CN106995450A - 一种雷公藤甲素衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种雷公藤甲素衍生物及其制备方法和用途，所述雷公藤甲素衍生物的化学结构式如下所示：其中R₁，R₂＝H、CH₃或NH₂；R₃，R₄，R₅＝H、CH₃、NH₂、OCH₃或X。本发明在保持雷公藤甲素生物活性的前提下，降低雷公藤甲素的毒副作用，使雷公藤甲素能够安全有效地应用于临床。

Description

一种雷公藤甲素衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种雷公藤甲素衍生物及其制备方法和用途。

背景技术

癌症是全球发病率及死亡率最高的疾病之一，已严重威胁人类健康。尽管抗癌药研究已取得了很大的进步，但由于长期用药导致癌细胞产生耐药性。大部分抗癌药物在杀灭癌细胞的同时也会伤害人体的正常细胞，另外抗癌药物也存在一定程度的致突变遗传毒性。

雷公藤甲素又称雷公藤内酯醇，是从卫矛科雷公藤属植物中分离出来的一种环氧二萜内酯化合物，是传统中药植物雷公藤的主要活性成分，有较强的抗炎、免疫抑制、抗生育和抗肿瘤等作用。其中雷公藤甲素的抗肿瘤作用引起了广泛关注。在低浓度条件下(～nM)，雷公藤甲素不仅能抑制癌细胞增殖及诱导癌细胞凋亡，而且还能增强多种化疗药物的抗肿瘤效应。尽管雷公藤甲素有较强的抗肿瘤活性，但其水溶性差，治疗窗窄，对消化系统、泌尿生殖系统和血液系统等有较大的毒副作用，从而限制了其临床开发研究。如何在保持雷公藤甲素生物活性的前提下，降低雷公藤甲素的毒副作用，是使雷公藤甲素能够安全有效地应用于临床所亟需解决的关键问题。

目前开展的研究主要是对雷公藤甲素结构进行改造的到其结构类似物，或者以雷公藤甲素为先导化合物，通过前药的策略对雷公藤甲素结构进行修饰,尽管增加了药物的水溶性，但仍然不能很好地解决保持药物活性的情况下降低其毒副作用。

发明内容

本发明通过前药原理在雷公藤甲素游离的羟基上引入醌丙酸结构。由于肿瘤组织中醌氧化还原酶(NAD(P)H:quinone oxidoreductase-1,NQO1)相较于正常组织大量表达。因此药物经吸收分布后，在肿瘤组织中可以经NOQ1还原后自发水解成雷公藤甲素，提高了药物的选择性，从而降低雷公藤甲素对正常组织的毒性(如下所示)：

本发明采取的技术方案是：

本发明的雷公藤甲素衍生物的化学结构式如下所示：

其中R₁，R₂＝H、CH₃或NH₂；

R₃，R₄，R₅＝H、CH₃、NH₂、OCH₃或X。

本发明的雷公藤甲素衍生物的制备方法的合成路线如下：

所述方法的具体步骤如下：

(1)香豆素衍生物的合成：以氢醌类化合物为反应原料，加入摩尔数为1-2倍的丙烯酸衍生物，在50-100℃的条件下进行反应，反应时间为2-24小时，反应使用的溶剂为甲基磺酸。反应完毕后，依次用乙酸乙酯萃取，水，饱和碳酸氢钠水溶液以及饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，用氯仿-正己烷重结晶得到目的化合物。

(2)醌丙酸化合物的合成：以第一步反应得到的香豆素衍生物为原料，加入摩尔数1-2倍的NBS，在0-25℃的条件下反应，反应时间为5-120分钟，反应溶剂为乙腈和水。反应完毕后减压蒸干，残留物通过二氯甲烷进行萃取，水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到目的化合物。

(3)雷公藤甲素衍生物的合成：以雷公藤甲素为原料，加入摩尔1.5-2倍的醌丙酸和1-4倍摩尔比的DCC以及催化当量的DMAP，在20-60℃条件下反应。反应时间为6-48小时，反应溶剂选自DMF，THF和二氯甲烷中的一种。用吸附剂为固定相进行分离纯化，洗脱液经回收干燥得到雷公藤甲素衍生物。优选，雷公藤甲素衍生物的化学结构式如下所示：

制备方法的具体步骤如下：

(1)每1.0g(6.58mmol)氢醌对应与0.85g(7.50mmol)3-甲基-2-丁烯酸混合后一次性加入到10mL甲烷基磺酸，于70℃加热搅拌4h，TLC检测反应完全，停止搅拌，加入125mL水，依次用乙酸乙酯萃取，水，饱和碳酸氢钠水溶液以及饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，用氯仿-正己烷重结晶，得到白色固体；

(2)每1.58g(6.74mmol)步骤(1)的白色固体对应溶于15mL乙腈和3mL水；取1.26g(7.08mmol)NBS分多次加入上述溶液中与室温搅拌30min后，减压蒸干，残留物通过二氯甲烷进行萃取，水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到黄色固体；

