CN101759763A - 雷公藤内酯醇衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种雷公藤内酯醇衍生物及其制备方法和应用，该雷公藤内酯醇衍生物具有式(I)所示通式，其中，R取自氯、胺、脂肪胺或芳香胺。本发明以植物中的天然产物雷公藤类酯醇为先导化合物，对其进行结构改造，从而得到一类具有不同程度的抗慢性粒细胞白血病活性的化合物，显示出很强的抑制白血病细胞及耐受白血病细胞活性，特别是对STI571耐受的慢性粒细胞白血病细胞具有很强的抑制活性，为雷公藤内酯醇衍生物发展成为一类新型治疗慢性粒细胞白血病药物奠定了基础，且可用于制备治疗慢性粒细胞白血病药物，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及有机化合物技术领域，尤其涉及一种雷公藤内酯醇衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一种骨髓细胞增殖紊乱性疾病。Bcr-Abl是引起慢性粒细胞性白血病(CML)的一种融合蛋白，属于非受体酪氨酸激酶。针对蛋白酪氨酸激酶的特异性小分子抑制物靶向治疗在临床疗效上的巨大成功进一步证实了蛋白酪氨酸激酶在肿瘤发生中的重要性。世界上第一个获批准的靶向治疗药物是Gleevec(STI-571，中文名“格列卫”)，这是一种强效靶向抑制剂。然而，随着STI571在临床上的广泛应用，耐药问题日益突出。
早在20世纪50年代，国内就有中医将雷公藤用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、红斑狼疮和银屑病。目前研究指出雷公藤内酯醇对多种白血病细胞有抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡作用。雷公藤内酯醇可以显著下调Bcr-Abl表达，雷公藤内酯醇在nanomolar浓度水平显著抑制携有STI571抵抗性T3511Bcr-Abl细胞KBM5-T315I和D816Vc-KIT的细胞株HMC-1.2和P815的增殖(这些细胞是STI571耐受细胞)，诱导凋亡及G1期停滞。
但是，雷公藤内酯醇作为抗癌药物有其不足之处：其毒性较大，而且水溶性差。小鼠的LD50为1.93mg/kg，而其用于延长小鼠异种器官移植和防止移植物抗宿主反应的剂量为0.1～0.5mg/Kg，治疗指数较低。
因此，鉴于雷公藤内酯醇强的活性和毒性，国内外的研究者致力于雷公藤内酯醇的结构修饰的研究，希望能合成高效低毒的靶向治疗慢性粒细胞白血病药物。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种通过对天然产物雷公藤内酯醇进行结构修饰，从而得到能抑制白血病细胞及耐受白血病细胞活性，且低毒的雷公藤内酯醇衍生物。
本发明的另一个目的在于提供上述雷公藤内酯醇衍生物的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供上述雷公藤内酯醇衍生物在制备抗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
一种雷公藤内酯醇衍生物，该衍生物为氨基取代的乙酸雷公藤内酯醇酯类化合物，其具有式(I)所示通式。
其中，R取自氯(Cl)、胺、各种脂肪胺或芳香胺等，如R可以为Cl、四氢吡咯、哌啶、吗啡啉、N-甲基六氢吡啶、丁胺、胺、胺基乙醇、对氯苯胺、2-胺基丙酸甲酯、乙二胺、六氢吡啶、4-(3-氨基-吡啶)嘧啶-2-胺、二乙醇胺、十一烷基胺、二乙基胺或甲基胺。
上述雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，是以天然产物雷公藤内酯醇为先导化合物，对其进行结构改造，先得到重要的中间产物——氯乙酸雷公藤甲酯，继而得到氨基取代的乙酸雷公藤内酯醇酯类化合物。
上述雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)以天然产物雷公藤内酯醇，氯乙酰氯为原料，在催化剂4-二甲基氨基吡啶(DMAP)的作用下发生亲电取代反应，制备得到氯乙酸雷公藤甲酯，其化学反应式如下所示：
(2)以步骤(1)制备所得氯乙酸雷公藤内酯醇酯与胺类化合物为原料，在碳酸钾(碳酸钾起催化作用)和非质子性溶剂下发生亲核反应，合成氨基取代的乙酸雷公藤内酯醇酯，其化学反应式如下所示。
上述步骤(1)中，将天然产物雷公藤内酯醇和催化剂4-二甲基氨基吡啶(DMAP)溶解在极性非质子性溶剂中，-5℃以下振荡反应0.5小时以后，缓慢滴加用相同极性非质子性溶剂溶解的氯乙酰氯，室温下搅拌进行反应，反应结束后，将反应产物依次用盐酸和水洗后，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏，浓缩产物经硅胶柱层析纯化，收集洗脱液为V乙酸乙酯∶V石 油醚＝10∶90所得洗脱产物，减压浓缩后得到所需中间产物——氯乙酸雷公藤甲酯。
