CN103230401A - 雷公藤内酯酮在抗血管新生药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药领域,公开了雷公藤内酯酮在抗血管新生药物中的应用。采用雷公藤内酯酮进行了抑制肿瘤新生血管形成的体外和体内试验,结果显示中草药单体雷公藤内酯酮能诱导肿瘤新生血管形成的关键基因沉默,促进肿瘤细胞老化、分化和凋亡,消除或降低肿瘤细胞的新生血管形成能力,使肿瘤血管正常化和消除,提高抗癌疗效,由有效量的雷公藤内酯酮和药学上可接受的辅料组份可制备片剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂、糖浆剂或乳剂等常用药物制剂,能够用于抗血管新生,此外含有雷公藤内酯酮的提取物也可用于制备抗血管新生的药物制剂。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,具体地涉及雷公藤内酯酮在抗血管新生药物中的应用。
背景技术
每年全球癌症死亡人数达1000万,目前全球四分之一人口死亡的原因是癌症所致,恶性肿瘤已成为严重危害人类生命的元凶。临床防治肿瘤的药物大致分为两大类:第一类直接杀死肿瘤的各种化疗药物,在临床应用最多,但在发展中已遇到毒副作用大、易产生耐药性、治疗费用昂贵等诸多瓶颈制约;第二类抑制肿瘤血管生成和肿瘤转移的药物,如血管生成抑制剂。肿瘤细胞的生长和转移必需完整的血管系统,因此阻止肿瘤血管生成和破坏肿瘤血管就能有效地抑制肿瘤生长和肿瘤转移,甚至治愈肿瘤。大量研究表明,肿瘤新生血管形成(neovascularization)在肿瘤生长和转移中起着举足轻重的作用,而肿瘤细胞又在肿瘤新生血管形成中至关重要。肿瘤细胞除了通过分泌多种血管生长因子促进血管内皮细胞的血管新生(angiogenesis)外,还可以通过血管生成拟态(vasculogenic mimicry)和肿瘤细胞向肿瘤内皮细胞转分化等多种方式,直接参与肿瘤的新生血管形成。肿瘤的快速生长和多点转移与肿瘤血管异常增生有着密切的关系,而肿瘤新生血管形成是恶性肿瘤的一个重要标志。目前,公认的肿瘤新生血管形成方式有六种:(1)内皮细胞介导的血管新生(sproutingangiogenesis);(2)骨髓来源细胞的血管发生(vasculogenesis);(3)血管化生(intussusception);(4)肿瘤细胞和内皮细胞共同形成血管的血管生成协同(vascular cooption);(5)肿瘤细胞主导的血管生成拟态以及(6)肿瘤细胞向肿瘤内皮细胞转分化(trans-differentiation)。其中,肿瘤细胞直接参与的肿瘤新生血管形成的方式就有三种;此外,肿瘤细胞还间接参与了血管新生,它是血管新生的启动者和促进者。可见,内皮细胞介导的血管新生仅仅是肿瘤血管形成的六种方式之一,而肿瘤细胞在肿瘤新生血管形成的启动和发展中起举足轻重的作用。
1971年,全球著名学者Folkman首先提出肿瘤血管新生学说,认为肿瘤血管是正常血管向肿瘤组织的延伸,而肿瘤细胞产生的血管内皮细胞生长因子(VEGF)等生长因子,可诱导内皮细胞活化,并向肿瘤组织迁移,在肿瘤组织中形成新的血管分枝;并提出以VEGF和血管内皮细胞为靶标的抗肿瘤血管新生疗法来治疗恶性肿瘤,为抗肿瘤治疗另辟蹊径。
Folkman的肿瘤血管新生学说引起了很大的反响,众多研究者闻风而动,相继以VEGF-VEGFR-下游蛋白激酶和血管内皮细胞为靶标,研发抗肿瘤血管新生药物。迄今已有5种抗肿瘤血管新生药物被用于临床治疗癌症,如Avastin、Sutent和Endostar(恩度)等;另有10多种同类药物正在进行临床I至III期试验。在这些抗肿瘤血管新生药物中,最值得一提的是Avastin(VEGF单抗)。Avastin在恶性肿瘤的治疗中取得了一定的疗效,为抗肿瘤治疗带来了一线生机。Avastin是目前临床应用最多、疗效相对较好的抗肿瘤血管新生药物之一。
然而,抗肿瘤血管新生疗法治疗恶性肿瘤的道路,并非一帆风顺。近年来的研究显示,Avastin等抗肿瘤血管新生药物虽有一定抗癌疗效,但病人容易产生耐药性,部分病人出现肿瘤的复发和转移,长期抗癌疗效较差。因此,现有抗血管新生药物的抗肿瘤效果亟需提高。由于目前抗肿瘤血管新生药物,主要是以VEGF-VEGFR-下游蛋白激酶和血管内皮细胞为靶标,不能有效地消除肿瘤细胞,而残留的肿瘤细胞及其产生的多种血管生长因子,再度启动和促进肿瘤血管新生。由此看来,单纯抑制或破坏肿瘤血管的治疗方法,并不是抗肿瘤血管治疗中标本兼治的良策。
