CN108310014B - 一种干细胞制剂及其制备方法与在制备防治肺损伤的药物中的应用 - Google Patents

一种干细胞制剂及其制备方法与在制备防治肺损伤的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种干细胞制剂及其制备方法与在制备防治肺损伤的药物中的应用。本发明提供的干细胞制剂由水、电解质、间充质干细胞、土木香内酯组成。实验表明，本发明提供的干细胞制剂具有良好的抗炎作用，可显著地降低放射线照射动物血液中炎症因子的水平，且对辐射造成的肺组织损伤有显著的保护作用。与单纯胎盘间充质干细胞或单纯土木香内酯尾静脉注射相比较，注射胎盘间充质干细胞和土木香内酯的胎盘间充质干细胞制剂效果更为显著。

Description

一种干细胞制剂及其制备方法与在制备防治肺损伤的药物中 的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种干细胞制剂及其制备方法与在制备防治肺损伤的药物中的应用。
背景技术
肺(lung)是呼吸系统的重要器官，由支气管、细支气管、呼吸性细支气管、肺泡道和肺泡构成。钝性伤、严重的肺部感染、肺栓塞、肺部手术、辐射等都会造成肺组织的损伤，表现为胸痛、胸闷、气促和血痰；呼吸困难、发绀等，解剖可见肺组织充血、出血等。肺是人体中对辐射较为敏感的器官，而随着核能和核技术等在医疗卫生、科学研究、工农业生产和国防中的大量应用，放射性肺损伤(radiation-induced lung injury，RILI)的发病率逐步提升。
核辐射是原子核从一种结构或一种能量状态转变为另一种结构或另一种能量状态过程中所释放出来的微观粒子流。核辐射可以使物质引起电离或激发，故称为电离辐射。随着科技的发展，辐射与人们的工作和日常生活越来越密切。受辐射的人员也越来越多，损害也越来越严重，潜在的巨大危险不容忽视。
胸部恶性肿瘤，如肺癌、食管癌、乳腺癌等是我国常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升的趋势，是我国居民最主要的死亡原因之一。作为肿瘤治疗的基本手段之一，放射治疗应用历史已逾百年，其目的在于对确定的肿瘤给予精确地电离辐射已达到杀伤肿瘤作用，同时使周围的正常组织受到最小的损伤。由于，肿瘤放射治疗等放射性照射可使肺组织受到超过其生物效应阈值的放射线剂量，而导致不同程度的细胞损伤，而肺部对辐射又较为敏感，因此，放射性肺损伤是胸部肿瘤放疗、骨髓移植预处理及核辐射后常见的并发症。另外，随着人类活动空间的不断扩大，建立月球基地和飞往火星已被列入21世纪的航天计划，宇航员也会受到地球带电粒子、太阳宇宙射线等各种电离辐射的照射，造成不同程度的损伤。
放射性肺损伤严格意义上讲是无菌性炎症，一旦发生往往不可逆转，因此预防比治疗更为重要。但是，由于对放射性肺损伤发生机制认识的局限性，数十年来有关放射性肺损伤的治疗一直没有突破性发展。临床上只能通过尽可能地缩小照射范围或降低靶区剂量，来降低放射性肺损伤发生的可能。然而，肿瘤靶区剂量的限制，势必会影响肿瘤的局控率。一旦发生放射性肺损伤，目前临床上最常用的治疗方法是使用肾上腺皮质激素联合抗生素，虽然大剂量激素可暂时有效缓解症状，抑制肺纤维化的发展，但却容易产生诸多并发症。
并且，最近研究表明，放射性肺损伤的发生发展是一个由多种细胞，多种细胞因子和炎症介质相互作用而发生的复杂疾病。而由于放射性肺损伤病理机制的多环节及复杂性，单一环节或靶向的治疗效果尚不理想，临床上仍然缺乏防治放射性肺损伤的有效药物。阿米福叮(amifostine,AMSF)是目前世界上唯一比较成熟的应用于临床的放射性肺损伤防护剂。遗憾的是，AMSF价格昂贵，很少患者能够负担，而且也存在较大毒副作用，临床上难以广泛应用。传统的中药制剂对治疗肺损伤能够对症施治，但是中药制剂治疗缓慢，用药配方复杂，而且大多只能缓解改善症状，因此，亟需寻求一种安全性好、疗效佳的治疗方案。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是起源于中胚层发育早期的具有多能干细胞特点的一类干细胞，具有自我更新能力和多分化潜能。实验证明，间充质干细胞在特定培养环境中能分化为多种系统、器官、组织或者细胞，具有低免疫原性、免疫调节和靶向迁移等优点。近年来间充质干细胞为许多疾病的治疗提供了新的思路及方法，并显示出了初步疗效。胎盘间充质干细胞是间充质干细胞的一种，胎盘间充质干细胞基因稳定、不易突变，动物实验证明无致瘤性，使用安全可靠，而且取材方便，数量充足，增殖能力强，是对适应症范围疾病治疗效果好，优于传统的治疗手段。
