CN111394465A - 结直肠癌奥沙利铂耐药相关的lncRNA的筛选及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及结直肠癌奥沙利铂耐药相关的lncRNA的筛选及应用，采用逐渐提高结直肠癌细胞株中奥沙利铂终浓度的方式成功诱导了结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR和HCT116/OxR。本发明对结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株中耐药相关的lncRNA的筛选及应用进行了研究，通过qRT‑PCR检测发现lncRNA LINC00460和RP11‑260A9.6在SW480/OxR细胞株中高表达。本发明采用特异性siRNA沉默SW480/OxR细胞中的LINC00460，在奥沙利铂处理下，LINC00460的下调对细胞生长呈现剂量依赖和时间依赖的抑制作用，恢复了SW480/OxR细胞对奥沙利铂的敏感性，为解决肿瘤耐药性问题提供了新的思路和方案。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及结直肠癌奥沙利铂耐药相关的lncRNA的筛选及应用。
背景技术
结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，也是我国癌症相关死亡的主要原因，结直肠癌高发于50岁以上人群，其中发病率男性高于女性，并且随着年龄的增长发病率和死亡率逐渐升高。早期结直肠癌无明显症状，一般难以诊断，60-70％的确诊病例是在疾病的晚期被发现的。临床上结直肠癌的治疗以手术和化疗为主，其中，奥沙利铂是治疗结直肠癌最有效的一线化疗药物之一，并且是第一种被批准用于结直肠癌治疗的铂类药物；然而，多数患者中奥沙利铂单独或联合用药的固有或获得性耐药导致了治疗失败，几乎所有转移性结直肠癌最终都会产生奥沙利铂耐药性。
目前针对结直肠癌的筛查方法主要分为非侵入性和侵入性检测，每种方法都存在特定的优缺点。如粪便潜血试验和粪便免疫化学试验对发现肿瘤前病变的敏感性低，假阳性率高；而结肠镜和软性乙状结肠镜属于侵入性诊断技术，并且依从率低。因此，有必要发展新的具有高敏感性和特异性的非侵入性生物标志物，以帮助结直肠癌的早期诊断和治疗。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200bp的调控型非编码RNA，通常没有蛋白质编码功能或具有较低的蛋白质编码潜力。目前已发现lncRNAs是分化、发育和疾病的新兴调节因子，通过与DNA、RNA和蛋白质的相互作用，参与转录和转录后水平的基因表达调控。LncRNA的功能具有多样性，研究发现，lncRNA与肿瘤耐药相关，具有肿瘤抑制或致癌功能，可驱动细胞增殖、迁移或基因组不稳定等多种重要的癌症表型。目前，多数lncRNA的研究工作仍处于功能鉴定阶段，进一步了解lncRNA在肿瘤学，尤其是肿瘤耐药性中的相关作用具有重大意义。
发明内容
本发明要解决的一个技术问题是提供结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR和HCT116/OxR诱导后差异表达lncRNA的筛选。
本发明要解决的另一个技术问题是提供lncRNA在结直肠癌奥沙利铂耐药中的应用，所述lncRNA为LINC00460和RP11-260A9.6，一种代表性的转录LINC00460基因的核苷酸序列如ENST00000444865.2所示，一种代表性的转录RP11-260A9.6基因的核苷酸序列如ENST00000580686.1所示。
为弥补上述现有技术的不足，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供一种由结直肠癌细胞株SW480和HCT116诱导为结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR和HCT116/OxR的方法。
进一步，采用CCK-8实验分析SW480、HCT116、SW480/OxR和HCT116/OxR结直肠癌细胞株在奥沙利铂处理下的生存曲线。
更进一步，根据CCK-8实验分析SW480、HCT116、SW480/OxR和HCT116/OxR结直肠癌细胞株对奥沙利铂的IC50值，确定上述4种细胞株的奥沙利铂耐药性差异。
本发明的第二方面提供一种结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR和HCT116/OxR相对于正常结直肠癌细胞株SW480和HCT116中化疗耐药相关的差异表达lncRNA的筛选方法。
