珀酸盐缓冲液 125mM海藻糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例9 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM琥珀酸盐缓冲液 125mM海藻糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.3
对照例1 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM海藻糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 5.6
对照例2 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM海藻糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.5
对照例3 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM柠檬酸盐缓冲液 125mM海藻糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 5.7
对照例4 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM柠檬酸盐缓冲液 125mM海藻糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.4
将表5中的实验例样品和对照例样品同时放置37℃的样品分别于第2周和第4周取出进行分析检测，检测项目包括SEC-HPLC和CEX-HPLC。
分析检测方法：总聚集体检测，采用大小排阻层析高效液相色谱法分析；电荷异构体：采用阳离子交换色谱法测定电荷异构体主峰含量。
通过大小排阻层析高效液相色谱法(SEC-HPLC)考察抗PD-L1单克隆抗体注射制剂在37℃条件下放置1周、2周和4周后的蛋白总聚集水平，通过CEX-HPLC方法考察抗PD-L1单克隆抗体注射制剂在37℃条件下放置2周和4周后的主峰含量，从而确定抗体稳定的最适缓冲液和最佳pH值。以试验起始(0w)、放置1w、2w和4w的蛋白总聚集体及主峰含量，计算主峰下降速率(％/周)；数据汇总如下表6所示。
表6实验例和对照例提供的抗体在不同pH值和不同缓冲盐下稳定性数据汇总表
Figure BDA0002334874700000131
Figure BDA0002334874700000141
通过表6数据得知，抗PD-L1单克隆抗体注射制剂在37℃条件下加速4周，从纯度及电荷异构体主峰含量下降速率考察，通过实验例1-9相比得知，本发明实验例4-6提供的抗PD-L1单克隆抗体在组氨酸盐酸盐缓冲液中高温加速4周，纯度高于在柠檬酸盐缓冲液或琥珀酸盐缓冲液中，所以组氨酸盐酸盐缓冲液能够保证抗PD-L1单克隆抗体在注射制剂中的稳定性，实验例1-6与对照例1-4相比，37℃条件下加速4周，随着时间的延长，各制剂组的酸区逐渐升高，碱区降低，通过上述数据可以看出，本发明提供的抗PD-L1单克隆抗体适宜的pH范围在5.8-6.3下能够有效保证蛋白纯度，而且主峰含量波动较小，任意超出该范围，蛋白稳定性将降低，与其他实验例相比，因此可以说明，本发明提供的组氨酸盐酸盐缓冲液更为稳定，而且最适宜pH范围在5.8-6.3之间最为稳定，优选pH6.0。
(2)不同稳定剂对制剂稳定性影响
通过实验一至五中选择与PD-L1的结合能力最高、活性最好的抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11作为药效分子备用，然后通过上述制剂制备方法配置成不同成分含量的19种抗PD-L1单克隆抗体注射制剂作为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的4种抗PD-L1单克隆抗体注射制剂作为对照例样品，不同实验例和不同对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
表7不同稳定剂的抗PD-L1单克隆抗体注射制剂的具体成分含量表
实验例 抗PD-L1单克隆抗体 缓冲剂 稳定剂 渗透压调节剂 表面活性剂 pH值
实验例1 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 150mM蔗糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例2 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM蔗糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例3 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 100mM蔗糖 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例4 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 100mM甘露醇 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例5 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘露醇 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例6 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 150mM甘露醇 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例7 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 100mM甘氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例8 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例9 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 150mM甘氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例10 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 100mM蛋氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例11 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM蛋氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例12 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 150mM蛋氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例13 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 100mM精氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例14 