土木香内酯是传统中草药土木香的活性物质，为倍半萜类化合物，分子式为C15H20O2，分子量为232.32g/moL，为白色针状晶体。现有文献表明，土木香内酯具有多种生物活性，如杀幼虫活性、抗真菌、驱虫活性、抑菌作用、抗炎作用、抗肿瘤等作用。
但目前的研究未表明间充质干细胞和土木香内酯具有抗辐射，或治疗肺损伤的功能。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种干细胞制剂及其制备方法与在制备防治肺损伤的药物中的应用，该干细胞制剂对肺部损伤的防治作用显著。
本发明提供的干细胞制剂由水、电解质、间充质干细胞、土木香内酯组成；所述电解质选自氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾、氯化镁中至少一种。
本发明提供的干细胞制剂中，所述间充质干细胞为胎盘间充质干细胞，其密度为1×105个/mL～1×107个/mL。一些具体实施例中，所述胎盘间充质干细胞的密度为5×105个/mL。
本发明干细胞制剂中，所述胎盘间充质干细胞为第3-8代的胎盘间充质干细胞。
本发明所述的胎盘间充质干细胞是通过以下技术方案制备的：
采用组合酶消化法，将胎盘组织经消化后，接种于培养瓶中进行贴壁培养，传至3～8代，进行细胞表面标志、细胞分化潜能和细胞周期鉴定，之后加入保护液制成1×105个/mL～1×107个/mL胎盘间充质干细胞的细胞悬液，用于制备干细胞制剂。
具体实施例中，组合酶消化法采用透明质酸酶、中性蛋白酶和I型胶原蛋白酶作为消化酶。所述消化的消化液中含有0.5～5.0U/mL透明质酸酶、0.1～2.0mg/mL中性蛋白酶、0.1％～0.5％I型胶原蛋白酶、50％DMEM、50％F12培养基。
所述接种至完全培养基，具体为DMEM培养基与F12培养基等体积混合的培养基，其中还含有0.1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、10％胎牛血清，5～20ng/L bFGF。
所述细胞表面标志物鉴定，包括CD14、CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105，主要通过流式细胞术鉴定上述标志物的表达情况，胎盘间充质干细胞不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR分子，高表达CD73、CD90、CD105分子。上述不表达的表面标志分子需≤2％，高表达的表面标志分子需≥95％，方为合格的胎盘间充质干细胞。
所述细胞周期是通过流式细胞术鉴定的，需观察细胞处于G0/G1期的数目是否在60％以上。处于G0/G1期的细胞数目在60％以上为合格的胎盘间充质干细胞。
所述细胞分化需在细胞分化培养后能分化为成骨细胞、软骨细胞与脂肪细胞。
所述细菌、内毒素及支原体检测需为阴性。
所述检测项目全部符合规定，方可用于制备胎盘间充质干细胞制剂，并应用于放射性肺损伤的预防和治疗。细胞的鉴定方法可根据选用的方法及试剂盒的不同更改判定标准。
所述的土木香内酯为商品化的纯度大于98％的产品，本发明提供的干细胞制剂中，所述土木香内酯的浓度为0.24mg/mL～7.8mg/mL。一些具体实施例中，所述土木香内酯的浓度为0.24mg/mL。
本发明提供的干细胞制剂中，所述电解质为氯化钠5.26mg/mL、葡萄糖酸钠5.02mg/mL、醋酸钠3.68mg/mL、氯化钾0.37mg/mL、氯化镁0.3mg/mL。
一些具体实施例中，本发明提供的干细胞制剂由水、氯化钠5.26mg/mL、葡萄糖酸钠5.02mg/mL、醋酸钠3.68mg/mL、氯化钾0.37mg/mL、氯化镁0.3mg/mL、胎盘间充质干细胞1×105个/mL～1×107个/mL和土木香内酯0.24mg/mL～7.8mg/mL组成。
一个具体实施例中，本发明提供的干细胞制剂由水、氯化钠5.26mg/mL、葡萄糖酸钠5.02mg/mL、醋酸钠3.68mg/mL、氯化钾0.37mg/mL、氯化镁0.3mg/mL、胎盘间充质干细胞5×105个/mL和土木香内酯0.24mg/mL组成。