进一步，通过qRT-PCR检测SW480、HCT116、SW480/OxR和HCT116/OxR结直肠癌细胞株中化疗耐药相关的lncRNA表达量。
更进一步，qRT-PCR检测上述lncRNA采用特异性的PCR扩增引物，所述引物序列信息如SEQ ID NO.1-26所示。
再进一步，qRT-PCR检测在结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR中发现差异表达显著的2种lncRNA，所述lncRNA为LINC00460和RP11-260A9.6。
本发明的第三方面提供lncRNA在结直肠癌奥沙利铂耐药中的应用，采用针对上述lncRNA LINC00460和RP11-260A9.6的特异性siRNA沉默结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR中LINC00460和RP11-260A9.6的表达。
进一步，所述LINC00460和RP11-260A9.6的特异性siRNA的序列信息如SEQ IDNO.27-28所示。
更进一步，通过CCK-8分析发现结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR在奥沙利铂处理下，LINC00460的下调对细胞生长表现出剂量依赖和时间依赖的抑制作用，即LINC00460下调后SW480/OxR细胞株恢复对奥沙利铂的敏感性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明提供由结直肠癌细胞株SW480和HCT116诱导为结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR和HCT116/OxR的研究肿瘤耐药性的细胞模型。
2、本发明通过qRT-PCR检测在结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR中发现差异表达显著的2种lncRNA LINC00460和RP11-260A9.6。
3、本发明提供lncRNA在结直肠癌奥沙利铂耐药中的应用，通过CCK-8分析发现在奥沙利铂处理下，结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR中lncRNA LINC00460的沉默对细胞生长表现出剂量依赖和时间依赖的抑制作用，即LINC00460基因沉默使得SW480/OxR细胞株恢复对奥沙利铂的敏感性。
附图说明
图1为本发明实施例1中由结直肠癌细胞株SW480和HCT116诱导为结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR和HCT116/OxR的细胞模型示意图。
图2为本发明实施例2中CCK-8实验分析SW480、HCT116、SW480/OxR和HCT116/OxR结直肠癌细胞株的生存曲线图(图2A)，以及根据CCK-8实验分析SW480、HCT116、SW480/OxR和HCT116/OxR结直肠癌细胞株对奥沙利铂的IC50柱状图(图2B)。
图3为本发明实施例3中结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR和HCT116/OxR相对于正常结直肠癌细胞株SW480和HCT116中化疗耐药相关lncRNA的差异表达。
图4为本发明实施例4中采用特异性的siRNA分别沉默lncRNA LINC00460(图4A)和RP11-260A9.6(图4B)的qRT-PCR检测结果图，并通过CCK-8分析发现在奥沙利铂处理下，结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR中LINC00460的下调对细胞生长呈现剂量依赖(图4C)和时间依赖(图4D)的抑制作用。
具体实施方式
下面为结合具体实施例和附图对本发明技术内容的进一步阐述，本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述。如未作特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
统计学分析
本发明的具体实施例中，所有结果均来自至少3次独立重复实验，所得数据以平均值±标准差表示，采用GraphPad Prism V5.0软件进行统计分析，并使用Student’s t-test(双尾法)分析两组之间的统计差异，P＜0.05被认为具有统计学意义，*P＜0.05，**P＜0.01。
实施例1