2001年,Jan等系统地提出了使肿瘤血管正常化的抗肿瘤血管新策略,其核心是通过改变血管内皮细胞的血管新生特性,使肿瘤组织血管功能恢复正常,血流通畅,从而有利于药物和免疫细胞及其因子进入肿瘤组织,抑制肿瘤生长。近年来,人们对肿瘤血管正常化开展了一系列的研究,已取得了一定的进展:①脯氨酰羟化酶-2(PHD2)为靶标的肿瘤血管正常化,能在一定程度上纠正紊乱的肿瘤血管和减小肿瘤体积;②利用VEGF和VEGFR拮抗剂使失常的内皮细胞功能恢复,也能使肿瘤血管正常化,抑制肿瘤生长;③T2-色氨酸转运RNA合成酶(T2-TrpRS)能够特异性地抑制糖尿病视网膜血管新生,还能促进正常血管生长,使增生性病变的糖尿病新生血管正常化。发明人以肿瘤内皮细胞为模型,证实T2-TrpRS具有选择性抑制肿瘤血管形成的作用,阐明了T2-TrpRS通过与其细胞膜受体VE-cadherin(血管内皮细胞钙粘着蛋白)结合,诱导新生血管正常化的重要机制。
然而,十多年来肿瘤血管正常化药物研发道路仍是困难重重。目前,对于PHD2能否作为肿瘤血管正常化的靶标这一问题,亦是众说纷纭。有研究认为PHD2基因缺陷可使肿瘤血管正常化,但也有研究报道称激活PHD2可促进肿瘤血管正常化。现有的针对VEGF-VEGFR和血管内皮细胞的抗肿瘤靶向药物,虽然能在一定程度上使肿瘤血管正常化,但对肿瘤细胞的抑制作用不明显,对肿瘤细胞主导的新生血管形成疗效有限。由此可见,如果单纯针对VEGF-VEGFR和血管内皮细胞介导的肿瘤血管正常化,而忽略肿瘤细胞主导的肿瘤新生血管形成,就有可能事倍功半。因此,目前肿瘤血管正常化药物的研发需要广开思路,寻找新的策略。
近年来,发明人对现有抗肿瘤血管新生疗法所面临的挑战,进行了深入的探讨和分析。抗肿瘤血管新生疗法是一把双刃剑,其一面阻断或破坏了肿瘤血管,抑制了肿瘤生长;另一面却加剧了肿瘤组织缺氧,促进肿瘤细胞向邻近有氧组织迁移,导致肿瘤转移。如上所述,目前的肿瘤血管正常化策略虽然能在一定程度上纠正紊乱的肿瘤血管和改善血液循环,有利于抗癌药物进入肿瘤组织,减小肿瘤体积;但难以有效地消除肿瘤细胞,残留的肿瘤细胞往往会死灰复燃,导致肿瘤的复发。2013年初,在美国举行的第15届国际抗血管新生药物大会上,来自全球的众多研究者对现有抗肿瘤血管新生药物和抗肿瘤血管疗法,进行了深入的探讨。与会者认识到以往人们对恶性肿瘤新生血管形成的机理缺乏全面和深刻的了解,从而导致在药物研发的靶标选择上有所偏颇,对肿瘤细胞等在新生血管形成中的作用没有给予足够的重视。因此,抗肿瘤血管治疗需要广开思路,高度重视肿瘤细胞等多种细胞的作用,研发高效的抗肿瘤新生血管形成药物;抗肿瘤血管需多靶点、多箭齐发,才有可能取得更好的抗癌疗效。
肿瘤细胞形成的新生血管也具有“返祖现象”,与胚胎发育早期形成的血管在形态学和基因表达谱等诸多方面具有相似之处。在目前公认的肿瘤新生血管形成的六种方式中,肿瘤细胞介导的血管生成拟态和肿瘤细胞-内皮细胞转分化的研究取得了惊人的进展,给抗肿瘤新生血管带来了新的希望。
越来越多的研究显示恶性肿瘤血管并非都由血管内皮细胞组成,肿瘤细胞也可形成肿瘤血管。1999年,Hendrix领导的研究小组发现黑色素瘤细胞能够直接形成肿瘤血管,而不依赖于血管内皮细胞,提出了血管生成拟态的新概念。随后,国内外不少学者相继报道了血管生成拟态在多种高转移性的癌症中存在,包括黑色素瘤、脑胶质瘤、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、结直肠癌、淋巴瘤、垂体瘤、肾癌、骨髓瘤及急性白血病(骨髓)等15种恶性肿瘤;并证明血管生成拟态与恶性肿瘤转移和复发,以及肿瘤病人的5年生存率低密切相关。肿瘤血管生成拟态的发现,拓宽了人们在肿瘤新生血管形成方面的视野,加深了人们对肿瘤新生血管形成复杂性的认识,亦为抗肿瘤新生血管药物的研发提供了新的靶标。
2008年,Gao等首先报道了前肿瘤干细胞(2C4)直接参与了肿瘤新生血管形成。发明人曾与Gao研究小组进行科研协作,并通过实验证明PIWIL2的异常高表达在肿瘤血管和肿瘤发生中起着重要作用。2010年,四个研究团队,先后报道了脑胶质瘤干/祖细胞能形成肿瘤血管,结果令人震惊:胶质瘤干/祖细胞来源的血管占脑胶质瘤血管总数的61.8%,提示肿瘤干/祖细胞在人恶性肿瘤新生血管形成中起重要作用。肿瘤干/祖细胞通过转分化产生肿瘤内皮细胞,进而形成肿瘤血管。这些研究成果使人们对肿瘤新生血管形成的认识为之一新,也更加清楚地认识到肿瘤细胞主导的新生血管形成的重要性。
细胞生物学研究显示肿瘤组织中存在肿瘤血管内皮细胞,并具有如下特性:①表达多种肿瘤内皮细胞的标记物,②与肿瘤细胞一样,细胞染色体常有非整倍体、缺失、移位和基因突变等异常,③异常高表达VEGFR、FGFR和PDGFR等多种生长因子受体。肿瘤内皮细胞形成的血管与正常血管在形态学和功能学等诸多方面存在截然不同的特征。肿瘤内皮细胞形成的肿瘤血管在肿瘤的转移和复发中起了重要作用。因此,以肿瘤内皮细胞为靶标研发抗肿瘤血管药物,为今后特异性抗肿瘤新生血管药物的研发指明了新的方向。
雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是卫矛科雷公藤属植物,以全根或去皮根木质部入药。雷公藤性味苦,具有活血化瘀、清热解毒、消肿散结、祛风除湿、杀虫止血的作用,临床用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾炎、强直性脊柱炎、牛皮癣等疾病,但有大毒,而且上述临床应用的有效剂量和中毒剂量之间比较接近,因而雷公藤全药迄今未能得到广泛的临床应用。
为了提高药效,降低毒副作用,研究者已分离出多种雷公藤有效成分(单体)。国内外学者已从雷公藤属植物中分离出几十种化学成分,主要有二萜、三萜、倍半萜、生物碱、苷类、糖类、醇类和微量元素等。其中雷公藤甲素(Triptolide)和雷公藤红素已被应用于临床治疗肿瘤和自身免疫性疾病,虽然取得了一定的疗效,但由于毒性作用较大,尚未被广泛用于临床治疗上述疾病。雷公藤的其它几十种活性物质的药用价值正在研究和评估中。
雷公藤内酯酮(Triptonide),又叫雷公藤羰内酯、雷公藤酮,是从雷公藤中分离得到的一个二菇类化合物。1972年Kupchan首次报道了下式(I)的雷公藤内醋酮的化学结构。雷公藤内酯酮与雷公藤甲素同属于环氧二萜内酯化合物,也具有3个环氧和α,β-不饱和醛酮内酯环的基本骨架,但结构上相差一个基团,即雷公藤内酣酮C-14位为羰基,而雷公藤甲素为羟基。雷公藤内酷酮的分子式为C20H22O6,分子量为358,为无色结晶,熔点252-253℃。
据文献报道,雷公藤内酯酮具有以下药理作用:
(1)抗炎症作用:雷公藤内酯酮对大鼠类风湿性关节炎具有明显的抑制作用,能剂量依赖性抑制大鼠足肿胀,明显抑制ConA诱导刺激的脾T淋巴细胞增殖,同时能明显降低脾细胞因子IL-1B、TNF-A和IL-6含量以及关节浸液NO、PGE2含量。
(2)免疫抑制作用:雷公藤内酯酮具有明显的免疫抑制作用,能明显抑制小鼠耳廓急性炎症及毛细血管通透性,降低胸腺指数、碳粒廓清速率、抑制脾细胞抗体的形成、降低小鼠血清溶血素含量及外周血T淋巴细胞的百分比。
(3)抗雄性抗生育作用:雷公藤内酯酮还具有抗雄性抗生育作用,作用机制可能主要是增加精子细胞cyclin D1和Cdk4基因的表达,抑制附睾精核蛋白的生物合成。
(4)雷公藤内酯酮的抗新生血管的作用迄今尚未见报道:然而,经现有文献调研和科技查新,雷公藤内酯酮对新生血管的影响在国内外文献和专利中未见报道,仅见1972年Kupchan等在一篇共2页的研究通讯中,讨论了雷公藤甲素和雷公藤甲素的化学结构与抗白血病活性的关系,仅用了一句话提及雷公藤内酯酮对白血病细胞的增殖具有抑制作用,但该研究通讯没有出示任何实验证据。以后,该通讯被多篇文献引用,并作为雷公藤内酯酮抗肿瘤作用的依据。此外,朱永亮申报了雷公藤二萜内酯类化合物用于癌症的治疗,但未涉及抗新生血管的作用。综上所述,迄今国内外尚未见关于雷公藤内酯酮的抗肿瘤新生血管作用的报道和专利。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种雷公藤内酯酮的新应用,即雷公藤内酯酮在抗血管新生药物中的应用。
本发明还提供了一种抗血管新生药物制剂,由有效量的雷公藤内酯酮和一种或多种药学上可接受的辅料组成,所述的雷公藤内酯酮含有重量比为51~99.5%的活性成分。
优选的,所述的雷公藤内酯酮含有重量比为51~95%的活性成分。
本领域技术人员可将所述雷公藤内酯酮直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料,如辅助物质、稳定剂、润湿剂、增溶剂和其它常用的添加剂,如乳糖、滑石粉、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、果胶、吐温-80、聚乙烯醇等,以常规药物制剂方法,制成抗血管新生药物的常用制剂如片剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂、糖浆剂或乳剂。
含有雷公藤内酯酮的提取物也可用于制备成抗血管新生药物制剂。
本发明所述的抗血管新生药物制剂的使用剂量和使用方法取决于诸多因素,包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病程严重程度以及诊治医师的主观判断。本领域的技术人员根据上述因素可以容易地决定使用剂量和使用方法。建议将本发明的活性成分雷公藤内酯酮制成各种剂型的口服药物,成人口服,常用剂量一次5mg/公斤体重,1日3次,最大口服剂量的雷公藤内酯酮含量应为每天15mg/公斤体重,饭后服用,儿童用药酌情减量。
