CN111407766A - 雷公藤内酯酮在制备治疗急性单核细胞白血病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了雷公藤内酯酮在制备治疗急性单核细胞白血病药物中的应用，属于白血病药物技术领域。雷公藤内酯酮在制备治疗急性单核细胞白血病药物中的应用。本发明以急性单核细胞白血病细胞U937为研究对象，雷公藤内酯酮溶液处理U937细胞，利用MTT法检测U937细胞的细胞活性，结果表明雷公藤内酯酮对U937白血病细胞的增殖抑制作用。采用Annexin Ⅴ/PI双染法检测雷公藤内酯酮对U937细胞凋亡的影响，结果表明雷公藤内酯酮能诱导U937细胞发生凋亡，且随着浓度的增加，凋亡越明显。因此，雷公藤内酯酮通过抑制急性白血病细胞的增殖和诱导细胞凋亡，从而实现治疗急性单核细胞白血病。
Description
技术领域
本发明属于白血病药物技术领域，具体涉及雷公藤内酯酮在制备治疗急性单核细胞白血病药物中的应用。
背景技术
白血病又称血癌，是一种造血细胞的恶性增生性疾病，白血病细胞由于增殖失控、分化受阻、凋亡障碍等特性使之在骨髓、淋巴结等造血系统中大量增殖积累，并浸润体内其他组织和器官，致使正常的造血功能受到抑制，产生贫血、肝脾肿大等症状。
根据白血病的发病特点，分为急性骨髓性白血病(Acute Myelocytic Leukemia,AML)、慢性骨髓性白血病(Chronic Myelocytic Leukemia,CML)、急性淋巴性白血病(AcuteLymphocytic Leukemia,ALL)和慢性淋巴性白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia,CLL)。
急性骨髓性白血病(AML)为一类来源于髓系(粒系，单核系，巨核系)干、祖细胞的恶性克隆性疾病。其致病特征是骨髓内的异常芽细胞快速且无限的增殖，进而导致其他的造血细胞无法产生。是成年人群中最常见的急性白血病，其发病率伴随着人群年龄的增长而增加。FAB根据骨髓内白血病的细胞形态，将AML分为M0～M7八型：M0，急性粒细胞白血病微分化型；M1，急性粒细胞白血病未分化性；M2，急性粒细胞白血病部分分化型；M3，急性早幼粒细胞白血病；M4，急性粒-单核细胞白血病；M5，急性单核细胞白血病；M6，红白血病；M7，急性巨核细胞白血病。
急性单核细胞白血病(M5型白血病)，成人占AML百分比为10％，临床上易合并高白细胞、髓外浸润及出凝血异常。急性单核细胞白血病复发率高，临床预后差。目前，针对急性单核细胞白血病，临床上主要采用阿糖胞苷联合柔红霉素的药物化疗方案或造血干细胞移植，常规治疗缓解率低且易发生耐药而复发，导致患者总体生存率仍然较低。
雷公藤是卫矛科雷公藤属木质藤本植物，雷公藤内酯酮(TN)作为雷公藤的活性单体之一，与雷公藤另一提取物雷公藤内酯醇(TL)在分子结构上相类似，但雷公藤内酯酮的安全系数较高。对正常人外周血白细胞、非癌的小鼠星形胶质细胞、正常肝脏细胞以及鼻咽上皮细胞无明显抑制作用，且小鼠体内使用20倍有效剂量的雷公藤内酯酮，未见毒性反应。现有研究已表明，雷公藤内酯酮可在纳摩尔级别上抑制肿瘤细胞生长。雷公藤内酯类药物不引起肝毒性或肾毒性，高剂量不影响小鼠体内白细胞、红细胞和血小板数目，表明其具有良好的安全性。
在为数不多的关于雷公藤内酯酮与肿瘤的研究中，1/3(6/18)的研究显示，雷公藤内酯酮的抗肿瘤作用与凋亡相关。但关于雷公藤内酯酮抑制白血病细胞凋亡的研究尚未有报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供雷公藤内酯酮在制备治疗急性单核细胞白血病药物中的应用，能够有效抑制白血病细胞的增殖和诱导其凋亡。