上述步骤(1)中，所述极性非质子性溶剂可采用本领域技术人员常用的任何一种极性非质子性溶剂，如乙醇、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺等等。
上述步骤(1)中，雷公藤内酯醇与氯乙酰氯的反应摩尔比例是(1∶2)～(1∶5)。
上述步骤(2)中，将步骤(1)制备所得氯乙酸雷公藤内酯醇酯溶解于极性非质子性溶剂中，0℃加入胺类化合物和催化剂碳酸钾，然后室温下发生反应，反应结束后，将反应产物减压浓缩，经硅胶柱层析纯化，收集洗脱液为V甲醇∶V氯仿＝100∶1所得洗脱产物，将洗脱产物减压浓缩后，即可得到所需氨基取代的乙酸雷公藤内酯醇酯。
上述步骤(2)中，所述胺类化合物为胺、各种脂肪胺或芳香胺等。
上述步骤(2)中，氯乙酸雷公藤内酯醇酯、胺类化合物和碳酸钾的反应摩尔比为(1∶1.2∶1.2)～(1∶3∶2)。
上述步骤(2)中，反应温度为20～60℃，反应时间为6～24小时。
上述步骤(2)中，所述极性非质子性溶剂可采用本领域技术人员常用的任何一种极性非质子性溶剂，如乙腈、乙醇、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺等等。
本发明的雷公藤内酯醇衍生物经细胞筛选试验，westernblot试验以及裸鼠试验等，结果发现本发明的雷公藤内酯醇衍生物，即具有式(I)所示通式结构的氨基取代的乙酸雷公藤内酯醇酯类化合物，都具有不同程度的抗慢性粒细胞白血病活性，可体外抑制野生型(KBM5)和STI571抵抗性T315I突变型(KBM5-T315I)白血病细胞系增值，降低癌基因Bcr-Abl的表达，并诱导肿瘤细胞凋亡。
与现有技术相比，本发明的特点是以植物中的天然产物雷公藤类酯醇为先导化合物，对其进行结构改造，从而得到一类具有不同程度的抗慢性粒细胞白血病活性的化合物，显示出很强的抑制白血病细胞及耐受白血病细胞活性，特别是对STI571耐受的慢性粒细胞白血病细胞具有很强的抑制活性，为雷公藤内酯醇衍生物发展成为一类新型治疗慢性粒细胞白血病药物奠定了基础，且可用于制备治疗慢性粒细胞白血病药物，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为实施例18中KBM5和药物浓度关系曲线图；
其中，横轴是药物终浓度，纵轴是细胞活力百分比；
图2为实施例18中KBM5-T315I和药物浓度关系曲线图；
其中，横轴是药物终浓度，纵轴是细胞活力百分比；
图3为实施例19中蛋白免疫印迹检测Bcr-Abl水平电泳图；
图4为实施例19中蛋白免疫印迹检测PARP水平电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1：氯乙酸雷公藤甲酯的制备
称取雷公藤内酯醇(50mg，0.139mmol)溶于5ml氯仿中，-5℃下加入4-二甲基氨基吡啶(85mg，0.696mol)振荡反应0.5小时以后，缓慢滴加用氯仿溶解的氯乙酰氯(0.039ml，0.490mmol)，缓慢恢复室温搅拌反应24h，将反应产物用依次用5％的稀盐酸(体积百分比)和水分别洗2～3次，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏，硅胶柱层析，收集洗脱液为V乙酸乙酯∶V石油醚＝10∶90所得洗脱产物，减压浓缩得到45mg无色透明固体，该无色透明固体即为氯乙酸雷公藤内酯醇酯，产率74.2％，熔点：122～124℃。
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ5.30(s，1H)，5.10(s，1H)，4.67(s，2H)，4.19(d，J＝6.6Hz，2H)，3.84(d，J＝3Hz，1H)，3.56(d，J＝3Hz，1H)，3.49(d，J＝5.7Hz，1H)，2.69(m，1H)，2.18(m，2H)，1.91(m，2H)，1.57(m，1H)，1.22(m，1H)，1.06(s，3H)，0.97(d，J＝6.9Hz，3H)，0.86(d，J＝6.6Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75M Hz)δ173.0，166.9，159.7，125.5，72.89，69.9，63.5，63.0，61.4，59.5，55.4，55.0，40.9，40.335.7，29.9，28.1，23.4，17.5，17.1，16.7，13.8.HREIMS m/z 436.1282(calcd for C22H25O7Cl1，436.1283).