发明人采用雷公藤内酯酮进行了抑制肿瘤新生血管形成的体外和体内试验,结果显示中草药单体雷公藤内酯酮能诱导肿瘤新生血管形成的关键基因沉默,促进肿瘤细胞老化、分化和凋亡,消除或降低肿瘤细胞的新生血管形成能力,使肿瘤血管正常化和消除,提高抗癌疗效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的有关本发明的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例3雷公藤内酯酮对肿瘤血管样网状结构形成的抑制作用的显微照片,48孔板每孔加入0.2ml Matrigel,待其凝固后,分别加入2×104肺癌细胞H1299(图1A)、4×104肺癌细胞A549(图1B)和2×104胰腺癌细胞PaTu8988(图1C),孵育6小时(不加雷公藤内酯酮),用瑞姬氏染液进行染色,在显微镜下观察拍照,40×;
图2是实施例4雷公藤内酯酮的体内抗肿瘤效应的照片和统计图,C57BL/6小鼠(n=6)背部皮下接种2×106肺癌细胞LL/2(图2A),裸小鼠(n=5)背部皮下接种5×106PaTu8988细胞(图2C),腹腔注射雷公藤内酯酮(TN)每天给药5mg/kg,对照组给予等体积的生理盐水,第18天(肺癌细胞LL/2,图2B)或27天(胰腺癌细胞PaTu8988,图2D)后,取出肿瘤组织拍照并记录肿瘤重量,然后对肿瘤重量用SPSS11.5统计软件进行统计学分析,*代表P≤0.01,●代表肿瘤已消除(图2C),ctrl表示对照组;
图3是实施例5雷公藤内酯酮对肿瘤细胞增殖的抑制作用的显微照片,将肺癌细胞H1299和人良性血管瘤内皮细胞HC-1分别与不同剂量的雷公藤内酯酮(TN)孵育48小时,再用瑞姬氏染液进行染色,在显微镜下观察拍照,200×;
图4是实施例8雷公藤内酯酮诱导多种肿瘤细胞分化或老化的显微照片,肺癌细胞H1299(图4A)和LL/2(图4B)以及胰腺癌细胞PaTu8988(图4C)分别与不同剂量的雷公藤内酯酮(TN)孵育6天,用瑞姬氏染液进行染色,在显微镜下观察,肺癌细胞H1299,640×(图4A),LL/2和PaTu8988,1000×(图4B和4C);
图5是实施例9雷公藤内酯酮对肿瘤细胞克隆形成的抑制作用的显微照片,将人肺癌细胞H1299与低剂量0、1.25、2.5、5nM雷公藤内酯酮(TN)孵育(图5A),同时将胰腺癌细胞PaTu8988与0、1、2、3nM雷公藤内酯酮孵育(图5B)。6天后,取600个活细胞与1.5ml无雷公藤内酯酮的软琼脂(0.5%)细胞培养液(15%FBS-RPMI1640)混合,培养14天(无雷公藤内酯酮),显微镜下拍照,图5A为40×,图5B为10×;
图6是实施例10雷公藤内酯酮能够抑制多种癌基因和端粒酶TERT在肺癌细胞和胰腺癌细胞中的表达图,肺癌细胞H1299分别与低剂量0、0.625、1.25、2.5、5nM雷公藤内酯酮(TN)孵育(图6A);人胰腺癌细胞Panc8988分别与低剂量0、1、2、3nM雷公藤内酯酮孵育9天后(图6B),分离和纯化RNA,用RT-PCR检测细胞中癌基因RAS、端粒酶TERT等与肿瘤新生血管形成密切相关的关键基因的表达。
具体实施方式
近5年来,发明人致力于肿瘤细胞介导的肿瘤新生血管形成研究,建立了体内外肿瘤细胞形成血管的模型,揭示了T2-TrpRS抗肿瘤新生血管形成的机制,发现中草药单体盐酸石蒜碱具有抗肿瘤新生血管形成作用,报道了非洲防己碱的抗骨肉瘤细胞新生血管形成作用,为开展肿瘤细胞主导的肿瘤血管正常化和消除的研究奠定了坚实的基础。迄今为止,雷公藤内酯酮的抗肿瘤新生血管形成尚未见报道。发明人研究了雷公藤内酯酮对肺癌细胞和胰腺癌细胞的新生血管形成和致瘤性的影响。实验结果显示,雷公藤内酯酮在纳摩尔水平就能选择性地抑制肿瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞凋亡,还能通过诱导肿瘤细胞老化、分化和凋亡,有效地抑制肿瘤细胞主导的新生血管形成,降低肿瘤细胞的致瘤能力,提示雷公藤内酯酮具有很强的抗肿瘤血管和抗癌作用。以下结合具体实施例对上述的方案做进一步说明。应理解,这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整,未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1:雷公藤内酯酮对体外肿瘤细胞粘附的影响
肿瘤细胞粘附和迁移,是肿瘤新生血管形成和肿瘤转移的必要环节。发明人首先研究了雷公藤内酯酮是否能抑制肿瘤细胞粘附。
(1)实验材料
肿瘤细胞株:人肺癌细胞H1299为本实验室冻存;细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。