本发明提供了如式I所示的雷公藤内酯酮在制备治疗急性单核细胞白血病药物中的应用；
本发明提供了式I所示的雷公藤内酯酮在制备抑制急性单核细胞白血病细胞增殖的药物中的应用。
本发明提供了式I所示的雷公藤内酯酮在制备诱导急性单核细胞白血病细胞凋亡的药物中的应用。
优选的，所述雷公藤内酯酮的浓度不低于2.5nmol/L。
优选的，所述药物的剂型包括片剂、颗粒剂、注射剂或口服液。
本发明提供的如式I所示的雷公藤内酯酮在制备治疗急性单核细胞白血病药物中的应用。本发明以急性单核细胞白血病细胞U937为研究对象，雷公藤内酯酮溶液处理U937细胞，利用MTT法检测U937细胞的细胞活性，结果表明雷公藤内酯酮对U937白血病细胞的增殖抑制作用。采用AnnexinⅤ/PI双染法检测雷公藤内酯酮对U937细胞凋亡的影响，结果表明，雷公藤内酯酮能诱导U937细胞发生凋亡，且随着浓度的增加，凋亡越明显。雷公藤内酯酮通过抑制急性白血病细胞的增殖和诱导细胞凋亡，从而实现治疗急性单核细胞白血病。
进一步的，本发明提供的应用，限定了雷公藤内酯酮的浓度，U937细胞对雷公藤内酯酮极为敏感，不低于2.5nmol/L的雷公藤内酯酮即可实现对U937细胞的增殖抑制和诱导凋亡。
附图说明
图1为不同浓度的雷公藤内酯酮对U937细胞处理48h和72h时增殖抑制情况；
图2为不同浓度的雷公藤内酯酮对U937细胞处理72h时的流式细胞检测结果；
图3为不同浓度的雷公藤内酯酮诱导U937细胞72时的凋亡情况。
具体实施方式
本发明提供了如式I所示的雷公藤内酯酮在制备治疗急性单核细胞白血病药物中的应用；
在本发明中，雷公藤内酯酮为一小分子化合物，英文名Triptonide，分子式:C20H22O6，分子量358.39，为二萜类环氧化物。本发明对雷公藤内酯酮的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的雷公藤内酯酮即可。本发明对所述药物的剂型没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物剂型即可。在所述药物中，所述雷公藤内酯酮的浓度优选不低于2.5nmol/L，更优选为5～40nmol/L。
本发明提供了式I所示的雷公藤内酯酮在制备抑制急性单核细胞白血病细胞增殖的药物或诱导急性单核细胞白血病细胞凋亡的药物中的应用。本发明对所述药物的剂型没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物剂型即可，优选包括片剂、颗粒剂、注射剂或口服液等常规剂型。所述雷公藤内酯酮的浓度优选不低于2.5nmol/L，更优选为5～40nmol/L。
下面结合实施例对本发明提供的雷公藤内酯酮在制备治疗急性单核细胞白血病药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实验材料说明：
雷公藤内酯酮溶液的配制：将雷公藤内酯酮粉末用DMSO配制为100mmol/L的样品溶液，分装保存于-80℃，用时稀释。
5％MTT溶液的配制：取250mg MTT粉末，加无菌PBS至50ml，超声溶解，制得5mg/ml的MTT溶液，过0.22μm微孔滤膜，保存于4℃。
含0.1％HCl的10％SDS溶液的配制：取50g SDS粉末，加无菌PBS至500ml，超声溶解，加50μl盐酸溶液制得含0.1％HCl的10％SDS溶液，常温保存。
试剂：RPMI1640培养基购于HyClone公司，胎牛血清(FBS)购于北京缔一生物科技有限公司，四甲基偶氮哩盐(MTT)、二甲基亚飒(DMSO)购于北京索莱宝科技有限公司，凋亡试剂盒ANXN VFITC购于BD公司。