实施例2四氢吡咯代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
称取10mg(0.029mmol)实施例1制备所得氯乙酸雷公藤内酯醇酯溶于1ml N，N-二甲基甲酰胺，0℃下加入3.0mg(0.0348mmol)四氢吡咯，称取4.8mg(0.0348mmol)无水K2CO3加入到上述溶液中，室温25℃反应24h，减压浓缩，硅胶柱层析，收集洗脱液为V甲醇∶V氯仿＝100∶1所得洗脱产物，将洗脱产物减压浓缩后得到无色固体7.4mg，即为本实施例的四氢吡咯代乙酸雷公藤内酯醇酯，其产率为74％。mp 152-154℃。
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ5.13(s，1H)，4.68(s，2H)，4.19(d，J＝7.2Hz，2H)，3.89(d，J＝3.3Hz，1H)，3.55(d，J＝3.3Hz，1H)，3.48(d，J＝5.4Hz，1H)，2.75(m，1H)，2.35(m，2H)，2.35(m，2H)，2,20(m，2H)，1.93(m，2H)，1.90(m，2H)，1.90(m，2H)，1.85(m，1H)，1.58(m，1H)，1.26(s，1H)，1.06(s，3H)，0.97(d，J＝6.9Hz，3H)，0.86(d，J＝6.9Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75M Hz)δ173.0，162.2，159.9，125.4，71.0，70.0，63.5，63.3，61.2，59.6，55.4，55.0，53.6，53.6，40.4，40.3，35.7，29.9，28.0，23.5，23.5，23.4，17.6，17.1，16.7，13.8.HREIMS m/z471.2253(calcd for C26H33O7N1，471.2252).
实施例3哌啶代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率83％，无色固体。mp 122-124℃。
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ5.12(s，1H)，4.67(s，2H)，3.83(d，J＝3.0Hz，1H)，3.53(d，J＝2.7Hz，1H)，3.47(d，J＝5.7Hz，1H)，3.33(d，J＝6.3Hz，2H)，2.65(m，1H)，2.57(m，2H)，2.57(m，2H)，2.17(m，2H)，1.95(s，1H)，1.90(m，2H)，1.85(s，1H)，1.64(m，2H)，1.64(m，2H)，1.45(m，2H)，1.26(s，1H)，1.00(s，3H)，1.06(s，3H)，0.97(d，J＝6.9Hz，3H)，0.85(d，J＝6.9Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75M Hz)δ172.9，162.6，159.8，125.5，70.9，69.9，63.6，63.3，61.2，59.6，55.4，55.1，53.9，53.9，40.4，40.3，35.7，29.9，28.2，25.9，25.9，23.9，23.4，17.6，17.1，16.7，13.8.HREIMS m/z 485.2409(calcd for C27H35O7N1，485.2408).
实施例4吗啡啉代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率75％，无色固体。mp 98-99℃.
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ5.13(s，1H)，4.67(s，2H)，3.83(d，J＝3.0Hz，1H)，3.76(t，J＝4.5Hz，2H)，3.76(t，J＝4.5Hz，2H)，3.54(d，J＝3.0Hz，1H)，3.48(dd，J＝5.7Hz，1H)，3.35(q，J＝16.5Hz，28.2Hz，2H)，2.68(m，1H)，2.64(m，2H)，2.64(m，2H)，2.17(m，2H)，1.90(m，2H)，1.56(m，1H)，1.45(m，2H)，1.26(s，1H)，1.21(m，1H)，1.01(s，3H)，0.98(d，J＝6.9Hz，3H)，0.86(d，J＝6.9Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75M Hz)δ173.0，169.5，159.7，125.5，71.2，69.9，66.9，66.9，63.6，63.2，61.3，59.7，59.6，55.5，55.1，53.1，53.1，40.4，35.8，29.9，28.3，23.6，17.6，17.2，16.8，13.8.HREIMS m/z 487.2200(calcd for C26H33O8N1，487.2201).