受试药物:雷公藤内酯酮(从商业公司购买)用二甲基亚砜(DMSO)助溶,用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度;明胶购自Sigma公司。
(2)实验方法
将不同浓度雷公藤内酯酮处理人肿瘤细胞24h,用无血清培养基重悬后用台盼蓝计数活细胞,调整细胞密度接种于0.1%明胶包被的96孔板中。待细胞贴壁后吸弃培养基,PBS洗三次,加入新鲜培养基,以10μL/孔加入Alamarblue试剂。2h后用酶标仪测OD560/590值,计算细胞粘附率。实验独立重复3次。
(3)实验结果
表1 雷公藤内酯酮对人肿瘤细胞粘附的作用
通过设定不同的药物浓度,在细胞培养30min后可以发现80纳摩尔(nM)能明显抑制细胞粘附。当浓度大于或等于40nM时几乎没有细胞粘附(见表1)。
实施例2:雷公藤内酯酮对体外肿瘤细胞迁移的抑制作用
肿瘤细胞迁移越快,往往转移性就越强,发明人研究了雷公藤内酯酮对体外肿瘤细胞迁移的影响,发现雷公藤内酯酮能够抑制肿瘤细胞的迁移。
(1)实验材料
肿瘤细胞株:人肺癌细胞H1299为本实验室冻存;细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。
受试药物:雷公藤内酯酮(从商业公司购买)用二甲基亚砜(DMSO)助溶,用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。
(2)实验方法
将处于对数生长期的人肺癌细胞H1299细胞以合适密度接种于6孔板中,24h后进行划痕,吸弃培养基后用PBS洗三次,重新加入含不同浓度雷公藤内酯酮的5%FBS培养基,分别于不同时间拍照。实验独立重复3次。
(3)实验结果
表2 雷公藤内酯酮对人肿瘤细胞迁移的作用
以0nM的雷公藤内酯酮为对照,将给药组细胞与对照组的伤口愈合程度进行比较,判断雷公藤内酯酮对肺癌细胞H1299迁移能力的影响。结果显示,10-80nM的雷公藤内酯酮能明显抑制肺癌细胞的迁移,其抑制作用的大小与雷公藤内酯酮的浓度相关(见表2)。
实施例3:雷公藤内酯酮对肿瘤血管样网状结构形成的抑制作用
如上所述,肿瘤细胞在肿瘤血管形成中起了重要作用。发明人以具有血管生成能力的肿瘤细胞为模型,研究了雷公藤内酯酮对肿瘤细胞的血管样网状结构形成能力的影响。
(1)实验材料
肿瘤细胞株:人肺癌细胞H1299、A549和胰腺癌细胞PaTu8988来自ATCC,为本实验室冻存;细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。
受试药物:纯化的雷公藤内酯酮(从商业公司购买,纯度大于95%)用二甲基亚砜(DMSO)助溶,用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度;Matrigel试剂购自BD公司,瑞-姬氏染液购自南京建成科技有限公司。
(2)实验方法
实验前一天将Matrigel置于冰上过夜,实验时取融化的Matrigel,加入到48孔板中,37℃孵育0.5h。将事先给予雷公藤内酯酮作用6天的肿瘤细胞记数并取活细胞用于血管样网状结构的形成实验。48孔板每孔加入0.2ml Matrigel,待其凝固后,分别加入2×104肺癌细胞H1299、4×104肺癌细胞A549和2×104胰腺癌细胞PaTu8988,孵育6小时(不加雷公藤内酯酮),用瑞姬氏染液进行染色,在显微镜下观察拍照。
(3)实验结果
实验结果显示,低剂量雷公藤内酯酮5nM能够明显降低人肺癌细胞H1299(参见图1A)和A549体外血管样网状结构的形成。10nM的雷公藤内酯酮可使肿瘤细胞血管形成能力几乎丧失(参见图1B)。同样,胰腺癌细胞PaTu8988与2nM雷公藤内酯酮孵育6天后,其血管样网状结构形成能力降低,3nM时雷公藤内酯酮就能有效地抑制胰腺癌细胞的血管形成(参见图1C)。结果显示,雷公藤内酯酮对胰腺癌细胞血管样网状结构形成的抑制效果极佳。
实施例4:雷公藤内酯酮的体内抗肿瘤效应
肿瘤新生血管促进肿瘤生长。发明人以具有血管生成能力的肿瘤细胞为模型,研究了雷公藤内酯的体内酮抗肿瘤效应。
1、实验动物
1.1、雌性C57BL/6小鼠
来源:苏州大学医学院实验动物中心
合格证:实验动物生产许可证号:XCYK(苏)2002-0008;实验动物使用许可证号:SYXK(苏)2002-0037
体重:18-22g
每组动物数:6只
1.2、雌性裸小鼠
来源:苏州大学医学院实验动物中心
合格证:实验动物生产许可证号:XCYK(苏)2002-0008;实验动物使用许可证号:SYXK(苏)2002-0037
体重:18-22g
每组动物数:5只
1.3、肿瘤细胞株LL/2和人胰腺癌细胞株Patu8988为本所实验室冻存
