CN111424014A - 人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基，所述培养基至少包括：细胞培养添加剂、血清、抗生素和基础培养基，所述细胞培养添加剂包括人源血管内皮生长因子、人表皮生长因子、人源碱性成纤维细胞生长因子、人胰岛素生长因子、氢化可的松琥珀酸酯和维生素C。本发明的培养基能有效的维持人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的增殖活性及生理学特性，有助于获得稳定生长传代及具备较好生理学特性的颈静脉球副神经瘤细胞株，使得该细胞株能够做到规模化的培养。

Description

人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基
技术领域
本发明涉及医疗领域，特别是涉及一种人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基。
背景技术
目前对人颈静脉球副神经节瘤的研究主要局限于临床研究，由于缺乏合适的细胞株使得肿瘤发生与发展的基础研究受限极大。人颈静脉球副神经节瘤细胞株受限的一大原因为缺乏合适的培养基。
现有的人颈静脉球副神经节瘤细胞株培养液主要是通过利用DMEM/F12培养基加10％的胎牛血清及1％的双抗为全培养基进行人颈静脉球副神经节瘤原代细胞的培养，但培养效果不明显，原代细胞增殖活性较差，无法有效的维持人颈静脉球副神经节瘤细胞的增殖活性及生理学特性，很难用于基础研究，如何提供一种培养效果好的细胞株专用培养液成为研究课题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基，所述培养基至少包括：细胞培养添加剂、血清、抗生素和基础培养基，所述细胞培养添加剂包括人源血管内皮生长因子、人表皮生长因子、人源碱性成纤维细胞生长因子、人胰岛素生长因子、氢化可的松琥珀酸酯和维生素C。
本发明第二方面提供前述人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基用于培养人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的用途。
本发明第三方面提供一种人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的培养方法，至少包括以下步骤：将人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞放置于前述的培养基中，在适合细胞生长的环境中进行培养。
如上所述，本发明的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基，具有以下有益效果：
本发明的培养基能有效的维持人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的增殖活性及生理学特性，有助于获得稳定生长传代及具备较好生理学特性的颈静脉球副神经瘤细胞株，使得该细胞株能够做到规模化的培养。
附图说明
图1.各种培养液配方对人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞增殖活性影响。
图2.100X显微镜下颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的形态。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明所述的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的培养方法均不涉及诊断和治疗目的。可以为保健目的，或者为基础研究目的。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
本实施例的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基，至少包括：细胞培养添加剂、血清、抗生素和基础培养基，所述细胞培养添加剂包括：
人源血管内皮生长因子(human vascular endothelial growth factor，hVEGF)、
人表皮生长因子(human Epidermal Growth Factor，hEGF)、
人源碱性成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor,Basic,Human，hFGFbasic)、
人胰岛素生长因子(Human Insulin-like Growth Factor，hIGF-1)
氢化可的松琥珀酸酯(Hydrocortisone hemisucinate)
和维生素C(Ascorbic acid)。
可选的，所述人源血管内皮生长因子为重组人源血管内皮生长因子(rhVEGF)。
可选的，人表皮生长因子为基因重组人表皮生长因子(rhEGF)。
可选的，所述人源碱性成纤维细胞生长因子为人源重组碱性成纤维细胞生长因子(rhFGF basic)。
可选的，所述人胰岛素生长因子为重组人胰岛素生长因子(rhIGF-1)。
进一步的，以所述培养基总量为基准计，所述培养基各组分的含量为：
细胞培养添加剂 质量分数为1％-3％；
血清 质量分数为5％-10％；
抗生素 1％；
余量为基础培养基。
可选的，细胞培养添加剂的质量分数为1％-1.5％，1.5％-2％，2％-2.5％，2.5％-3％。
可选的，血清的质量分数为5％-6％，6％-7％，7％-8％，8％-9％，9％-10％。
进一步的，以细胞培养添加剂的总量为基准计，所述细胞添加剂各组分含量为：
Figure BDA0002491966800000031
在一种实施方式中，所述血清选自胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)。
在一种实施方式中，所述抗生素选自青霉素-链霉素双抗(penicillin/streptomycin)。
在一种实施方式中，所述基础培养基选自DMEM/F-12培养基。
优选的，所述培养基的pH值为7.55-7.70。
所述培养基可以为液体培养基。
所述培养基的颜色为淡红色。
所述培养基的渗透压(Osmolality)为：317mOsm/kg。
前述的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基可以用于培养人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株。
本实施例的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的培养方法，至少包括以下步骤：将人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞放置于前述的培养基中，在适合细胞生长的环境中进行培养。
本发明中的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株可以为其保藏号为：CGMCCNO.19664的细胞株PGL-626。
细胞株保藏信息如下：
细胞株名称：PGL-626
保藏号为：CGMCC NO.19664；
保藏日期：2020年04月09日；
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位简称：CGMCC
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
该细胞株的科学描述为人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株。
实施例1细胞培养添加剂的制备
细胞细胞培养添加剂成分及浓度如下：
Figure BDA0002491966800000041
(注：添加剂配成该浓度100X，500ul的混合液，-20度保存，每次使用时1％加入培养液)
配制方法：
在每个50ml离心管中加入(1)500ul添加剂(100X)，(2)500ul双抗(100units/mlpenicillin,100ug/ml streptomycin,100X)，(3)50ml x 5％(2.5ml)的胎牛血清(FBS)，(4)肿瘤基础培养基46.5ml[50x(1-血清百分比)-1]。配制完成后盖上盖子，颠倒混匀备用。