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM精氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例15 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 150mM精氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例16 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 60mM海藻糖+65mM甘氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例17 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 60mM海藻糖+65mM甘露醇 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例18 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 60mM蛋氨酸+65mM精氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例19 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 60mM精氨酸+65mM甘氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
对照例1 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 85mM甘氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
对照例2 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 170mM甘氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
对照例3 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 90mM甘露醇 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
对照例4 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 160mM甘露醇 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
将上述表7提供的实验例样品和对照例样品同时在37℃的温度条件下放置，并分别于第2周和第4周取出进行分析检测，检测项目包括SEC-HPLC和CEX-HPLC。
表8实验例和对照例提供的抗体在不同稳定剂下稳定性数据汇总表
Figure BDA0002334874700000151
Figure BDA0002334874700000161
通过表8数据得知，抗PD-L1单克隆抗体注射制剂在37℃条件下加速4周，从纯度及电荷异构体主峰含量下降速率考察，通过实验例1-19相比得知，本发明在选择不同的稳定剂时，在高温下加速4周后，纯度和主峰均有下降，但变化均比较小，相对于其他实验例，实验例7-9提供的抗PD-L1单克隆抗体注射制剂选择使用甘氨酸为稳定剂，高温加速4周后，纯度高于选择其他稳定剂，而且主峰含量变化较小，注射制剂中选择甘氨酸作为稳定剂能够有效提高注射制剂中抗PD-L1单克隆抗体的稳定性；此外，实验例7-9与对照例1-2相比，37℃条件下加速4周，随着时间的延长，不同含量的甘氨酸均会影响单抗的稳定性，但是对照例1-2提供的稳定剂含量相对实验例7-9对主峰含量和纯度变化较大，所以稳定剂含量最佳范围为100-150mM，略高或略低，均有可能影响抗PD-L1单克隆抗体的稳定性。
(3)不同渗透压调节剂对制剂稳定性影响
通过实验一至五中选择与PD-L1的结合能力最高、活性最好的抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11作为药效分子备用，然后通过上述制剂制备方法配置成不同成分含量的18种抗PD-L1单克隆抗体注射制剂作为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的2种抗PD-L1单克隆抗体注射制剂作为对照例样品，不同实验例和不同对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
表9不同渗透压调节剂的抗PD-L1单克隆抗体注射制剂的具体成分含量表
实验例 抗PD-L1单克隆抗体 缓冲剂 稳定剂 渗透压调节剂 表面活性剂 pH值
实验例1 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 10mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例2 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 55mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例3 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 100mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例4 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 10mM氯化镁 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例5 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 55mM氯化镁 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例6 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 100mM氯化镁 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例7 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 10mM葡萄糖 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例8 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 55mM葡萄糖 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例9 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 100mM葡萄糖 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例10 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 10mM山梨醇 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例11 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 