1.4、受试药物:雷公藤内酯酮用土温-80助溶,生理盐水稀释成所需浓度
2、实验方法
2.1、LL/2荷瘤小鼠模型
C57BL/6雌性小鼠12只,体重18-22g。随机分为二组,每组6只:模型组和雷公藤内酯酮组。将准备好的LL/2肿瘤细胞悬液以5×106/只接种于模型组和雷公藤内酯酮组小鼠背部皮下。在接种肿瘤细胞的当天开始腹腔注射给药,雷公藤内酯酮组每天给药5mg/kg,模型组给药等体积的生理盐水,每天一次。第18天脱臼法处死小鼠,取出肿瘤拍照并记录肿瘤重量,然后按以下公式计算抑瘤率:肿瘤抑制率=[1-给药组平均瘤重/模型组平均瘤重]*100%。
2.2、Patu8988荷瘤小鼠模型
雌性裸小鼠10只,体重18-22g。随机分为二组,每组5只:模型组和雷公藤内酯酮组。将准备好的Patu8988肿瘤细胞悬液以1×107/只和0.1ml Matrigel混匀后接种于模型组和雷公藤内酯酮组小鼠背部皮下。在接种肿瘤细胞的当天开始腹腔注射给药,雷公藤内酯酮组每天给药5mg/kg,模型组给药等体积的生理盐水,每天一次。第27天脱臼法处死小鼠,取出肿瘤拍照并记录肿瘤重量,然后按以下公式计算抑瘤率:肿瘤抑制率=[1-给药组平均瘤重/模型组平均瘤重]*100%。
3、统计学分析:
采用SPSS11.5统计软件进行统计学分析,组间比较采用独立样本t检验。
4、实验结果
动物实验结果显示,与对照组相比,雷公藤内酯酮用药组小鼠的肿瘤重量和肿瘤体积明显降低(P<0.01),雷公藤内酯酮的抑瘤率高达63%(图2A-2B);结果表明雷公藤内酯酮对荷瘤小鼠肿瘤的生长具有显著的抑制作用。同时观察到,与对照组相比,雷公藤内酯酮用药组荷瘤小鼠的体重没有明显变化,也未见有明显的毒副作用;显示雷公藤内酯酮在上述有效剂量时毒性较小,与以往报道雷公藤内酯酮作为男性避孕药和免疫抑制剂的毒副作用较小相一致。
此外,发明人还探讨了雷公藤内酯酮的体内抗胰腺癌细胞生长的作用。将PaTu8988接种于裸小鼠皮下,接种当天进行腹腔注射给药。雷公藤内酯酮给药组每天给药5mg/kg,对照组给予等体积的生理盐水。结果显示,用药27天后,与对照组相比,雷公藤内酯酮给药组5只小鼠中,3只小鼠的肿瘤重量大大减小,2只小鼠的肿瘤完全消失(图2C-2D)。结果表明,雷公藤内酯酮对小鼠体内胰腺癌移植瘤具有很强的抑制作用。
以上实施例显示雷公藤内酯酮具有很强的抗肿瘤血管和抗肿瘤效应,发明人进行了一系列研究,探讨了雷公藤内酯酮抗肿瘤血管和抗肿瘤的机制,如下。
实施例5:雷公藤内酯酮对肿瘤细胞增殖的抑制作用
肿瘤细胞往往增殖调控,多种肿瘤细胞大量增值,形成肿瘤和肿瘤血管。申请人研究了雷公藤内酯酮对肿瘤细胞增殖的影响。
(1)实验材料
肿瘤细胞株:人肺癌细胞H1299和人良性血管瘤内皮细胞HC-1为本实验室冻存;细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。
受试药物:雷公藤内酯酮(从商业公司购买)用二甲基亚砜(DMSO)助溶,用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度;瑞-姬氏染液购自南京建成科技有限公司。
(2)实验方法
细胞培养:细胞用含体积分数10%小牛血清及1%双抗(抗青霉素和抗链霉素)的RPMI1640或DMEM(高糖)培养液常规培养。每48-72h用0.25%胰酶消化,1:2~1:4扩瓶传代。
瑞-姬氏染色测定:取对数生长期的人肺癌细胞H1299和人良性血管瘤内皮细胞HC-1,调整细胞浓度为104/孔,接种于24孔培养板内。24h后分别加入含不同浓度D1的完全培养基,对照组加入含0.16%DMSO的培养基。48h后去除培养基,依次加入瑞-姬氏染液A50μL/孔,静置1min,再加入100μL/孔染液B,混匀后作用5min,吸弃染液,PBS洗2次,在OLYMPUS FSX-100显微镜下观察拍照(200×)。
(3)实验结果
瑞-姬氏染色结果显示(参见图3),雷公藤内酯酮能抑制人肺癌细胞H1299的生长,而对人良性血管瘤内皮细胞HC-1无明显抑制作用,提示雷公藤内酯酮对肺癌细胞生长具有选择性的抑制作用。
实施例6:雷公藤内酯酮对体外肿瘤细胞细胞周期的影响
(1)实验材料
肿瘤细胞株:人肺癌细胞H1299为本实验室冻存;细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。
受试药物:雷公藤内酯酮(从商业公司购买)用二甲基亚砜(DMSO)助溶,用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。
(2)实验方法