所述干细胞制剂中的水为双蒸水。
本发明提供的干细胞制剂的制备方法包括：将电解质溶解于水制备保存液；将间充质干细胞以所述保存液重悬后，加入土木香内酯，制得干细胞制剂。
所述保存液制备后，重悬间充质干细胞前，还包括灭菌的步骤。所述灭菌采用过滤灭菌，所述过滤采用0.22μm滤膜。
本发明提供的干细胞制剂在制备降低炎症因子水平的药物中的应用。
本发明中，所述炎症因子为IL-6、MCP-1和/或TGF-β1。
实验表明，经干细胞注射，实验一组(20Gy照射+照射后4小时注射单纯干细胞)、实验二组(20Gy照射+照射后4小时注射干细胞制剂)、实验三组(20Gy照射+照射后4小时注射单纯土木香内酯)、实验四组(20Gy照射+照射前24小时注射单纯干细胞)、实验五组(20Gy照射+照射前24小时注射干细胞制剂)和实验六组(20Gy照射+照射前24小时注射单纯土木香内酯)的受辐射动物血液中炎症相关细胞因子IL-6、MCP-1及TGF-β1含量降低，尤以实验二组和实验五组降低明显，说明在本发明的胎盘间充质干细胞制剂较单纯的胎盘间充质干细胞有更好的抗炎作用，可更好地降低放射线照射对动物造成的损伤，利于机体的恢复。
本发明提供的干细胞制剂在制备防治肺损伤的药物中的应用。
本发明通过实验证明，无论是单纯胎盘间充质干细胞尾静脉注射，还是胎盘间充质干细胞制剂尾静脉注射对放射性肺损伤均具有预防作用，也具有治疗作用。与单纯胎盘间充质干细胞或单纯土木香内酯尾静脉注射相比较，注射胎盘间充质干细胞和土木香内酯的胎盘间充质干细胞制剂效果更为显著。
本发明中，所述肺损伤为放射性肺损伤；所述放射性肺损伤为电离辐射所致的放射性肺损伤；所述电离辐射为X射线辐射、重离子辐射或γ射线辐射。具体实施例中，造模采用γ射线辐射。
本发明还提供了一种防治肺损伤的药物，包括本发明所述的干细胞制剂。
本发明所述的药物的剂型为注射剂，防治肺损伤的胎盘间充质干细胞剂量为1×105～1×107个细胞/kg体重，土木香内酯剂量为0.24～7.8mg/kg体重。
本发明还提供了一种防治肺损伤的方法，为给予本发明所述的干细胞制剂。
本发明提供的干细胞制剂由水、电解质、间充质干细胞、土木香内酯组成。实验表明，本发明提供的干细胞制剂具有良好的抗炎作用，可显著地降低放射线照射动物血液中炎症因子的水平，且对辐射造成的肺组织损伤有显著的保护作用。与单纯胎盘间充质干细胞或单纯土木香内酯尾静脉注射相比较，注射胎盘间充质干细胞和土木香内酯的胎盘间充质干细胞制剂效果更为显著。
附图说明
下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1示第8代胎盘间充质干细胞的流式细胞表面标志物的检测结果；其中，图1-a为同型对照，用同型对照抗体进行标记，发现未被标记的细胞为99.63％，被PE非特异标记的细胞为0.31％，被FITC非特异标记的细胞为0.23％，说明抗体非特异标记率较低，实验体系可信；图1-b显示，CD105阳性细胞为99.84％，HLA-DR、CD45、CD34、CD14和CD19阳性细胞的总和为0.47％，扣除FITC的假阳性率0.23％，实际为0.24％；图1-c显示，CD73阳性细胞为99.99％，CD90阳性细胞为97.13％；
图1-d显示的是HLA-DR、CD45、CD34、CD14和CD19阳性细胞的总和为0.48％；图1-e显示的是CD105阳性细胞为99.84％；图1-f显示的是CD90阳性细胞为97.13％；图1-g显示的是CD73阳性细胞为99.99％；
以上结果表明，所制备的胎盘间充质干细胞表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR分子在2％以下，表达CD73、CD90、CD105分子在95％以上，具备间充质干细胞特征；
图2示第8代胎盘间充质干细胞的流式细胞周期的检测结果，图2-a显示94.28％的细胞均集中于45度角斜线上，说明用FSC-A和FSC-H记录方法没有区别；图2-b表示通过FSC-H和SSC-H散点图选出目的细胞进行分析，即E2区的细胞；图2-c显示PI染色效果较好，实验可行；图2-d表示的是细胞周期结果，G 1期细胞所占比例为70.10％，S期细胞所占比例为23.48％，G2期细胞所占比例为6.35％；G0/G1期细胞为60％以上，表明所得细胞具有干细胞特征；