细胞系：人组织细胞淋巴瘤细胞，购自中国科学院细胞库。用含5％FBS的RPMI1640培养于37℃，5％CO2培养箱中培养使用。
实施例1
雷公藤内酯酮抗急性单核细胞白血病细胞U937的细胞活性检测
实验方法：
MTT法测定不同浓度的雷公藤内酯酮对U937白血病细胞的增殖抑制作用。
将U937细胞培养至对数生长期，在细胞状态良好的情况下进行实验，按照5000个细胞/孔接种于96孔板中，含5％FBS的RPMI1640培养基稀释已配制好的100mmol/L的雷公藤内酯酮稀释至640nmol/L，2ml，于96孔板中倍比稀释为320nmol/L，160nmol/L、80nmol/L、40nmol/L、20nmol/L、10nmol/L、5nmol/L、2.5nmol/L，每个浓度设6个复孔，另设5％FBS的RPMI1640培养基阴性对照，四周用无菌PBS填充，5％CO2、37℃的条件孵育48、72h后，各孔加20μl 5％MTT溶液，继续培养4小时，每孔加含0.1％HCl的10％SDS 100μl过夜，在酶标仪570nm处测量各孔吸光度值。
MTT法检测不同浓度雷公藤内酯酮对U937细胞的抑制情况如表1所示。不同浓度的雷公藤内酯酮对U937细胞处理48h和72h时增殖抑制情况见图1。
表1 MTT法检测雷公藤内酯酮对U937细胞的影响
计算抑制率如表1所示，处理48h、72h时，IC50分别为17.320nM、6.369nM。如图1所示，雷公藤内酯酮对U937细胞的增殖具有明显的抑制作用，且具有量浓度依赖性。
实施例2
雷公藤内酯酮影响急性单核细胞白血病细胞U937细胞凋亡的检测实验方法：
将U937细胞培养至对数生长期，在细胞状态良好的情况下进行实验，按照10000个细胞/孔接种于6孔板中，含5％FBS的RPMI1640培养基稀释已配制好的100mM的雷公藤内酯酮稀释至40nmol/L、20nmol/L、10nmol/L、5nmol/L、2.5nmol/L，每个浓度设3个复孔，用5％FBS的RPMI1640培养基做对照(control组)，于5％CO2、37℃的条件孵育72h后，收集细胞，200g离心弃上清，无菌PBS洗2次，添加FITCAnnexin 5μl孵育处理细胞10min，然后添加PI 5μl，置于常温环境下避光处理5min。加入100μl 1×BindingBuffer充分混匀，1h内经流式细胞仪检测。
不同浓度的雷公藤内酯酮对U937细胞处理72h时的流式细胞检测结果见图2。AnnexinⅤ/PI双染法检测雷公藤内酯酮对U937细胞凋亡的影响见表2，根据表2数据绘制不同浓度的雷公藤内酯酮诱导U937细胞72时的凋亡情况的柱状图，见图3。
表2 AnnexinⅤ/PI双染法检测雷公藤内酯酮对U937细胞凋亡的影响
结果显示，雷公藤内酯酮能诱导急性单核细胞白血病细胞株U937细胞发生凋亡，且随着浓度的增加，凋亡越明显。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.如式I所示的雷公藤内酯酮在制备治疗急性单核细胞白血病药物中的应用；
2.式I所示的雷公藤内酯酮在制备抑制急性单核细胞白血病细胞增殖的药物中的应用。
3.式I所示的雷公藤内酯酮在制备诱导急性单核细胞白血病细胞凋亡的药物中的应用。
4.根据权利要求1～3任意一项所述应用，其特征在于，所述雷公藤内酯酮的浓度不低于2.5nmol/L。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、颗粒剂、注射剂或口服液。
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