将不同浓度的雷公藤内酯酮处理人肺癌细胞H1299 24h后,收集细胞,PBS洗涤2次,加入体积分数为70%的乙醇,4℃固定过夜。离心洗涤后,加入5μLRNase,37℃温育30min后,再加入10mg/ml2.5μLPI染液混匀,置4℃避光30min后上流式细胞仪检测细胞周期分布,实验独立重复3次。
(3)实验结果
表3 雷公藤内酯酮对人肿瘤细胞细胞周期的作用
流式细胞仪检测结果显示:雷公藤内酯酮浓度在20nM以下对细胞周期无明显影响,40nM及以上雷公藤内酯酮使肺癌细胞周期S期有所升高,G2/M期有所下降(参见表3),但其差别与对照组相比均没有显著的统计学意义。这些结果显示雷公藤内酯酮的抗肿瘤作用主要不是通过抑制肿瘤细胞增值。
实施例7:雷公藤内酯酮对体外肿瘤细胞凋亡的影响
接着,申请人又探讨了雷公藤内酯酮的抗肿瘤作用是否通过诱导细胞凋亡。
(1)实验材料
肿瘤细胞株:人肺癌细胞H1299为本实验室冻存;细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。
受试药物:雷公藤内酯酮(从商业公司购买)用二甲基亚砜(DMSO)助溶,用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度;Annexin V/PI双染试剂盒购自Sigma公司。
(2)实验方法
收集细胞包括其上清液,1000rpm离心5min弃上清,用冰PBS重悬细胞,转移至1.5ml的EP管中,2000rpm离心5min,弃上清,加入300ul AnnexinⅤ结合缓冲液(binding buffer)重悬细胞后,再分别加入4.5ul PI及3ul AnnexinⅤ后,置4℃避光10min后上流式细胞仪检测细胞凋亡,实验独立重复3次。
(3)实验结果
表4 雷公藤内酯酮对人肿瘤细胞细胞凋亡的作用
流式细胞仪检测结果显示:在20nM以下时,雷公藤内酯酮对细胞凋亡无明显影响;40nM时,细胞凋亡仅有少量增加;80nM时,细胞凋亡率上升至33.1%(参见表4)。结果显示,低浓度雷公藤内酯酮不是通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤生长的。
实施例8:雷公藤内酯酮诱导多种肿瘤细胞分化或老化
肿瘤普遍存在细胞分化和老化缺陷,未分化肿瘤细胞,特别是肿瘤干、祖细胞保持高度增值,血管形成能力和致瘤性都很强。因此,诱导肿瘤细胞分化或老化,是抗肿瘤和肿瘤血管的重要策略。发明人发现雷公藤内酯酮能够诱导多种肿瘤细胞分化或老化。
(1)实验材料
肿瘤细胞株:人肺癌细胞株H1299、小鼠肺癌细胞株LL/2、人胰腺癌细胞Patu8988为本实验室冻存;细胞培养基RPMI1640和DMEM均为Hyclone公司产品。
受试药物:雷公藤内酯酮(从商业公司购买)用二甲基亚砜(DMSO)助溶,用培养基稀释成所需浓度。
(2)实验方法
取对数生长期的人肺癌细胞株H1299、小鼠肺癌细胞株LL/2、人胰腺癌细胞Patu8988,接种于T25培养瓶内,并分别加入含不同浓度雷公藤内酯酮的完全培养基,对照组加入含0.001%DMSO的培养基,每3天换液一次并按照相同细胞浓度再次接种,作用9天后进行瑞-姬式染色,OLYMPUS FSX-100显微镜拍照。
(3)实验结果
以上细胞周期和细胞凋亡实验结果显示,低剂量雷公藤内酯酮(小于20nM)能够抑制肺癌细胞生长,但对细胞周期和细胞凋亡的影响较小。为了解开雷公藤内酯酮抑制肿瘤细胞生长之谜,我们对雷公藤内酯酮抑制肿瘤细胞生长的作用,进行了较长时间的连续实验观察;结果发现,用很低剂量雷公藤内酯酮与肺癌细胞H1299或者LL/2孵育6天后,与对照组相比,用药组肿瘤细胞的胞浆明显增多、细胞核增大、细胞核有丝分裂受阻、细胞体积非常明显增大(图4A和4B)。形态学结果提示,雷公藤内酯酮很可能诱导肿瘤细胞老化或分化;其中胰腺癌细胞PaTu8988对雷公藤内酯酮特别敏感,孵育6天后,极低浓度雷公藤内酯酮(2nM)就能诱导肿瘤细胞老化或分化(图4C)。且随着药物浓度的提高,对肿瘤细胞作用相应地增强,当药物浓度达到5nM时,细胞形态发生明显的变化。
实施例9:雷公藤内酯酮对肿瘤细胞克隆形成的抑制作用
申请人还研究了雷公藤内酯酮诱导多种肿瘤细胞分化或老化后,这些细胞的克隆形成是否降低。
(1)实验材料
肿瘤细胞株:人肺癌细胞株H1299和人胰腺癌细胞Patu8988为本实验室冻存;细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。
受试药物:雷公藤内酯酮(从商业公司购买)用二甲基亚砜(DMSO)助溶,用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度;明胶购自Sigma公司。
(2)实验方法