所述细胞周期是通过流式细胞术鉴定的，需观察细胞处于G0/G1期的数目是否在60％以上；处于G0/G1期的细胞数目在60％以上为合格的胎盘间充质干细胞；
图3示胎盘间充质干细胞的细胞分化活性检测结果；其中，图3-A示胎盘间充质干细胞分化为脂肪细胞；图3-B示胎盘间充质干细胞分化为成骨细胞；图3-C示胎盘间充质干细胞分化为软骨细胞；
图4示肺组织切片HE染色结果；其中，图4-A示正常组(无照射+无干细胞注射)肺部HE染色，肺泡充盈，肺泡壁和肺泡腔未见病理性改变；图4-B示照射组(20Gy照射+无干细胞注射)肺部切片HE染色，肺组织内可见明显充血和片状出血；图4-C示实验一组(20Gy照射+照射后注射单纯干细胞)肺部切片HE染色，肺组织内充血和出血较单纯照射组显著减轻；图4-D示实验二组(20Gy照射+照射后注射干细胞制剂)肺部切片HE染色，肺组织与正常组织的组织结构和细胞形态略有差异，但不无明显；图4-E示实验三组(20Gy照射+照射后注射单纯土木香内酯)肺部切片HE染色，肺组织内充血和出血未见减轻；图4-F示实验四组(20Gy照射+照射前注射单纯干细胞)肺部切片HE染色，肺组织与正常组织的组织结构和细胞形态无差别；图4-G示实验五组(20Gy照射+照射前注射干细胞制剂)肺部切片HE染色，肺组织内充血和出血较单纯照射组显著减轻；图4-H示实验四组(20Gy照射+照射前注射单纯土木香内酯)肺部切片HE染色，肺组织与正常组织的组织结构和细胞形态无差别。
具体实施方式
本发明提供了一种干细胞制剂及其制备方法与在制备防治肺损伤的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1胎盘间充质干细胞的制备及鉴定
1.MSC分离、培养
1)保存液配制：保护液由复方电解质注射液组成，其中每100mL含氯化钠526mg、葡萄糖酸钠502mg、醋酸钠368mg、氯化钾37mg、氯化镁30mg。
2)消化液配制：0.5-5.0U/mL透明质酸酶、0.1-2.0mg/mL中性蛋白酶、0.1％-0.5％I型胶原蛋白酶、50％DMEM、50％F12培养基。
3)完全培养基配制：将DMEM培养基与F12培养基进行1:1混合，加入0.1mmol/L非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、10％胎牛血清，5-20ng/L bFGF。
4)MSC分离
a)将胎盘组织依次经70％～75％的医用酒精0.9％生理盐水和含有1000～2000U/mL青霉素，1000～2000μg/mL链霉素的PBS进行清洗；
b)取间质组织剪成5～10mm3大小，0.9％生理盐水冲洗，剪碎组织，剔除血管和结缔组织，剪成1mm3组织块；
c)置于50mL离心管内，300rpm离心5min，弃上清；
d)加入3-5倍体积的红细胞裂解液，浸泡，自然沉淀后，弃上清；
e)加入0.9％生理盐水，300rpm离心5min，弃上清；
f)将配好的消化液加入组织沉淀中，并混匀；
g)消化后，使用完全培养基中和消化酶，然后使用含有葡萄的盐水稀释消化液，使用200目网过滤后，离心，去上清，保留沉淀；
h)使用6mL含有0.1mmol/L非必须氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、10ng/L bFGF及10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬沉淀，接种于25cm2细胞培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养，定期更换培养基；
i)每天对细胞进行观察，每3-5天换液一次；
j)待细胞80％-90％融合后，加入0.125％含EDTA的胰酶消化进行传代培养，动物体内移植采用3-8代细胞。
2.MSC鉴定
