CN111398235A - 一种基于Cu/UiO-66金属有机框架猝灭的同步荧光检测氯霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及化学传感器领域，具体涉及一种基于Cu/UiO‑66金属有机框架猝灭的同步荧光检测氯霉素的方法。其步骤为：首先将标记有荧光基团的氯霉素适配体荧光探针溶于缓冲溶液中，配置为反应液A；第二步将铜‑锆双金属有机框架材料Cu/UiO‑66均匀分散在缓冲溶液中，得到反应液B；第三步将配置好的反应液A、反应液B与适量的缓冲溶液混合得到混合液C；第四步在混合液C中加入一定量的待检测氯霉素含量的溶液，反应一段时间后通过同步荧光扫描检测其荧光强度，实现其定量检测。使用此方法实现的对氯霉素的检测方法有简单快捷、灵敏度高、特异性强、检出限低等优点。

Description

一种基于Cu/UiO-66金属有机框架猝灭的同步荧光检测氯霉 素的方法

技术领域

本发明属于化学传感器领域，具体的涉及到一种基于Cu/UiO-66金属有机框架猝灭的同步荧光检测氯霉素的方法。

背景技术

以氯霉素(Chloramphenicol,CAP)为例的一系列抗生素药物分子，具有良好的杀菌消炎作用，又因其广普适用，并且价格相对便宜，已经被广泛的应用于疾病预防与治疗、畜牧与水产养殖产业中。但长期食用含有抗生素的食物将引起儿童免疫力底下，影响肠道菌群导致营养不良，降低身体对病原体的抗性，使得部分致病菌产生抗药疾病难以治愈，严重时会导致肝肾损伤。据报道由于抗生素的滥用和误用，从而导致出现了许多药物无法治疗的“超级细菌”，最后威胁到人体健康，主要的不良反应就是抑制骨髓的造血机能，最终导致死亡。因此，开发一种可以低成本、可快速检测抗生素一类的药物分子的技术具有十分重要的意义。

现阶段已有的对于抗生素药物分子的定性定量检测方法主要有色谱法与光谱法两种，但这些方法大部分需要依靠多种仪器的联用，最终得到的数据需要进行复杂的组合计算后方可得到待测物质的种类与含量。虽然仪器联用的方法的精确度相对较高，比如现有技术中使用国标方法GB T 22338-2008中动物源性食品中氯霉素类药残留量的测定，使用气象色谱-质谱法、液相色谱质谱法对于氯霉素的检出限为0.1μg/kg，但操作过程过于繁琐，费时费力，成本也相对高昂，对操作人员的试验水平也有一定的要求。金属有机骨架(Metal-Organic Framework,MOFs)因其易于调节的结构、有序的晶态孔道和高的比表面在化学传感器领域得到了广泛地应用。基于上述研究背景，本发明以一种双金属MOFs材料为猝灭基团，结合标记有荧光基团的适配体荧光探针为平台，开发了一种高灵敏度、高选择性的对于抗生素药物分子的荧光检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于Cu/UiO-66金属有机框架猝灭的同步荧光检测CAP的方法。该方法降低了原有的检测方法的检出限，并且检测过程方便快捷，检测时间短，可实现对于CAP的高灵敏度、高选择性检测。

在本发明中，以铜-锆双金属有机框架材料Cu/UiO-66结合带有ROX荧光基团标记的适配体荧光探针构成的CAP检测传感器，来实现对CAP的高选择性、高灵敏度的检测，具体技术方案如下：

(1)由DNA合成仪合成标记有荧光基团的CAP适配体荧光探针，所使用CAP序列适配体探针序列为：5'-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA GCC C-3'，3'端接有一个ROX荧光基团，适配体荧光探针由高效液相色谱纯化；