实施例5N-甲基六氢吡啶代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率：75％，无色油状。
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ5.11(s，1H)，4.67(s，2H)，4.21(m，1H)，3.83(d，J＝3.3Hz，1H)，3.54(d，J＝3.0Hz，1H)，3.47(d，J＝5.4Hz，1H)，3.35(d，J＝16.8Hz，29.4Hz，2H)，2.70(m，2H)，2.37(s，1H)，2.37(m，2H)，2.17(m，2H)，2.15(m，2H)，1.90(m，2H)，1.56(m，1H)，1.45(m，2H)，1.27(m，1H)，1.26(s，3H)，1.05(s，3H)，0.96(d，J＝6.9Hz，3H)，0.84(d，J＝6.9Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75M Hz)δ173.2，168.9，159.7，125.5，71.2，69.9，63.5，63.2，61.3，59.6，55.4，55.0，54.6，54.6，52.3，52.3，45.6，40.4，40.3，35.7，29.9，29.7，23.5，17.3，17.1，16.8，13.8.HREIMS m/z 500.2515(calcd for C27H36O7N2，500.2517).
实施例6丁胺取代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率：95％无色固体.mp 114-116℃。
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ5.30(s，1H)，5.10(s，1H)，4.67(s，2H)，4.25(q，J＝15Hz，22.2Hz，2H)，3.84(d，J＝3.3Hz，1H)，3.72(d，J＝3.3Hz，1H)，3.56(d，J＝3Hz，1H)，3.49(q，J＝6.0Hz，12.0Hz，1H)，2.87(m，2H)，2.69(m，1H)，2.35(m，1H)，2.30(m，1H)，2.17(m，2H)，1.91(m，2H)，1.59(d，J＝4.8Hz，1H)，1.59(d，J＝4.5Hz，1H)，1.57(m，1H)，1.26(m，2H)，1.26(s，2H)，1.06(s，3H)，0.97(d，J＝6.9Hz，3H)，0.86(d，J＝6.6Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75M Hz)δ173.1，166.9，159.7，125.5，72.87，69.9，63.5，63.2，63.2，61.4，61.2，59.6，59.5，55.4，55.0，40.9，40.3，35.7，29.9，29.7，28.0，23.4，17.5，17.1，16.7，13.8.HREIMS m/z473.2399(calcd for C26H35O7N1，473.2408).
实施例7胺取代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率90％，无色固体.mp 223-225℃。
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ4.68(s，2H)，3.91(d，J＝3.3Hz，2H)，3.52(d，J＝2.4Hz，1H)，3.42(d，J＝10.5Hz，1H)，3.38(d，J＝5.4Hz，1H)，2.74(d，J＝10.8Hz，1H)，2.32(m，1H)，2.23(m，1H)，2.16(t，J＝5.7Hz，1H)，1.99(d，J＝13.2Hz，1H)，1.61(s，2H)，1.56(m，2H)，1.23(m，2H)，1.13(s，3H)，1.02(d，J＝6.9Hz，3H)，0.90(d，J＝6.9Hz，3H).13C NMR(CDCl3)δ173.0，173.0，160.0，125.4，73.4，69.9，66.2，65.7，60.8，60.1，56.8，54.6，40.5，40.5，35.8，29.9，28.3，23.8，17.8，17.2，16.9，13.8，HREIMS m/z 417.1809(calcd for C22H27O7N1，417.1782).
实施例8乙醇胺取代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率85％，无色固体.mp 131-133℃.1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ4.68(s，2H)，3.90(s，1H)，3.86(m，2H)，3.52(m，2H)，3.56(d，J＝3Hz，1H)，3.42(m，1H)，3.38(d，J＝5.4Hz，1H)，2.70(m，2H)，2.36(m，1H)，2.30(m，1H)，2.23(m，1H)，2.16(m，2H)，1.97(s，1H)，1.90(m，1H)，1.57(dd，J＝5.1，12.3Hz，1H)，1.26(s，1H)，1.20(m，1H)，1.13(s，3H)，1.02(d，J＝6.9Hz，3H)，0.89(d，J＝6.9Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75M Hz)δ173.7，170.2，159.7，125.5，73.5，69.9，66.2，65.7，60.7，60.1，59.7，56.7，55.6，54.5，40.5，40.2，35.8，29.9，28.3，23.7，17.8，17.1，16.9，13.7.MS(TOF)：462.1913(calcd for C24H31O8N1)
实施例9对氯苯胺取代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率55％，黄色固体solid.mp 95-97℃.