1)细胞周期检测：取生长状态良好且细胞密度达到80％-90％的细胞制成细胞悬液。将细胞悬液吹打混匀，吸取10μL悬液，用全自动细胞计数仪进行计数。4℃，400×g离心5min沉淀细胞，小心吸去上清；根据计数结果加入适量预冷的PBS，重悬配制成细胞密度为1×107/mL的悬液，并转移到EP管。吸取50μL细胞，即细胞数量为5×105，加入1mL冰浴预冷75％医用酒精，轻轻吹打混匀，4℃固定12h-24h；4℃，2000×g离心5min沉淀细胞，小心吸去含乙醇上清；加入1mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞；再次4℃，2000×g离心5min，小心吸去上清；可轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。每管细胞样品中加入500μL新制的碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min；4℃或冰浴避光存放；24h内完成流式检测。4℃，2000×g离心5min，小心吸去上清染色液，加入500μL的PBS重悬后转移至一支新的流式管中；轻轻吹打混匀，流式细胞仪上样检测。
通过对第8代胎盘间充质干细胞的细胞周期进行检测，结果如图2所示，G0/G1期细胞为60％以上，表明所得细胞具有干细胞特征。
2)细胞表面标志检测：取生长状态良好且细胞密度达到80％-90％的细胞制成细胞悬液。4℃，400×g离心5min，小心的吸去上清，根据细胞计数的结果，加入适当体积PBS重悬配置悬液，使其细胞密度为0.5-1×107/mL，且总体积大于750μL。轻轻吹打充分混匀后，将细胞悬液以100μL/管的体积分装至已加抗体的EP管，并吹打混匀；将加完抗体的样品管用锡箔纸遮盖好置于避光处，常温孵育20-30min。样品管4℃，400×g离心5min，小心的吸去含抗体的上清液，加500μL的PBS重悬；若当日不能进行流式检测，改加500μL的含量为2％的PFA进行固定，轻轻吹打混匀，流式细胞仪上样检测。
通过对第8代胎盘间充质干细胞的表面标志进行检测，结果如图1所示，CD14、CD34、CD45和HLA-DR分子的表达量<2％，而CD73、CD90、CD105分子的表达量>95％，说明本发明所制备的干细胞为合格的胎盘间充质干细胞。
3)油红O染色鉴定成脂肪分化：取生长状态良好的细胞，消化收集培养；每个实验样本两复孔，一个空白对照孔；待细胞达到100％融合后，进行诱导培养；实验孔更换适量脂肪细胞诱导培养基培养，3-4天后更换为适量脂肪维持液；对照孔每3-4天更换适量脂肪维持培养液；培养三个周期后，进行脂肪维持培养2-7天；培养结束后，适量PBS清洗细胞；适量多聚甲醛固定10min；纯水清洗2次；油红O染色1小时；纯水清洗2次，显微镜下观察拍照。
取第8代胎盘间充质干细胞进行成脂分化诱导，结果如图3-A所示，经诱导后，胎盘间充质干细胞可分化为脂肪细胞。
4)茜素红染色鉴定成骨分化：取生长状态良好的细胞，消化收集培养；每个实验样本两复孔，一个空白对照孔；待细胞达到80％-100％融合；实验孔用适量的hMSC成骨诱导培养基每3-4天换液，对照组用适量间充质干细胞生产培养基换液；保持诱导条件，持续培养2-3周；培养结束后，PBS清洗细胞；95％乙醇固定10分钟；纯水清洗2次；茜素红染色30min；水清洗2次，显微镜下观察拍照。
取第8代胎盘间充质干细胞进行成骨分化诱导，结果如图3-B所示，经诱导后，胎盘间充质干细胞可分化为成骨细胞。
5)甲苯胺蓝染色鉴定成软骨分化：取生长状态良好的细胞，消化收集；将适量的细胞转移到15mL离心管中，用不完全软骨诱导培养基清洗细胞；将细胞悬液在室温下150g离心5min，弃上清液；每7.5×105个细胞用1mL不完全软骨诱导培养基重悬；室温下150g离心5min，弃上清液；用完全软骨诱导培养基重悬hMSC，分装至每管2.5×105个细胞；每个实验样本两次重复，一个空白对照组；拧紧管盖后，再回旋拧松半圈，于37℃、5％二氧化碳条件下培养；每3-4天换一次液，培养14-28天；培养结束后，PBS清洗；适量多聚甲醛固定10分钟；纯水清洗2次；甲苯胺蓝染色5分钟；纯水清洗2次，显微镜下观察拍照。
取第8代胎盘间充质干细胞进行成软骨分化诱导，结果如图3-C所示，经诱导后，胎盘间充质干细胞可分化为软骨细胞。
3.MSC微生物及内毒素检测
根据对干细胞制品的质量要求，为了避免干细胞体外培养中可能引入的导致输液发热的热源，对干细胞制品进行细菌、支原体和内毒素的检查，保证用于输注的干细胞无污染。
1)培养法无菌检测