(2)将步骤(1)制备的标记有荧光基团的CAP适配体荧光探针溶于Tris-HCl缓冲溶液中，配置成反应液A；

(3)合成铜-锆双金属有机框架材料Cu/UiO-66，依次包括以下步骤：

(a)合成UiO-66晶体：在反应釜中加入1,4-苯二甲酸和四氯化锆，然后向其中加入DMF和冰醋酸做溶剂，充分搅拌后密封反应釜，在120℃下恒温反应20-30h(优选为24h)，反应结束后离心，所得固体洗涤、真空干燥，得到UiO-66晶体；

(b)合成Cu/UiO-66晶体：向步骤(a)合成的UiO-66晶体中加入CuCl₂·2H₂O，然后向其中加入DMF为溶剂，超声分散后转移至反应釜中并密封，在85℃下恒温反应20-30h(优选为24h)，反应结束后离心、洗涤、真空干燥得到铜-锆双金属有机框架材料Cu/UiO-66；

(4)将铜-锆双金属有机框架材料Cu/UiO-66均匀分散在Tris-HCl缓冲溶液中，制备得到反应液B；

(5)将步骤(2)的反应液A与步骤(4)的反应液B进行混合，混合后的溶液中标记有荧光基团的CAP适配体荧光探针与Cu/UiO-66的比例为1mol：1.8g，混合后在室温下反应10-60min使其偶联，反应完全后得到混合液C，混合液C即为传感器Cu/UiO-66@Aptamers；

(6)取50μL的混合液C至微量比色皿中，向其中加入不同浓度的CAP标准溶液50μL，补充Tris-HCl缓冲溶液至总体积为500μL，以适配体探针3'端所连接的荧光基团ROX的斯托克斯位移30nm为基准，设定激发波长为490nm，并在520-700nm范围内进行同步荧光扫描；

以荧光染料ROX的荧光强度变化值为纵坐标，以CAP标准溶液的浓度为横坐标，得到相应的荧光强度与CAP浓度之间的工作曲线，并拟合回归方程，得到检测范围，在检测范围内设计实验，计算出方法的检测限；

(7)将步骤(6)中的CAP标准溶液换为待检测的溶液，通过同步荧光扫描所得到的荧光强度的变化值，结合步骤(6)中所得到的工作曲线及回归方程，实现对实际待测样品中CAP的定量检测。

进一步的，所述步骤(6)中CAP标准溶液的浓度为0.2-10nmol/L。

进一步的，所述步骤(5)中反应液A与反应液B的体积比为1:1。

更进一步的，反应液A中标记有荧光基团的CAP适配体荧光探针的浓度为(10-200)nmol/L，优选为200nmol/L。

进一步的，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.2mol/L、pH为6.8-8.3(优选为6.8-7.7，最优选为7.7)，更进一步的，所述Tris-HCl缓冲溶液中含有(20-100)mmol/L的NaCl，优选为含有80mmol/L的NaCl。

进一步的，所述步骤(5)中的反应时间为40-60min，最优选为40min。

进一步的，所述步骤(7)中待检测溶液中CAP的浓度为0.2-10nmol/L。

进一步的，所述步骤(1)、(2)中所述洗涤均为用DMF和丙酮依次洗涤四次。

进一步的，所述步骤(a)中1,4-苯二甲酸和四氯化锆加入的质量比为25：(20-35)，优选为25：33.4。

进一步的，所述步骤(b)中UiO-66晶体与CuCl₂·2H₂O加入的质量比为100：(80-100)，优选为100：90。

在本发明中，由于金属锆(Zr)的存在使得适配体的磷酸末端产生了强的配位作用，从而固定在纳米材料表面。其次Zr-MOF本身对于荧光基团的荧光就有一定的猝灭作用，而在本发明中在Zr-MOF的基础上还添加了铜离子(Cu²⁺)，Cu²⁺对于荧光基团也有强烈的猝灭作用，以此实现了对荧光基团的双重猝灭，适配体链端的荧光基团与MOFs材料发生荧光共振能量转移，两者之间发生了能量的转移导致荧光基团的荧光猝灭。本发明检测方法的高选择性源于适配体与其目标的特异性识别，高灵敏度来源于双金属MOF材料的高猝灭效率，高效猝灭显著提高了该方法的信背比。另外，Zr与磷酸末端的强配位作用使得探针的稳定性得以大大提升。