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ7.13(d，J＝9Hz，1H)，7.13(d，J＝9Hz，1H)，6.56(d，J＝9Hz，1H)，6.56(d，J＝9Hz，1H)，5.11(s，1H)，4.70(s，2H)，4.19(q，J＝15.0，21.6Hz，2H)，3.84(d，J＝3Hz，1H)，3.56(d，J＝3Hz，1H)，3.49(d，J＝5.7Hz，1H)，2.69(m，1H)，2.35(m，1H)，2.16(m，2H)，1.92(m，2H)，1.57(m，1H)，1.26(m，2H)，1.07(s，3H)，0.98(d，J＝6.9Hz，3H)，0.86(d，J＝6.9Hz，3H).13CNMR(CDCl3，75M Hz)δ172.9，166.9，159.6，145.4，129.0，129.0，125.6，114.2，109.7，109.7，73.0，69.9，63.5，63.1，61.4，59.5，55.4，55.3，40.8，40.4，35.7，29.9，28.1，23.5，17.5，17.2，16.8，13.9.HREIMS m/z 527.1716(calcd for C28H30O7N1Cl1，527.1705).
实施例102-氨基丙酸取代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率75％，无色固体.mp 110-112℃.
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ5.30(s，1H)，5.11(s，1H)，4.68(s，2H)，4.19(q，J＝15.0，21.9Hz，2H)，3.85(d，J＝3Hz，1H)，3.74(s，1H)，3.57(d，J＝3Hz，1H)，3.50(d，J＝5.7Hz，1H)，3.47(s，3H)，2.69(m，1H)，2.17(m，2H)，1.92(m，2H)，1.92(s，1H)，1.8(s，1H)，1.57(dd，J＝4.2，13.2Hz，1H)，1.26(s，3H)，1.06(s，3H)，0.98(d，J＝6.9Hz，3H)，0.86(d，J＝6.6Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75M Hz)δ175.4，173.9，169.7，157.5，125.6，72.9，69.9，63.5，63.0，61.4，60.0，59.5，55.4，55.0，40.9，40.3，38.8，35.7，29.9，29.6，28.1，23.4，17.5，17.1，16.7，13.8.HREIMS m/z503.2151(calcd for C26H33O9N1，503.2150).
实施例11乙二胺取代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率80％，无色固体；mp 130-132℃.
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ5.13(s，2H)，4.68(s，2H)，3.84(d，J＝3.3Hz，1H)，3.75(s，1H)，3.55(d，J＝3.0Hz，1H)，3.50(s，1H)，3.49(s，1H)，3.46(d，J＝7.2Hz，2H)，3.41(d，J＝5.4Hz，2H)，2.93(m，1H)，2.93(m，1H)，2.70(m，2H)，2.16(m，2H)，1.91(m，2H)，1.61(s，1H)，1.27(m，1H)，1.05(s，3H)，0.99(d，J＝6.9Hz，3H)，0.86(d，J＝6.9Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75MHz)δ173.3，169.4，159.7，125.9，71.6，69.9，63.6，63.1，61.5，59.7，55.6，55.0，48.3，41.6，40.3，37.2，35.7，29.9，28.3，23.5，17.6，17.2，16.8，13.8.HREIMS m/z 460.2217(calcd forC24H32O7N2，460.2204).
实施例12六氢吡啶取代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率75％，无色固体.mp 230-232℃.
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ5.10(s，1H)，4.67(s，2H)，3.84(d，J＝3.3Hz，1H)，3.55(d，J＝2.7Hz，1H)，3.50(d，J＝4.8Hz，2H)，3.43(s，1H)，3.38(s，1H)，3.29(m，2H)，3.29(m，2H)，2.96(m，2H)，2.96(m，2H)，2.70(m，1H)，2.15(m，2H)，1.91(m，2H)，1.58(dd，J＝4.8，12.6Hz，1H)，1.27(s，1H)，1.22(m，1H)，1.03(s，3H)，0.97(d，J＝6.9Hz，3H)，0.86(d，J＝6.9Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75M Hz)δ172.9，168.9，159.6，125.6，71.7，69.9，63.5，63.1，61.5，59.8，58.7，55.6，55.1，49.4，49.4，43.6，43.6，40.4，35.7，30.0，28.4，23.5，17.6，17.2，16.8，13.9.HREIMS m/z 486.2364(calcd for C26H34O7N2，486.2361).