55mM山梨醇 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例12 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 100mM山梨醇 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例13 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 10mM柠檬酸钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例14 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 55mM柠檬酸钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例15 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 100mM柠檬酸钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例16 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 41.25mM氯化钠+13.75mM柠檬酸钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例17 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 41.25mM氯化钠+13.75mM葡萄糖 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
实验例18 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 41.25mM氯化钠+13.75mM山梨醇 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
对照例1 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 108mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
对照例2 20mg/ml抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11 20mM组氨酸盐酸盐缓冲液 125mM甘氨酸 8mM氯化钠 0.02％(w/v)TritonX100 6.0
将上述表9提供的实验例样品和对照例样品同时在37℃的温度条件下放置，并分别于第2周和第4周取出进行分析检测，检测项目包括SEC-HPLC和CEX-HPLC。
表10实验例和对照例提供的抗体在不同渗透压调节剂下稳定性数据汇总表
Figure BDA0002334874700000171
通过表10数据得知，抗PD-L1单克隆抗体注射制剂在37℃条件下加速4周，从纯度及电荷异构体主峰含量下降速率考察，通过实验例1-18相比得知，本发明在选择不同的渗透压调节剂时，在高温下加速4周后，纯度和主峰均有下降，但变化均比较小，相对于其他实验例，实验例16提供的抗PD-L1单克隆抗体注射制剂选择使用含量比为3:1的氯化钠和柠檬酸钠的混合物，高温加速4周后，纯度高于选择其他实验例制剂，而且主峰含量变化较小，所以渗透压调节剂最优选择含量比为3:1的氯化钠和柠檬酸钠的混合物；此外，实验例1-3与对照例1和对照例2相比，渗透压调节剂含量最佳范围为10-100mM，略高或略低，均有可能影响抗PD-L1单克隆抗体的稳定性；而且通过实验例1-18对比能够得知，最优选的渗透压调节剂含量为55mM。
(4)不同表面活性剂对制剂稳定性影响
通过实验一至五中选择与PD-L1的结合能力最高、活性最好的抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11作为药效分子备用，然后通过上述制剂制备方法配置成不同成分含量的15种抗PD-L1单克隆抗体注射制剂作为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的2种抗PD-L1单克隆抗体注射制剂作为对照例样品，不同实验例和不同对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
表11不同表面活性剂的抗PD-L1单克隆抗体注射制剂的具体成分含量表
Figure BDA0002334874700000181
将上述表11提供的实验例样品和对照例样品同时在37℃的温度条件下放置，并分别于第2周和第4周取出进行分析检测，检测项目包括SEC-HPLC和CEX-HPLC。
表12实验例和对照例提供的抗体在不同表面活性剂下稳定性数据汇总表
Figure BDA0002334874700000182
Figure BDA0002334874700000191
通过表12数据得知，抗PD-L1单克隆抗体注射制剂在37℃条件下加速4周，从纯度及电荷异构体主峰含量下降速率考察，通过实验例1-15相比得知，本发明在选择不同的表面活性剂时，在高温下加速4周后，纯度和主峰均有下降，但变化均比较小，相对于其他实验例，实验例13提供的抗PD-L1单克隆抗体注射制剂选择使用含量比为1:1的TritonX100和聚山梨酯80的混合物，高温加速4周后，纯度高于选择其他实验例制剂，而且主峰含量变化较小，所以表面活性剂最优选择含量比为1:1的TritonX100和聚山梨酯80的混合物；此外，实验例7-9与对照例1和对照例2相比，表面活性剂含量最佳范围为0.005％-0.05％(w/v)，略高或略低，均有可能影响抗PD-L1单克隆抗体的稳定性。
(5)不同抗体蛋白浓度对制剂的影响
通过实验一至五中选择与PD-L1的结合能力最高、活性最好的抗PD-L1单克隆抗体BH2-B11作为药效分子备用，然后通过上述制剂制备方法配置成不同成分含量的5种抗PD-L1单克隆抗体注射制剂作为实验例样品，不同实验例提供的制剂包括以下含量的成分：
表13不同抗体蛋白含量制备的抗PD-L1单克隆抗体注射制剂的具体成分含量表
Figure BDA0002334874700000192
将表13提供的实验例样品在37℃的环境下放置，并于第2周和第4周取出进行分析检测，检测项目包括SEC-HPLC和CEX-HPLC。
表14不同实验例提供的制剂在抗体蛋白不同含量下稳定性数据汇总表
Figure BDA0002334874700000201
从表14可以看出，在不同的蛋白浓度下，上述不同浓度的抗体蛋白的抗PD-L1单克隆抗体注射制剂的纯度和电荷异构体主峰含量均有很好的稳定性。但是通过对比，随着浓度的增加或减少，总聚集体也在增加，蛋白纯度在降低，本发明提供的最优抗体蛋白浓度为18-30mg/ml为最适宜制剂浓度，最优选为20mg/ml。
通过实验六，筛选出能够使抗PD-L1单克隆抗体结构最稳定的缓冲溶液成分及最优选的成分含量，通过上述制备方法制备成抗PD-L1单克隆抗体注射制剂，该注射制剂包括以下含量的成分：
a)蛋白含量为18-30mg/ml的抗PD-L1单克隆抗体；
b)浓度为10-60mM的组氨酸盐酸盐缓冲液；
c)浓度为100-150mM的甘氨酸；
d)浓度为10-100mM的渗透压调节剂，渗透压调节剂为氯化钠和柠檬酸钠的混合物，氯化钠与柠檬酸钠的含量比为3:1；
e)0.005％-0.05％(w/v)的表面活性剂，表面活性剂为TritonX100和聚山梨酯80的混合物，TritonX100和聚山梨酯80的含量比为1:1；