在生物安全柜内，打开培养瓶盖，用酒精棉球擦拭瓶口，用无菌注射器取16mL待测样本分别等量打入需氧培养瓶和厌氧培养瓶各8mL；每批次培养瓶取需氧培养瓶和厌氧培养瓶各1瓶做为阴性对照进行培养；做好标记后将注有样本的培养瓶及对照培养瓶放入全自动细菌培养系统中培养5天，观察是否染菌。
2)鲎试剂检测内毒素残留
供试品管：鲎试剂加0.1mL细菌内毒素检查水加0.1mL供试品溶液；供试品阳性对照管：鲎试剂加0.1mL细菌内毒素检查用水加0.1mL供试品阳性对照液；阳性对照管：鲎试剂加0.1mL细菌内毒素检查用水加0.1mL 2λ阳性对照液；阴性对照管：鲎试剂加0.1mL细菌内毒素检查用水加0.1mL细菌内毒素检查用水；将4支制备好的鲎试剂用封口膜封口，再做一组平行，共8支鲎试剂，放到超级循环水箱37℃水浴1h，观察凝集情况。
3)一步法检测支原污染检测
取培养两天以上的细胞培养上清2mL，200×g离心5分钟；离心后取上清100μL转移到白色96孔板中，做上标记；在细胞培养上清空中先加入100μL MycoAlert PLUS Reagent，作用5分钟，用分光光度计读数A；再加入100μL MycoAlert PLUS Substrate，作用10分钟，用分光光度计读数B。计算B比A的比率为Ratio；Ratio＜1，支原体检测为阴性；Ratio＞1.2，支原体检测为阳性；由此来判断支原体感染情况。
取第8代的胎盘间充质干细胞进行细菌、内毒素、支原体等项目检测。检测结果全部符合规定，可以用于后续干细胞制剂的制备。
实施例2胎盘间充质干细胞制剂的制备
1.配制干细胞保存液：保存液由复方电解质注射液组成，其中每100mL含氯化钠526mg、葡萄糖酸钠502mg、醋酸钠368mg、氯化钾37mg、氯化镁30mg。
2.将步骤1的保护液过滤，再加入终浓度为5×105个/mL胎盘间充质干细胞，制备细胞悬液；
3.向步骤2的细胞悬液中加入终浓度为0.24mg/mL的土木香内酯，制得干细胞制剂，之后按1mL/支进行分装。
实施例3胎盘间充质干细胞制剂对放射性肺损伤的预防和治疗作用
Balb/c小鼠80只，全部雄性，体重18～22g，适应性饲养1周，随机分成8组，每组10只，按以下分组进行尾静脉注射。
(A)正常组：无照射+无干细胞注射(实施例2制得保护液)；
(B)照射组：20Gy照射+无干细胞注射+干细胞保存液注射(实施例2制得保护液)；
(C)实验一组：20Gy照射+照射后4小时注射单纯干细胞；(以实施例2制备的保护液配制，5×105个/mL胎盘间充质干细胞)
(D)实验二组：20Gy照射+照射后4小时注射干细胞制剂(实施例2制得)；
(E)实验三组：20Gy照射+照射后4小时注射单纯土木香内酯(以实施例2制备的保护液配制，含有0.24mg/mL土木香内酯)
(F)实验四组：20Gy照射+照射前24小时注射单纯干细胞；(以实施例2制备的保护液配制，5×105个/mL胎盘间充质干细胞)
(G)实验五组：20Gy照射+照射前24小时注射干细胞制剂(实施例2制得)；
(H)实验六组：20Gy照射+照射前24小时注射单纯土木香内酯(以实施例2制备的保护液配制，含有0.24mg/mL土木香内酯)。
在进行放射线照射前的24小时(实验第0天)，将培养状态良好的胎盘间充质干细胞消化制备成单细胞悬液，以5×105个/只小鼠的剂量，给实验四组进行尾静脉注射；取干细胞加入土木香内酯制成干细胞制剂，以每只小鼠5×105个干细胞+0.24mg/mL土木香内酯的剂量给实验五组的小鼠进行尾静脉注射；同时给予第六组小鼠尾部静脉注射等量的0.24mg/mL土木香内酯。
在进行放射线照射当天(实验第1天)，将小鼠用透气鼠笼运送至肿瘤医院放射科，将照射组、实验一组、实验二组、实验三组、实验四组、实验五组及实验六组的小鼠放置在固定器内，四肢粘贴固定，将非照射部位以铅板屏蔽，对小鼠全肺部区域进行照射，用电子加速器以20Gy/次的剂量照射1次。
在完成射线照射后，将小鼠运送至实验室，并将提前准备好的胎盘间充质干细胞单细胞悬液以5×105个/只小鼠的剂量给实验一组的小鼠进行尾静脉注射；以每只小鼠5×105个干细胞、0.24mg/mL土木香内酯的剂量给实验二组的小鼠进行尾静脉注射；同时给予第三组小鼠尾部静脉注射等量的0.24mg/mL土木香内酯。
注射后密切关注小鼠行为及体重变化，记录小鼠饮食、睡眠等行为变化，每天定时称量各组小鼠体重，并进行记录和统计。