实施例134-(3-氨基-吡啶)嘧啶-2-胺取代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率70％，无色固体。mp 167-169℃.
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ9.23(s，1H)，8.73(d，J＝3.3Hz，1H)，8.43(d，J＝5.1Hz，1H)，8.30(d，J＝7.8Hz，1H)，7.40(m，1H)，7.06(d，J＝4.2Hz，1H)，5.18(s，1H)，4.68(s，2H)，3.90(d，J＝3Hz，1H)，3.52(d，J＝2.1Hz，1H)，3.42(m，2H)，3.38(d，J＝5.1Hz，1H)，2.69(m，1H)，2.28(m，1H)，2.18(m，2H)，1.91(m，2H)，1.70(s，1H)，1.57(m，1H)，1.22(m，1H)，1.13(s，3H)，1.02(d，J＝6.9Hz，3H)，0.90(d，J＝6.6Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75MHz)δ173.0，166.7，163.2，162.8，159.1，151.2，149.4，148.2 134.3，132.7，125.5，123.5，107.6，73.5，69.9，66.2，60.8，60.1，56.8，54.6，55.0，40.5，40.1，35.8，29.9，28.3，23.8，17.8，17.2，17.0，13.7.MS(TOF)：m/z 573.2217(calcd for C31H32O7N4，).
实施例14二乙醇胺取代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率70％，无色油状物。
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ4.69(s，2H)，4.55(s，1H)，4.19(d，J＝3.9Hz，2H)，3.90(s，1H)，3.90(s，1H)，3.83(m，2H)，3.83(m，2H)，3.56(m，1H)，3.50(s，2H)，3.49(m，1H)，2.27(m，2H)，2.27(m，2H)，2.69(m，1H)，2.18(m，2H)，1.91(m，2H)，1.57(m，1H)，1.22(m，1H)，1.06(s，3H)，0.88(d，J＝6.9Hz，3H)，0.81(d，J＝6.6Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75MHz)δ173.3，166.7，160.2，125.5，73.44，68.0，63.8，63.0，62.2，62.2，61.1，60.6，60.6，59.2，55.7，55.6，47.8，40.3，35.3，29.9，28.1，23.7，17.7，17.1，16.5，13.7.MS(TOF)：m/z 506.1972(calcd forC26H35O9N1).
实施例15十一烷基胺取代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率80％，无色油状物。
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ5.12(s，1H)，4.67(s，2H)，4.31(t，J＝6.6Hz，1H)，4.09(d，J＝6.6Hz，1H)，3.83(d，J＝3Hz，1H)，3.57(s，1H)，3.54(d，J＝3Hz，1H)，3.49(d，J＝6.0Hz，1H)，2.66(m，1H)，2.64(m，1H)2.16(m，2H)，1.91(m，2H)，1.77(m，2H)，1.57(m，1H)，1.52(m，2H)，1.26(s，2H)，1.26(s，2H)，1.26(s，2H)，1.26(s，2H)，1.26(s，2H)，1.26(s，2H)，1.26(s，2H)，1.26(s，2H)，1.22(m，1H)，1.06(s，3H)，1.01(s，3H)，0.97(d，J＝6.9Hz，3H)，0.86(d，J＝6.6Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75MHz)δ173.5，166.1，160.0，125.8，72.9，71.9，66.2，61.8，61.7，58.6，56.2，53.2，48.1，40.6，40.2，35.9，30.2，30.0，30.0，30.0，30.0，30.0，30.0，30.0，30.0，29.4，28.8，23.8，23.0，17.5，15.9，15.5，14.5，14.4.HREIMS m/z585.3660(calcd for C34H51O7N1，585.3660).
实施例16二乙基胺取代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率70％，无色固体.mp 50-52℃。
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ5.11(s，1H)，4.67(s，2H)，3.83(d，J＝3Hz，1H)，3.54(d，J＝3Hz，1H)，3.49(t，J＝5.7Hz，2H)，2.75(m，2H)，2.75(m，2H)，2.69(m，1H)，2.32(m，2H)，2.18(m，2H)，1.91(m，2H)，1.57(m，1H)，1.22(m，1H)，1.12(t，J＝7.2Hz，3H)，1.12(t，J＝7.2Hz，3H)，1.07(s，3H)，0.98(d，J＝6.9Hz，3H)，0.86(d，J＝6.9Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75MHz)δ173.0，170.5，159.8，125.6，73.4，69.9，63.6，63.3，61.2，59.7，55.4，55.1，53.7，53.7，47.6，40.5，35.8，29.9，28.2，23.617.6，17.2，16.8，13.8，12.5，12.5.HREIMS m/z 473.2407(calcd for C26H35O7N1，473.2408).