取对数生长期的人肺癌细胞株H1299和人胰腺癌细胞Patu8988,接种于T25培养瓶内,并分别加入含不同浓度雷公藤内酯酮的完全培养基,对照组加入含0.001%DMSO的培养基,每3天换液一次并按照相同细胞浓度再次接种,作用一定时间后各组均取1000个肿瘤细胞与低熔点不添加生长因子的软琼脂混匀,37℃5%培养箱培养15天后取出,进行瑞-姬式染色,低倍显微镜拍照。
(3)实验结果
细胞克隆形成是衡量肿瘤细胞致瘤性的一个金标准。在不添加生长因子的软琼脂上进行体外培养时,正常细胞不能形成克隆,而致瘤性高的肿瘤细胞能够形成克隆。用低剂量雷公藤内酯酮(2.5nM),孵育6天后,人肺癌细胞H1299克隆数明显减少,克隆体积也明显减小;5nM雷公藤内酯酮孵育6天后,肺癌细胞的克隆形成能力几乎完全丧失(图5A)。更令人振奋的是胰腺癌细胞PaTu8988与2nM雷公藤内酯酮孵育6天后,该肿瘤细胞的克隆形成能力大大降低,3nM雷公藤内酯酮能使其几乎完全丧失(图5B)。以上结果提示,雷公藤内酯酮能够有效地降低或消除肺癌细胞和胰腺癌细胞的致瘤性,对胰腺癌细胞尤其有效。
实施例10:雷公藤内酯酮抗肿瘤作用机制的初步探讨
以上细胞学和动物体内研究显示雷公藤内酯酮基因很强的抗肿瘤作用。然而,其作用的分子机制有待于阐明。发明人初步探讨了雷公藤内酯酮抗肿瘤的作用机制。
(1)实验材料
肿瘤细胞株:人肺癌细胞H1299和胰腺癌细胞PaTu8988为本实验室冻存;细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品;Trizol试剂:购自美国Invitrogen公司;逆转录试剂盒:Fermentas,美国;PCR试剂盒:大连宝生物工程有限公司;GelRed核酸凝胶染料:购自美国Boitium;引物由上海生工生物工程技术服务有限公司。
受试药物:雷公藤内酯酮(从商业公司购买)用二甲基亚砜(DMSO)助溶,用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。
(2)实验方法
取对数生长期的人肺癌细胞株H1299、小鼠肺癌细胞株LL/2、人胰腺癌细胞Patu8988,接种于T25培养瓶内,并分别加入含不同浓度雷公藤内酯酮的完全培养基,对照组加入含0.001%DMSO的培养基,每3天换液一次并按照相同细胞浓度再次接种,作用9天后采用Trizol提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA。PCR反应体系为25μl,PCR条件为94℃预变性3min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,22-35个循环,72℃延伸8min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪拍照。
(3)实验结果
近来,我们初步探讨了雷公藤内酯酮抗肿瘤和抗新生血管形成的作用机制。RT-PCR结果显示,低浓度的雷公藤内酯酮能够明显地抑制癌基因RAS(h-RAS、n-RAS和k-RAS)和端粒酶TERT在人肺癌细胞中的表达,而对VEGF和HIF1等基因无明显抑制作用。在H1299细胞中,2.5nM和5nM雷公藤内酯酮能够有效地抑制h-RAS、n-RAS和端粒酶TERT的表达(图6A)。
文献报道70-80%胰腺癌病人具有k-RAS点突变和异常激活,而癌基因k-RAS点突变和过表达是胰腺癌的重要诱因。此外,端粒酶TERT也在胰腺癌组织中高表达。申请人探讨了雷公藤内酯酮对胰腺癌细胞中RAS和TERT基因表达的影响。RT-PCR结果显示,很低浓度的雷公藤内酯酮(3nM)能够明显地抑制人胰腺癌细胞PaTu8988中k-RAS和TERT的表达(图6B)。
综上所述,发明人采用雷公藤内酯酮进行了抑制肿瘤新生血管形成的体外和体内试验。结果显示中草药单体雷公藤内酯酮能诱导肿瘤新生血管形成的关键基因沉默,促进肿瘤细胞老化、分化和凋亡,消除或降低肿瘤细胞的新生血管形成能力,使肿瘤血管正常化和消除,提高抗癌疗效。
Claims (5)
1.雷公藤内酯酮在制备抗血管新生药物中的应用。
2.一种抗血管新生药物制剂,其特征在于:其由有效量的雷公藤内酯酮和一种或多种药学上可接受的辅料组成,所述的雷公藤内酯酮含有重量比为51~99.5%的活性成分。
3.根据权利要求2所述的抗血管新生药物制剂,其特征在于:所述的雷公藤内酯酮含有重量比为51~95%的活性成分。
4.根据权利要求2所述的抗血管新生药物制剂,其特征在于:所述的药物制剂为片剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂、糖浆剂或乳剂。
5.含有雷公藤内酯酮的提取物在制备抗血管新生药物中的应用。
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