相对于现有技术，本发明的突出优势和特性有：

(1)高选择性。由于构建的Cu/UiO-66&Aptamers传感平台中引入了CAP的适配体结构，使得传感器对CAP具有极高的选择性，适配体可以特异性识别并折叠形成一定的空间。

(2)抗干扰力强和灵敏度高。对于ROX荧光强度的检测使用的是同步荧光分析方法，同步荧光分析可以避免瑞利散射光对荧光的干扰。通常情况下，许多荧光分子的斯托克斯位移较小，激发光(通常是最大激发波长)对荧光的测定具有一定的干扰，在测定时为了避免这种干扰，就要减小激发光的波长(使用非最大激发波长)，导致检测到荧光信号减弱。但同步荧光分析即使是荧光基团的斯托克斯位移较小，激发光也不会对荧光的测定产生干扰，因此不必减小激发波长，从而提高了灵敏度。

(3)低检测限。由于构建的Cu/UiO-66&Aptamers传感平台中适配体3'端连接的ROX基团的最大激发波长为583nm波长，最大发射波长为613nm时，在同步荧光扫描图谱上显示为在613nm处有很强的荧光信号响应，当体系中不存在CAP分子时，适配体探针以单链形式存在，被吸附于Cu/UiO-66表面，ROX基团的荧光因发生荧光共振能量转移，被铜-锆双金属有机框架材料Cu/UiO-66高效猝灭，背景峰很低。当体系中存在CAP时，适配体结构与其特异性结合，形成一定的空间结构，ROX基团远离Cu/UiO-66表面，进而产生很强的荧光信号。因为Cu/UiO-66&Aptamers传感器灵敏度高，信背比高，因此在检测CAP时的具有低的检出限。

(4)具有荧光检测方法的常见优点，如成本低、操作简单、检测时间短、荧光信号稳定、没有复杂的前处理过程等。另外本发明所设计的Cu/UiO-66&Aptamers传感器在进行定量测定时，因其良好的猝灭效果，未反应的适配体不会对信号检测产生干扰，无需将过量加入的传感器去除，降低了检测过程的复杂度。

附图说明

图1是实施例1中Cu/UiO-66样品的XRD图。

图2是实施例1中Cu/UiO-66样品的SEM图。

图3是实施例1中Cu/UiO-66样品的EDS图。

图4是实施例1中Cu/UiO-66和Cu/UiO-66&Aptamers的Zeta电位图。

图5是实施例1中Cu/UiO-66&Aptamers传感器在不同浓度的CAP溶液中的同步荧光扫描光谱，图中a-c分别代表CAP的浓度为：0、5、10(nmol/L)。

图6是实施例1中氯霉素检测的反应pH条件优化图。

图7是实施例1中氯霉素检测的反应离子强度条件优化图。

图8是实施例1中氯霉素检测的反应时间条件优化图。

图9(A)是实施例1中Cu/UiO-66&Aptamers传感器在不同浓度的CAP溶液中的同步荧光扫描光谱。

图9(B)是实施例1中Cu/UiO-66&Aptamers传感器检测CAP的线性工作曲线。

图10是实施例1中Cu/UiO-66&Aptamers传感器选择性检测图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于此。

实施例1一种基于Cu/UiO-66金属有机框架猝灭的同步荧光检测氯霉素的方法，具体步骤如下：

(1)标记有荧光基团的CAP适配体荧光探针由DNA合成仪合成，所使用CAP序列适配体探针序列为：5'-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA GCC C-3'，3'端接有一个ROX荧光基团，适配体探针由高效液相色谱纯化，并使用质谱检测其序列正确性；