动物行为及体重变化：以正常组小鼠活动状态为对比；模型组、实验一组、实验二组、实验三组、实验四组、实验五组及实验六组的小鼠在经过照射后，小鼠活动减少，约10min后活动正常，饮食正常，约一周左右，经过照射的小鼠逐渐出现局部脱毛现象，四组小鼠脱毛程度及脱毛鼠数量相似。
每天固定时间对小鼠进行称重，并记录小鼠生存状态，经过照射的小鼠运动较对照组减少，饮食与正常组相近。
仅经过放射线照射，但未做其他处置的模型组小鼠在经过照射后，体重出现增长缓慢，至7天后逐渐恢复正常；注射干细胞、干细胞制剂或土木香内酯，且经过射线照射的小鼠体重增长较正常对照组缓慢，但增长水平高于模型组，说明注射胎盘干细胞制剂与土木香内酯未对小鼠一般状态产生不良影响。实验期间，各组实验动物没有发生死亡或其他病变情况。
实施例4肺损伤相关指标的检测
在实验第18天，将小鼠眼球放血处死，解剖小鼠，取小鼠的左肺进行后续实验操作。
1.肺部病理切片染色
1)固定：取小鼠肺部组织，切取适当大小，放入盛有固定液的容器中固定24-48小时；
2)水洗：流水冲洗24小时；
3)脱水：将组织放入不同浓度酒精(50％、70％、80％、90％、95％、无水)内进行脱水；
4)透明：脱水后转移至二甲苯中放置直至透明；
5)浸蜡：石蜡融化后置于52-60℃烘箱，将组织浸入石蜡内3小时；
6)切片：根据组织块厚度设置切片机厚度，进行切片；
7)展片：水浴锅温度设为40℃，将切好的蜡片从切片机上卷下，放入水浴锅中；
8)粘片：将1滴蛋白甘油涂抹在干净的载玻片上，然后用载玻片从水中将展好的蜡片捞起，平放入烘箱内进行烘干，烘干温度50℃，30分钟；
9)染色：二甲苯脱蜡10min，无水乙醇洗去二甲苯5min；95％、80％乙醇各洗10min，水洗1min，蒸馏水洗1min；苏木素染色4min，水洗2min，1％盐酸酒精分化20s，自来水洗2min；1％稀氨水返蓝30s，水洗2min，蒸馏水洗1min，伊红染色90s；用80％乙醇脱水10s，95％乙醇脱水10s，无水乙醇5min；无水乙醇10min，二甲苯10min，中性树胶封片观察病理切片的状态判断肺部病变情况。
结果如图4所示，正常组(无照射+无干细胞注射)肺部HE染色，肺泡充盈，肺泡壁和肺泡腔未见病理性改变；与正常对照组相比，照射组(20Gy照射+无干细胞注射)肺部切片HE染色，肺泡面积缩小，形态不规则，肺组织内可见明显充血和片状出血等肺损伤症状。
实验一组(20Gy照射+照射后注射单纯干细胞)肺部切片HE染色，肺组织内充血和出血较单纯照射组显著减轻；
实验二组(20Gy照射+照射后注射干细胞制剂)肺部切片HE染色，肺组织与正常组织的组织结构和细胞形态略有差异，但不无明显；
实验三组(20Gy照射+照射前注射单纯土木香内酯)肺部切片HE染色，肺组织内充血和出血较单纯照射组略微减轻，肺部组织形态与照射组相比无明显区别；
实验四组(20Gy照射+照射前注射单纯干细胞)肺部切片HE染色，肺组织内充血和出血较单纯照射组显著减轻；
实验五组(20Gy照射+照射前注射干细胞制剂)肺部切片HE染色，肺组织与正常组织的组织结构和细胞形态无差别；
实验六组(20Gy照射+照射前注射单纯土木香内酯)肺组织内充血和出血较单纯照射组略微减轻，肺部组织形态与照射组相比有细微差别。
以上结果说明，无论是单纯胎盘间充质干细胞尾静脉注射，还是胎盘间充质干细胞制剂尾静脉注射对放射性肺损伤均具有预防作用，也具有治疗作用。单纯注射土木香内酯对放射性肺损伤有一定的防治，但是效果比较差。而且，与单纯胎盘间充质干细胞或单纯土木香内酯尾静脉注射相比较，注射胎盘间充质干细胞和土木香内酯的胎盘间充质干细胞制剂效果更为显著。
2.酶联免疫法(ELISA)检测血清中细胞因子含量
对各组实验动物血液中的细胞因子含量进行检测，并以空白对照组为基准进行比较，分析各组实验动物体内炎症相关细胞因子的变化，从而分析该组动物在放射性肺损伤及干细胞注射后的免疫状态及恢复情况。
1)标准品的稀释：使用原倍标准品一支，用小试管中按照倍比进行稀释。
2)加样：分别设空白孔(空白对照不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔；在酶标包被板上标准品加样50μL；待测样品孔中先加样品稀释液40μL，再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)；加样时将样品加到酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释后备用。