(3)每375mg(1.5mmol)步骤(2)得到的黄色固体对应和360mg(1mmol)雷公藤甲素溶于15mL二氯甲烷中，通过加入824mg(4mmol)DCC和127mg(1mmol)DMAP于室温搅拌48h，反应完毕后过滤，收集滤液，滤液挥干，乙酸乙酯复溶，过滤，滤液挥干即为终产物。

本发明的雷公藤甲素衍生物可以用于制备抗肿瘤药物。

本发明的积极效果如下：

本发明通过在雷公藤甲素游离的羟基上引入醌丙酸结构。由于肿瘤组织中醌氧化还原酶(NAD(P)H:quinone oxidoreductase-1,NQO1)相较于正常组织大量表达。因此药物经吸收分布后，在肿瘤组织中可以还原后自发水解成雷公藤甲素，提高了药物的选择性，从而降低雷公藤甲素对正常组织的毒性。本发明在保持雷公藤甲素生物活性的前提下，降低雷公藤甲素的毒副作用，使雷公藤甲素能够安全有效地应用于临床。

附图说明

图1雷公藤甲素(A),CX-13(B)和CX-23(C)对正常肝细胞毒性。

图2雷公藤甲素(A),CX-13(B)和CX-23(C)对HepG2细胞的抑制。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1

(1)1.0g(6.58mmol)氢醌与0.54g(7.50mmol)丙烯酸混合后一次性加入到10mL甲烷基磺酸，于70℃加热搅拌18h，TLC检测反应完全，停止搅拌，加入125mL水，依次用乙酸乙酯萃取，水，饱和碳酸氢钠水溶液以及饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干。用氯仿-正己烷重结晶，得到白色固体即为化合物CX-21，收率约为67％。[M+H]⁺:207.0；¹H NMR,600MHz(CDCl3)δ4.13(bs,1H),2.92(t,2H),2.72(t,2H),2.22(s,3H),2.19(s,3H),2.18(s,3H)。

(2)1.39g(6.74mmol)CX-01溶于15mL乙腈和3mL水；取1.26g(7.08mmol)NBS分多次加入上述溶液中于冰浴搅拌5min后，减压蒸干。残留物通过二氯甲烷进行萃取，水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到黄色固体CX-02,收率约为60％。[M-H]^-:221.0；¹H NMR,600MHz(CDCl3)δ2.82(t,2H),2.51(t,2H),2.07(s,3H),2.02(s,6H)。

(3)取333mg(1.5mmol)CX-02和360mg(1mmol)雷公藤甲素溶于15mL二氯甲烷中，通过加入824mg(4mmol)DCC和127mg(1mmol)DMAP于室温搅拌48h。反应完毕后过滤，收集滤液。滤液挥干，乙酸乙酯复溶，过滤，滤液挥干即为终产物CX-03,收率约为48％。[M-H]^-:563.0；¹H NMR,600MHz(CDCl3)δ5.30(s,1H),5.10(s,1H),4.19(d,J＝6.6Hz,2H),3.84(d,J＝3Hz,1H),3.56(d,J＝3Hz,1H),3.49(d,J＝5.7Hz,1H),2.92(t,2H),2.72(t,2H),2.69(m,1H),2.18(m,2H),2.14(s,3H),1.96(s,3H),1.94(s,3H),1.91(m,2H),1.57(m,1H),1.22(m,1H),1.06(s,3H),0.97(d,J＝6.9Hz,3H),0.86(d,J＝6.6Hz,3H)。

实施例2

(1)1.0g(6.58mmol)氢醌与0.85g(7.50mmol)3-甲基-2-丁烯酸混合后一次性加入到10mL甲烷基磺酸，于70℃加热搅拌4h，TLC检测反应完全，停止搅拌，加入125mL水，依次用乙酸乙酯萃取，水，饱和碳酸氢钠水溶液以及饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干。用氯仿-正己烷重结晶，得到白色固体即为化合物CX-21，收率约为87％。[M+H]⁺:235.0；¹HNMR,600MHz(CDCl3)δ4.13(s,1H),2.56(s,2H),2.35(s,3H),2.23(s,3H),2.19(s,3H),1.46(s,6H)

(2)1.58g(6.74mmol)CX-21溶于15mL乙腈和3mL水；取1.26g(7.08mmol)NBS分多次加入上述溶液中于室温搅拌30min后，减压蒸干。残留物通过二氯甲烷进行萃取，水洗，无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到黄色固体CX-22,收率约为92％。[M-H]^-:249.0；¹HNMR,600MHz(CDCl3)δ3.02(s,2H),2.14(s,3H),1.96(s,3H),1.94(s,3H),1.44(s,6H)。