(2)将步骤(1)制备的标记有荧光基团的CAP适配体荧光探针溶于浓度为0.2mol/L含有80mmol/LNaCl的pH为7.7的Tris-HCl缓冲溶液中，配置成标记有荧光基团的CAP适配体荧光探针浓度为2×10^-7mol/L的反应液A；

(3)Cu/UiO-66按照以下过程合成：

首先合成UiO-66晶体：在25mL反应釜中加入1,4-苯二甲酸(25mg)和四氯化锆(33.4mg)，并向其中加入DMF(10mL)和冰醋酸(0.7mL)做溶剂，充分搅拌后密封反应釜，在120℃下恒温反应24h。反应结束后转移至离心管以10000r/min高速离心5min后，所得固体用DMF和丙酮依次各洗涤四次，然后在60℃真空干燥12小时，得到UiO-66晶体。

其次合成Cu/UiO-66晶体：向先前合成的UiO-66晶体(100mg)中加入CuCl₂·2H₂O(90mg)，然后向其中加入DMF(9mL)为溶剂，然后超声处理一分钟使混合物分散均匀，超声处理后将材料转移至25mL反应釜中并密封，在85℃下恒温反应24h。反应结束后转移至离心管10000r/min高速离心5min获得晶体，并用DMF和丙酮各依次洗涤四次，然后在60℃真空干燥12小时得到铜-锆双金属有机框架材料Cu/UiO-66；

对制备的Cu/UiO-66样品进行XRD测试、SEM形貌分析以及EDS元素分析，分别如图1-图3所示。XRD图显示所合成的材料具有良好的晶体结构，合成晶体纳米材料为Cu/Zr-MOF材料，SEM图显示晶体形状为UiO-66所有的八面体结构，且结构均匀，图3所示表面的颗粒为所连接的金属元素铜；

(4)将步骤(3)制备的铜-锆双金属有机框架材料Cu/UiO-66均匀分散于浓度为0.2mol/L含有80mmol/LNaCl的pH为7.7的Tris-HCl缓冲溶液中，超声分散20min得到Cu/UiO-66浓度为360μg/mL的反应液B；

(5)在体积比为1:1的条件下将步骤(2)的反应液A与步骤(4)的反应液B混合，室温下反应2h使其偶联，反应后得到混合液C(即：Cu/UiO-66&Aptamers)。对反应液B和混合液C使用Zeta电位测定，结果如图4所示，Zeta电位从-7.27mV降至-11.6mV，电位的降低是由于带负电荷的DNA适配体与纳米材料发生了偶联，表明纳米粒子与适配体已经形成了功能结构Cu/UiO-66&Aptamers传感器。

(6)取50μL的混合液C至微量比色皿中，分别向其中加入不同浓度的CAP标准溶液50μL，并补充浓度为0.2mol/L、含有80mmol/LNaCl的pH为7.7的Tris-HCl缓冲溶液，室温下反应40min，以适配体探针3'端所连接的荧光基团ROX的斯托克斯位移差值30nm为基准，设定激发波长为490nm，并在520-700nm范围内进行同步荧光强度扫描，结果如图5所示，其中ΔF为加入CAP后和加入CAP前的Cu/UiO-66&Aptamers传感器的荧光强度差值，可以看出，传感器对不同浓度的CAP有较好的响应，并且荧光信号强度有明显的差异，图中a-c分别代表CAP的浓度为：0、5、10(nmol/L)。

探究实验一：

为探究最佳的反应条件，重复上述步骤(1)到步骤(6)，不同的是：固定步骤(6)加入的CAP浓度为10nmol/L，考量步骤(6)中不同pH值的Tris-HCl缓冲溶液对荧光强度的影响，结果如图6所示，荧光强度随Tris-HCl缓冲溶液pH值从6.8到7.7的增大而增强，在7.7到8.3时，荧光强度缓慢下降，因此实验最佳的pH值为7.7。