配制好的培养基置于4度避光保存。由于添加剂中有很多重组蛋白，易发生降解，故配制好的完全培养基有效期仅为3-4周，须尽快使用。因此每次配制1-2管(50-100ml),当然使用量大的情况下也可以适量增加配制。
实施例2细胞培养液1的制备
一种人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养液，由以下质量百分比的原料组成：胎牛血清10％、青链霉素双抗混合液1％、采用MEM/HIGH GLUCOSE(#SH30243.01,Hyclone)作为肿瘤基础培养基，pH保持为7.9。
实施例3细胞培养液2的制备
一种人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养液，由以下质量百分比的原料组成：胎牛血清10％、青链霉素双抗混合液1％、采用DMEM/F-12(#1132033,GibcoThermoFisher)作为肿瘤基础培养基，pH保持为7.85。
实施例4细胞培养液3的制备
一种人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养液，由以下质量百分比的原料组成：胎牛血清20％、青链霉素双抗混合液1％、采用DMEM/F-12(#1132033,GibcoThermoFisher)作为肿瘤基础培养基，pH保持为7.86。
实施例5细胞培养液4的制备
一种人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株专用培养液，由以下质量百分比的原料组成：胎牛血清10％、实施例1中制备的细胞培养添加剂3％、青链霉素双抗混合液1％、采用DMEM/F-12(#1132033,Gibco ThermoFisher)作为肿瘤基础培养基，pH保持为7.68。
实施例6细胞培养液5的制备
一种人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株专用培养液，由以下质量百分比的原料组成：胎牛血清5％、实施例1中制备的细胞培养添加剂2％、青链霉素双抗混合液1％、采用DMEM/F-12(#1132033,Gibco ThermoFisher)作为肿瘤基础培养基，pH保持为7.55。
实施例7细胞培养液6的制备
一种人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株专用培养液，由以下质量百分比的原料组成：胎牛血清5％、实施例1中制备的细胞培养添加剂1％、青链霉素双抗混合液1％、采用DMEM/F-12(#1132033,Gibco ThermoFisher)作为肿瘤基础培养基，pH保持为7.70。
上述实施例5、6、7中，所述的细胞培养添加剂包括以下浓度的添加剂：5ng/ml重组人源血管内皮生长因子、5ng/ml基因重组人表皮生长因子、5ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、15ng/m重组人胰岛素生长因子、1ug/ml氢化可的松琥珀酸单酯、50ug/ml维生素C。
实施例8
分别利用上述实施例2-7的不同配方的细胞培养液处理同一批次培养的待测细胞，每100uL细胞培养液培养人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞，每种细胞培养液进行3次重复，将细胞和细胞培养液混匀后种板(96孔板)，在37度，5％CO2的恒温培养箱内培养24-48H，加入10ul CCK8(#CK04Dojindo)处理1-2H后在酶标仪450nm下测定吸光度值，再按照CCK8试剂盒方法计算细胞增殖活性率(原始结果如表1所示)。实验结果显示细胞培养液6进行培养细胞增殖活性明显较其他的培养液配方好，结果如下：
表1.各种培养液配方对人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞活性影响
Figure BDA0002491966800000061
以上表1和图1结果显示，本发明细胞培养液4、5、6(即实验组)与细胞培养液1、2、3(常规肿瘤培养液配方，对照组)相比能明显维持人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞的增殖活性，其中，细胞培养液6的效果最好；再调整培养配方后的细胞培养液4、5在维持人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞增殖活性上仍不及细胞培养液6。本实验组采用T检验(P<0.05)差异有统计学意义。
本发明实施例7的永生化细胞株专用培养液的配制方法如前所述：在每个50ml离心管中加入500ul细胞培养添加剂(100X)，500ul青链霉素双抗混合液(100units/mlpenicillin,100ug/ml streptomycin,100X)，(3)50ml x 5％(2.5ml)的胎牛血清，(4)肿瘤基础培养基46.5ml[50x(1-血清百分比)-1]。配制完成后盖上盖子，颠倒混匀备用。继续使用本发明培养后观察细胞形态变化，100X显微镜下照片如图2所示，可以看出本发明能够维持人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株较好的细胞增殖活性外，还能维持细胞良好的形态，因此本发明较其他的细胞培养液有优势，有助于后续的实验研究。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基，其特征在于，所述培养基至少包括：细胞培养添加剂、血清、抗生素和基础培养基，所述细胞培养添加剂包括人源血管内皮生长因子、人表皮生长因子、人源碱性成纤维细胞生长因子、人胰岛素生长因子、氢化可的松琥珀酸酯和维生素C。
2.如权利要求1所述的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基，其特征在于，以所述培养基总量为基准计，所述培养基各组分的含量为：
细胞培养添加剂 质量分数为1％-3％；
血清 质量分数为5％-10％；
抗生素 1％；
余量为基础培养基。
3.如权利要求1所述的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基，其特征在于，以细胞培养添加剂的总量为基准计，所述细胞添加剂各组分含量为：
Figure FDA0002491966790000011
4.如权利要求1所述的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基，其特征在于，所述血清选自胎牛血清。
5.如权利要求1所述的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基，其特征在于，所述抗生素选自青霉素-链霉素双抗。
6.如权利要求1所述的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基，其特征在于，所述基础培养基选自DMEM/F-12培养基。
7.如权利要求1所述的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基，其特征在于，所述培养基的pH值为7.55-7.70。
8.如权利要求1所述的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基，其特征在于，所述培养基为液体培养基。
9.如权利要求1-7任一所述的人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株培养基用于培养人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的用途。
10.一种人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞株的培养方法，至少包括以下步骤：将人颈静脉球副神经节瘤永生化细胞放置于权利要求1-7任一所述的培养基中，在适合细胞生长的环境中进行培养。
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