实施例17甲胺取代乙酸雷公藤内酯醇酯的合成
具体过程同实施例2，各反应物质的投料摩尔比也与实施例2相同，产率85％，无色固体.mp 109-111℃。
1H NMR(CDCl3，300M Hz)δ5.13(s，1H)，4.68(s，2H)，4.31(t，J＝6.6Hz，2H)，3.90(s，1H)，3.84(d，J＝3.0Hz，1H)，3.76(m，3H)，3.56(d，J＝3Hz，1H)，3.37(d，J＝5.7Hz，1H)，2.77(m，1H)，2.69(s，1H)，2.16(m，2H)，1.94(m，2H)，1.60(m，1H)，1.27(m，1H)，1.06(s，3H)，0.97(d，J＝6.9Hz，3H)，0.86(d，J＝6.9Hz，3H).13C NMR(CDCl3，75MHz)δ173.8，167.7，158.0，125.6，84.1，71.8，69.9，64.3，63.9，61.4，59.6，57.6，55.4，47.6，39.9，35.7，29.8，27.7，23.4，17.2，17.2，15.3，14.2，HREIMS m/z 431.1939(calcd for C23H29O7N1，431.1939).
实施例18雷公藤内酯醇衍生物对细胞增值的影响
本实施例采用MTS法测定雷公藤内酯醇衍生物在纳摩尔浓度水平对T315I Bcr-Abl携带细胞的增殖的影响，其具体操作如下：
(1)实验材料
细胞系：选择KBM5细胞系(市售)和KBM5-T315I细胞系(市售)。KBM5携带野生型Bcr-Abl，对STI571敏感。KBM5-T315I携带T315I Bcr-Abl，对STI571耐受。
KBM5和KBM5-T315I用IMDM(Gibco公司)+10％胎牛血清(Hyclone公司)培养。
雷公藤内酯醇衍生物：实施例12制备所得雷公藤内酯醇衍生物。
(2)实验方法
用MTS法检测雷公藤内酯醇衍生物是否对T315I Bcr-Abl的细胞的增殖有抑制作用，MTS为Promega产品，具体测定方法按厂家提供的说明进行即可。
用对数生长的KBM5和KBM5-T315I细胞分别接种于96孔板，每孔20000个细胞。
本实施例设空白组对照组和药物系列倍比稀释组：
空白对照组是不向细胞中加入雷公藤内酯醇衍生物，只加入培养液；
药物系列倍比稀释组是每组设6个重复孔，每孔容积为100μl，加入不同浓度的雷公藤内酯醇衍生物，雷公藤内酯醇衍生物的终浓度分别为5000nM、2500nM、1250nM、625nM、312.5nM、165nM、78nM、39nM、19.5nM和9.8nM。
本实施例中培养液的配方为：含100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素。将上述空白对照组和药物系列倍比稀释组均在37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养72小时终止，在终止培养前4h，加MTS 20μl/孔，继续培养4h，用酶标仪读取吸光度值(A值)。
按下述公式计算细胞活力(Cell Viability)：
细胞活力＝(药物处理组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100％。
实验重复3次，绘制细胞活力和药物浓度关系曲线图。
(3)实验结果：
从图1和图2中可以看出，KBM5和KBM5-T315I细胞的IC50均在1μM以下，说明本发明雷公藤内酯醇衍生物对T315I Bcr-Abl细胞的高效性，本发明的雷公藤内酯醇衍生物在纳摩尔浓度水平显著抑制野生型和T315I Bcr-Abl携带细胞的增殖。
实施例19雷公藤内酯醇衍生物对癌蛋白Bcr-Abl表达的影响及凋亡检测
本实施例以Bcr-Abl野生型及T315I点突变细胞为试验载体，研究雷公藤内酯醇衍生物对癌蛋白Bcr-Abl表达的影响，并检测细胞凋亡。
采用慢性粒细胞白血病细胞系KBM5和KBM5-T315I细胞进行实验：KBM5携带野生型Bcr-Abl，对STI571敏感；KBM5-T315I携带T315I Bcr-Abl。
用对数生长的KBM5和KBM5-T315I细胞分别接种于96孔板，每孔20000个细胞。
本实施例设空白组对照组和实验组：
空白对照组是不向细胞中加入雷公藤内酯醇衍生物，只加入培养液；
实验组是每组设6个重复孔，每孔容积为100μl，加不同浓度的雷公藤内酯醇衍生物，雷公藤内酯醇衍生物的终浓度分别为10000nM、5000nM、2500nM、1250nM、625nM、312.5nM、165nM、78nM、39nM和19.5nM。