5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6)加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。
7)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
8)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
9)显色：每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
10)终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)；测定应在加终止液15分钟以内进行。
12)计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，或用标准物的浓度与OD值计算出；标准曲线的直线回归方程，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
13)统计：以空白的正常对照组为基准，各组实验数据与其相比，进行数据统计制表，结果如表1：
表1.胎盘干细胞对小鼠血液中炎症因子的影响
Figure BDA0001598958150000151
结果如表1所示，经过放射线照射后，照射模型组动物血液中的炎症相关细胞因子水平有明显增高。同时，与照射模型组相比，经干细胞和/或土木香内酯注射的实验一组、实验二组、实验三组、实验四组、实验五组和实验六组的动物血液中炎症相关细胞因子IL-6、MCP-1及TGF-β1含量均有所降低，尤以实验二组和实验五组降低明显，说明在本发明的胎盘间充质干细胞制剂较单纯的胎盘间充质干细胞有更好的抗炎作用，可更好地降低放射线照射对动物造成的损伤，利于机体的恢复。经统计学分析，实验一组、实验二组、实验三组、实验四组、实验五组、实验六组小鼠血液中各因子的含量均低于照射组，尤其是实验二组和实验五组小鼠血液中各因子的含量与照射组差异更为显著，而且与实验一组、实验三组、实验四组、实验六组小鼠血液中各因子的含量也显示出显著性的差异(p<0.05)；并且，实验二组和实验五组小鼠血液中各因子的含量与正常组相比未见显著性差异，p>0.05，由于正常组给予的保护液仅为等渗溶液，不存在抗辐射或降低炎症因子的作用，因此可以推断本发明提供的干细胞制剂具有防治放射性肺损伤的作用，降低炎症因子的含量至与正常小鼠相当。
以上结果说明，小鼠体内注射胎盘间充质干细胞制剂后无不良影响，而且对放射线导致的肺损伤具有一定的预防和治疗作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种干细胞制剂，其特征在于，
由水、氯化钠5.26 mg/mL、葡萄糖酸钠5.02 mg/mL、醋酸钠3.68 mg/mL、氯化钾0.37mg/mL、氯化镁0.3 mg/mL、胎盘间充质干细胞5×105个/mL和土木香内酯0.24 mg/mL组成。
2.权利要求1所述的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括：将电解质溶解于水制备保存液；将间充质干细胞以所述保存液重悬后，加入土木香内酯，制得干细胞制剂。
3.权利要求1所述的干细胞制剂在制备降低放射性肺损伤导致的炎症因子水平升高的药物中的应用。
4.权利要求1所述的干细胞制剂在制备防治放射性肺损伤的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肺损伤为放射性肺损伤；所述放射性肺损伤为电离辐射所致的放射性肺损伤；所述电离辐射为X射线辐射、重离子辐射或γ射线辐射。
6.一种防治放射性肺损伤的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的干细胞制剂。
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