探究实验二：

阳离子可以中和适配体的表面电荷，降低其静电斥力，同时阳离子盐的加入会有利于适配体与氯霉素之间形成特殊的空间结构，因此研究了离子强度(缓冲溶液中NaCl的浓度)与荧光强度之间的关系，重复上述步骤(1)到步骤(6)，不同的是：固定步骤(6)中加入的CAP浓度为10nmol/L，同时将所有步骤中所用的Tris-HCl缓冲溶液中NaCl浓度分别变更为0、5、10、20、40、60、80、100mmol/L，结果如图7所示，可以看出随着NaCl浓度从0增加到80mmol/L，荧光强度逐渐增大，当NaCl浓度大于80mmol/L时，体系的荧光强度保持稳定，因此实验的最佳的离子强度为80mmol/L。

探究实验三：

为考察步骤(6)中传感器与氯霉素反应时间的长短对体系荧光强度的影响，固定步骤(6)中加入的CAP浓度为10nmol/L，在10-60min范围内优化反应时间，结果如图8所示，可以看出，10-40min反应时间下，随着反应时间增加，荧光强度逐渐增加，反应时间在40-60min时，荧光强度趋于平稳，说明反应在40min内基本反应完全，因此实验最佳的反应时间为40min。

探究实验四：

重复上述步骤(1)到步骤(6)，并按照优化后的最佳反应条件对CAP进行同步荧光强度扫描，不同的是：步骤(6)中的CAP浓度分别为0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、4.8、6.4、8.0、10(nmol/L)，结果如图9A曲线a-j所示，图中a-j分别代表CAP的浓度分别为0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、4.8、6.4、8.0、10(nmol/L)，可以看出传感器在优化条件下可以对0.2-10nmol/L浓度范围内的CAP进行检测。

以Cu/UiO-66&Aptamers传感器的荧光强度变化值与其对应的CAP浓度值为纵、横坐标轴，得到相应的荧光强度与浓度之间的回归方程为ΔF＝91.056C+5.537(如图9B所示)，其中ΔF为加入CAP后和加入CAP前的Cu/UiO-66&Aptamers传感器的荧光强度差值，C为CAP的浓度，单位为nmol/L。根据工作曲线的斜率和11次空白样品测量的相对标准偏差(RSD)计算得到检出限为0.09nmol/L。

探究实验五：

为了考察检测方法在存在不同抗生素药物时的选择性，重复上述步骤(1)到步骤(6)，不同的是：步骤(6)中加入的每次检测加入的抗生素药物分别为氯霉素和结构与其相似的卡那霉素、甲砜霉素、土霉素、四环素、链霉素这几种抗生素进行验证，加入的氯霉素浓度为10nmol/L，其他抗生素浓度均为0.1mmol/L，反应液A中标记有荧光基团的CAP适配体荧光探针的浓度为10nmol/L，结果如图10所示，只有体系中存在氯霉素时，传感器才恢复了荧光信号，并且信号强度远高于其他抗生素药物体系，这表明即使检测体系中存在其他高浓度的抗生素时，也不会对传感器对于氯霉素的检测产生干扰，因此传感器具有高度的选择性和灵敏度。

实施例2一种基于Cu/UiO-66金属有机框架猝灭的同步荧光检测氯霉素的方法，具体步骤如下：

对于实际样品的测定，先将实际样品进行均质化，鱼类样品由食品药品监督管理中心提供，并证实为完全不含氯霉素的鱼肉样品。然后将不同浓度的氯霉素标准溶液分别加入等量(5g)的鱼肉样品中，并进行均匀化，然后，具体步骤如下：