本实施例中培养液的配方为：含100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素。
在KBM5和KBM5-T315I细胞的培养体系中分别加入不同浓度(0、50nM和100nM)的实施例12制备的雷公藤内酯醇衍生物，培养24h。
将培养后的对照组细胞和实验组细胞，离心去除上清，用PBS洗2次后，再用RIPA缓冲液(1x PBS缓冲液，1％NP-40裂解液，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS变性剂)悬浮，悬浮的时候还需要向RIPA中新鲜加入10mM β-甘油磷酸、1mM原钒酸钠、10mM NaF、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和1x罗氏完全蛋白酶抑制剂(Roche公司)，冰上孵育30min，超声粉碎，4℃、14000rpm离心10min，取上清，用Bradford法测定蛋白浓度，并采用本领域技术人员的常规操作进行蛋白免疫印迹(Western blot)检测。
蛋白免疫印迹(Western blot)检测结果如图3和图4所示，雷公藤内酯醇衍生物在KBM5和KBM5-T315I细胞呈剂量依赖性下调Bcr-Abl水平，并促使PARP(细胞内蛋白，凋亡经典指标)切割，说明雷公藤内酯醇衍生物对STI571抵抗性Bcr-Abl点突变细胞有效。
实验结果表明，100nM的雷公藤内酯醇衍生物显著抑制Bcr-Abl的表达，并造成PARP蛋白切割，提示细胞凋亡的发生。
结论：雷公藤内酯醇衍生物下调STI571抵抗性T315I Bcr-Abl蛋白酪氨酸激酶的表达。
Claims (10)
1.一种雷公藤内酯醇衍生物，其特征在于该雷公藤内酯醇衍生物具有式(I)所示通式：
其中，R取自氯、胺、脂肪胺或芳香胺。
2.根据权利要求1所述雷公藤内酯醇衍生物，其特征在于所述通式(I)中，R取自Cl、四氢吡咯、哌啶、吗啡啉、N-甲基六氢吡啶、丁胺、胺、胺基乙醇、对氯苯胺、2-胺基丙酸甲酯、乙二胺、六氢吡啶、4-(3-氨基-吡啶)嘧啶-2-胺、二乙醇胺、十一烷基胺、二乙基胺或甲基胺。
3.一种权利要求1所述雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
步骤1.以天然产物雷公藤内酯醇，氯乙酰氯为原料，在催化剂4-二甲基氨基吡啶的作用下发生亲电取代反应，反应结束后，将反应产物减压浓缩后经硅胶柱层析纯化，收集洗脱液为V乙酸乙脂∶V石油醚＝10∶90所得洗脱产物，将洗脱产物减压浓缩后得到所需中间产物——氯乙酸雷公藤甲酯；
步骤2.将步骤1制备所得氯乙酸雷公藤内酯醇酯与胺类化合物，在碳酸钾和极性非质子性溶剂的作用下发生亲核反应，反应结束后，将反应产物减压浓缩，经硅胶柱层析纯化，收集洗脱液为V甲醇∶V氯仿＝100∶1所得洗脱产物，将洗脱产物减压浓缩后，得到权利要求1所述雷公藤内酯醇衍生物。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于所述步骤1中，雷公藤内酯醇与氯乙酰氯的反应摩尔比是1∶2～1∶5。
5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于步骤1中，所述亲电取代反应是在极性非质子性溶剂中进行，所述极性非质子性溶剂为乙醇、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺。
6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于步骤2中，所述胺类化合物为胺、脂肪胺或芳香胺。
7.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于所述步骤2中，氯乙酸雷公藤内酯醇酯、胺类化合物和碳酸钾的反应摩尔比为1∶1.2∶1.2～1∶3∶2。
8.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于所述步骤2中，亲核反应温度为20～60℃，亲核反应时间为6～24小时。
9.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于步骤2中，所述极性非质子性溶剂为乙腈、四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺。
10.权利要求1所述雷公藤内酯醇衍生物在制备抗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20100630 |