其中，所述注射制剂的pH值为6.0。
实验七、处方验证实验
将实验六中筛选得到的最优的辅料和药效成分制成的抗PD-L1单克隆抗体注射制剂进行处方验证试验，处方验证试验包括冻融稳定性试验和振摇稳定性试验。
(1)冻融稳定性试验
将上述抗PD-L1单克隆抗体注射制剂浓缩至10mg/ml、18mg/ml、20mg/ml、30mg/ml和60mg/ml，进行冻融稳定性试验，分别冻融1、2、3次。考察制剂外观、蛋白纯度和电荷异构体主峰含量，结果如下表15所示。
表15抗体制剂冻融稳定性结果汇总
Figure BDA0002334874700000211
(2)振摇稳定性试验：
将上述抗PD-L1单克隆抗体注射制剂浓缩至10mg/ml、18mg/ml、20mg/ml、30mg/ml和60mg/ml，进行振摇稳定性试验，分别进行室温水平振摇(80-120rpm)和圆周振摇(30rpm)3天。考察制剂外观、蛋白纯度和电荷异构体主峰含量，结果如下表16所示。
表16抗体制剂振摇稳定性试验结果汇总
Figure BDA0002334874700000221
从表15和表16可以看出，由外观可以看出，不同浓度蛋白经过冻融试验及振摇试验均澄清透明，无可见异物，蛋白物理稳定性良好；从总聚集体可以看出，不同浓度蛋白均很稳定，聚集体未增加，由振摇试验可以看出，不同浓度蛋白均很稳定；从电荷异构体主峰含量可以看出，不同浓度蛋白经过冻融试验及振摇试验均未有明显变化。由以上实验证明，抗PD-L1单克隆抗体注射制剂的蛋白浓度在10-60mg/ml，均很稳定，更优选为18-30mg/ml。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技有限公司
<120> 一种抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Trp Thr Leu Ser Asp Ser
20 25 30
Leu Gln His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Gln Ser Ala Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Tyr Tyr Thr Ala Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Cys Thr Trp Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Asp His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Asp Tyr Glu Ser Thr Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Asn Ala Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Trp Ser Asp Ser
20 25 30
Tyr Lys His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
His Trp Asn Ser Thr Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Phe Ala Ser Thr Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile His Asn Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Arg Arg Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu His Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 6
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(SIPOSequenceListing 1.0)
<400> 7
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (10)

1.一种抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述注射制剂包括以下含量的成分：
a)蛋白含量为10-60mg/ml的抗PD-L1单克隆抗体；
b)浓度为10-60mM的缓冲剂；
c)浓度为100-150mM的稳定剂；
d)浓度为10-100mM的渗透压调节剂；
e)0.005％-0.05％(w/v)的表面活性剂；
其中，所述注射制剂的pH值为5.8-6.3。
2.如权利要求1所述的抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述抗PD-L1单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3；所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5；
优选的，所述抗PD-L1单克隆抗体的蛋白含量为18-30mg/ml。
3.如权利要求2所述的抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述抗PD-L1单克隆抗体还包括重链恒定区，所述重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种；
优选的，所述重链恒定区为人的IgG1。
4.如权利要求1所述的抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲液、组氨酸盐酸盐缓冲液或琥珀酸盐缓冲液；
优选的，所述缓冲剂为组氨酸盐酸盐缓冲液。
5.如权利要求1所述的抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述稳定剂包括蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸、蛋氨酸、精氨酸中的一种或多种混合；
优选的，所述稳定剂为甘氨酸。
6.如权利要求1所述的抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述渗透压调节剂包括氯化钠、氯化镁、葡萄糖、山梨醇、柠檬酸钠中的一种或多种混合。
7.如权利要求6所述的抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述渗透压调节剂为所述氯化钠和所述柠檬酸钠的混合物，所述氯化钠与所述柠檬酸钠的含量比为3:1。
8.如权利要求1所述的抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80、TritonX100、聚乙二醇中的一种或多种混合。
9.如权利要求8所述的抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述表面活性剂为所述TritonX100和所述聚山梨酯80的混合物，所述TritonX100和所述聚山梨酯80的含量比为1:1。
10.一种权利要求1-9任一项所述的抗PD-L1单克隆抗体的注射制剂用于制备治疗癌症疾病药物中的应用；
优选的，所述癌症疾病包括膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤或黑色素瘤。
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