将均匀化后的鱼肉样品分别粉碎成鱼糜，并与10mL乙酸乙酯混合，然后以5000r/min离心5min后收集上清液。接着向残余物中再次加入10mL乙酸乙酯进行均质化，重复两次，将收集的所有上清液转移至小瓶中，使用氮气吹干，然后用含有10v/v％甲醇、80mmol/LNaCl的浓度为0.2mol/L、pH为7.7的Tris-HCl缓冲液进行分散至100mL，待测。检测过程重复实施例1的步骤(1)-(6)的操作，不同的是：将步骤(6)中加入的CAP溶液替换为50μL待测样品溶液，通过同步荧光检测实现对CAP的定性检测，并通过同步荧光扫描所得到的荧光强度的变化值，结合实施例1探究实验四中所得到的工作曲线及回归方程，实现对实际样品中CAP的定量检测。

鱼肉样品的加标回收率在96.45％-103.9％之间(表1)，证明本发明的技术方案可靠，可用于实际样品中微量的CAP的含量检测。

表1实际样品中氯霉素含量的测定及加标回收实验

Claims (8)

1.一种基于Cu/UiO-66金属有机框架猝灭的同步荧光检测氯霉素的方法，其步骤如下：

（1）由DNA合成仪合成标记有荧光基团的CAP适配体荧光探针，所使用CAP序列适配体探针序列为：5'-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA GCC C-3'，3'端接有一个ROX荧光基团，适配体荧光探针由高效液相色谱纯化；

（2）将步骤（1）制备的标记有荧光基团的CAP适配体荧光探针溶于Tris-HCl缓冲溶液中，配置成反应液A；

（3）合成铜-锆双金属有机框架材料Cu/UiO-66，依次包括以下步骤：

（a）合成UiO-66晶体：在反应釜中加入1,4-苯二甲酸和四氯化锆，然后向其中加入DMF和冰醋酸做溶剂，充分搅拌后密封反应釜，在120℃下恒温反应20-30 h，反应结束后离心，所得固体洗涤、真空干燥，得到UiO-66晶体；

（b）合成Cu/UiO-66晶体：向步骤（a）合成的UiO-66晶体中加入CuCl₂·2H₂O，然后向其中加入DMF为溶剂，超声分散后转移至反应釜中并密封，在85℃下恒温反应20-30 h，反应结束后离心、洗涤、真空干燥得到铜-锆双金属有机框架材料Cu/UiO-66；

（4）将铜-锆双金属有机框架材料Cu/UiO-66均匀分散在Tris-HCl缓冲溶液中，制备得到反应液B；

（5）将步骤（2）的反应液A与步骤（4）的反应液B进行混合，混合后的溶液中标记有荧光基团的CAP适配体荧光探针与Cu/UiO-66的比例为1 mol：1.8 g，混合后在室温下反应10-60min使其偶联，反应完全后得到混合液C，混合液C即为传感器Cu/UiO-66@Aptamers；

（6）取50 μL的混合液C至微量比色皿中，向其中加入不同浓度的CAP标准溶液50 μL，补充Tris-HCl缓冲溶液至总体积为500 μL，以适配体探针3' 端所连接的荧光基团ROX的斯托克斯位移30 nm为基准，设定激发波长为490 nm，并在520-700 nm范围内进行同步荧光扫描；

以荧光染料ROX的荧光强度变化值为纵坐标，以CAP标准溶液的浓度为横坐标，得到相应的荧光强度与CAP浓度之间的工作曲线，并拟合回归方程；

（7）将步骤（6）中的CAP标准溶液换为待检测的溶液，通过同步荧光扫描所得到的荧光强度的变化值，结合步骤（6）中所得到的工作曲线及回归方程，实现对实际样品中CAP的定量检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中反应液A与反应液B的体积比为1:1。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，反应液A中标记有荧光基团的CAP适配体荧光探针的浓度为（10-200）nmol/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.2 mol/L、pH为6.8-8.3。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲溶液中含有（20-100）mmol/L的NaCl。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中的反应时间为40 min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（a）中1,4-苯二甲酸和四氯化锆加入的质量比为25：（20-35）。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（b）中UiO-66晶体与CuCl₂·2H₂O加入的质量比为100 ：（80-100）。

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