(3)取375mg(1.5mmol)CX-22和360mg(1mmol)雷公藤甲素溶于15mL二氯甲烷中，通过加入824mg(4mmol)DCC和127mg(1mmol)DMAP于室温搅拌48h。反应完毕后过滤，收集滤液。滤液挥干，乙酸乙酯复溶，过滤，滤液挥干即为终产物CX-23,收率约为48％。[M-H]^-:591.0；¹H NMR,600MHz(CDCl3)δ5.30(s,1H),5.10(s,1H),4.19(d,J＝6.6Hz,2H),3.84(d,J＝3Hz,1H),3.56(d,J＝3Hz,1H),3.49(d,J＝5.7Hz,1H),3.02(s,2H),2.69(m,1H),2.18(m,2H),2.14(s,3H),1.96(s,3H),1.94(s,3H),1.91(m,2H),1.57(m,1H),1.44(s,6H)，1.22(m,1H),1.06(s,3H),0.97(d,J＝6.9Hz,3H),0.86(d,J＝6.6Hz,3H)。

1.体外药理活性和毒性检测

分别取冻存的HepG2细胞和正常的肝细胞，复苏，调整细胞密度为按每孔1x10⁵细胞分别接种于96孔板，当细胞融合达60％～70％时，换不含血清培养液培养24h作同步化处理。随后，细胞被随机分阴性对照组，阳性对照组(0.1，1，5，10，50，100，200，400，1000nM雷公藤甲素处理细胞)，CX-13((0.1，1，5，10，50，100，200，400，1000nM)给药组，CX-23((0.1，1，5，10，50，100，200，400，1000nM)给药组。48h后每孔加入5mg/ml MTT 20μl培养4h，弃去上清液，每孔分别加入二甲亚砜150μl，室温下震荡15min，待黄色结晶溶解后，用酶标仪测定570nm处吸光度值(OD)。

正常肝细胞给药后结果见图1：不同浓度雷公藤甲素(图1A),CX-13(图1B),CX-23(图1C)分别与正常肝细胞温孵后对正常肝细胞的毒性。结果显示对比雷公藤甲素(TC50＝37.65nM)，CX-13(TC50＝366.5nM),CX-23(TC50＝540.5nM)对正常肝细胞毒性分别降低了9.73倍和14.36倍。表明通过本方法对雷公藤甲素的结构修饰可以降低雷公藤甲素对正常肝细胞的毒性。

HepG2给药后结果见图2：不同浓度雷公藤甲素(图1A),CX-13(图1B),CX-23(图1C)分别与HepG2肝癌细胞温孵后对HepG2肝癌细胞的活性。结果显示对比雷公藤甲素(EC50＝43.33nM)，CX-13(EC50＝50.99nM)，CX-23(EC50＝51.65nM)对HepG2肝癌细胞活性相当。表明通过本方法对雷公藤甲素的结构修饰可以保留雷公藤甲素对HepG2肝癌细胞的药理活性。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种雷公藤甲素衍生物，其特征在于：所述雷公藤甲素衍生物的化学结构式如下所示：

其中R₁，R₂＝H、CH₃或NH₂；

R₃，R₄，R₅＝H、CH₃、NH₂、OCH₃或X。

2.如权利要求1所述的雷公藤甲素衍生物，其特征在于：所述雷公藤甲素衍生物的化学结构式如下所示：

3.一种制备如权利要求1所述的雷公藤甲素衍生物的方法，其特征在于：所述方法的合成路线如下：

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：

A.香豆素衍生物的合成：以氢醌类化合物为反应原料，加入摩尔数为1-2倍的丙烯酸衍生物，在50-100℃的条件下进行反应，反应时间为2-24小时，反应使用的溶剂为甲基磺酸；

B.香豆素衍生物的纯化：将反应液依次用纯水，饱和的NaHCO₃，NaCl溶液洗涤后脱水，重结晶得香豆素衍生物中间体；

C.醌丙酸化合物的合成：以第一步反应得到的香豆素衍生物为原料，加入摩尔数1-2倍的NBS，在0-25℃的条件下反应，反应时间为5-120分钟，反应溶剂为乙腈和水；

D.醌丙酸化合物的纯化：反应液低温真空挥干后，通过水洗，乙酸乙酯萃取后重结晶得到第二步反应中间体；

E.雷公藤甲素衍生物的合成：以雷公藤甲素为原料，加入摩尔数为1.5-2倍的醌丙酸和1-4倍摩尔比的DCC以及催化当量的DMAP，在20-60℃条件下反应，反应时间为6-48小时，反应溶剂选自DMF，THF和二氯甲烷中的一种；

F.雷公藤甲素衍生物的纯化：用吸附剂为固定相进行分离纯化，洗脱液经回收干燥得到雷公藤甲素衍生物。

5.一种制备如权利要求2所述的雷公藤甲素衍生物的方法，其特征在于：所述的步骤A中，氢醌类化合物为2，3，5位被-CH₃，NH₂，OCH₃,X等取代的对苯二酚类化合物；丙烯酸衍生物为β位上的氢原子被1-2个甲基或氨基取代的烯酸类化合物。

6.如权利要求1或2所述的雷公藤甲素衍生物用于制备抗肿瘤药物中的用途。