结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株的诱导
1、SW480和HCT116细胞株的细胞培养及传代
(1)细胞培养：SW480和HCT116细胞株购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所，使用RPMI 1640培养基(10％胎牛血清，100U/ml青霉素和链霉素)，在温度为37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中进行细胞培养。
(2)细胞传代：SW480和HCT116均为贴壁生长型细胞，当贴壁生长细胞密度达80-90％时进行传代，倒掉原细胞培养液，使用PBS润洗细胞后吸除细胞表明液体，加入适量37℃下预热的胰酶，置于37℃的细胞培养箱中消化1-3min，轻拍培养皿侧壁至细胞脱落，立即加入适量上述细胞培养基终止消化，使用移液枪将细胞吹打混匀，转移至15ml离心管中，常温下800g离心3min，吸除上清液，使用上述细胞培养基重悬细胞，并转移至新的细胞培养皿中进行细胞培养。
2、SW480/OxR和HCT116/OxR细胞株的诱导
结合图1所示，结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株是由结直肠癌细胞株SW480和HCT116诱导而来，并命名为SW480/OxR和HCT116/OxR。具体步骤如下：
将SW480和HCT116细胞培养至P2代后，在细胞对数生长期时开始加入起始终浓度为1μM的奥沙利铂，48h后，换液为新鲜的不含药物的细胞培养基，换液72h后细胞基本又重新长满，此时我们进行细胞传代，并在其达到对数生长期时加入终浓度为2μM的奥沙利铂，重复上述操作并逐渐提高细胞培养液中奥沙利铂的终浓度(1-10μM)，最终得到了可以在终浓度为10μM的奥沙利铂下稳定生长的耐药细胞株。
为保持耐药性，在细胞培养基中加入终浓度为2μM的奥沙利铂，在实验前一个月停止添加奥沙利铂。诱导后的细胞可以进行细胞冻存，冻存液为含90％胎牛血清的RPMI 1640培养基，或用于后续细胞实验，诱导成功的SW480/OxR和HCT116/OxR细胞株可以在复苏后的10代以内使用。
实施例2
SW480/OxR和HCT116/OxR细胞株奥沙利铂耐药性的测定
1、奥沙利铂处理下SW480、HCT116、SW480/OxR和HCT116/OxR细胞的生存曲线分析
结合图2A所示，将SW480、HCT116、SW480/OxR和HCT116/OxR细胞以1×104/孔的密度铺板于96孔板，并设置奥沙利铂浓度梯度处理组(0/1/2/4/8/16/32/64/128μM)，每个实验组设置3个复孔。细胞铺板12h后，细胞已完全贴壁，使用吸泵吸除96孔板中的培养液，按照上述浓度梯度加入含奥沙利铂的细胞培养液，每孔100μl。加药处理48h后，避光条件下配制CCK-8工作液(含10％CCK-8原液的RPMI 1640培养基)，使用吸泵吸除96孔板中的培养液，并加入配制好的CCK-8工作液，每孔100μl，置于37℃的细胞培养箱中孵育1h后，使用酶标仪测定450nm波长下的OD值。
每种细胞按照细胞存活率＝[(测试孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)]×100％，计算得到每个浓度对应的细胞存活率。采用GraphPad Prism V5.0软件进行统计分析得到奥沙利铂处理下SW480、HCT116、SW480/OxR和HCT116/OxR细胞的生存曲线。结果显示SW480、HCT116、SW480/OxR和HCT116/OxR细胞的细胞存活率随着奥沙利铂终浓度的增加而下降，并且相同奥沙利铂终浓度下，SW480/OxR和HCT116/OxR细胞的细胞存活率显著低于SW480和HCT116细胞。
2、SW480、HCT116、SW480/OxR和HCT116/OxR细胞对奥沙利铂的IC50
结合图2B所示，根据上述CCK-8实验得到的奥沙利铂处理下SW480、HCT116、SW480/OxR和HCT116/OxR细胞的OD450值，按照抑制率＝[1-(测试孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)]×100％，计算得到每个浓度对应的抑制率。通过GraphPad Prism V5.0软件分析得到SW480、HCT116、SW480/OxR和HCT116/OxR细胞对奥沙利铂的IC50值，并作IC50值的柱状分析图。结果显示SW480/OxR和HCT116/OxR细胞对奥沙利铂的IC50值显著高于SW480和HCT116细胞。
结果表明：SW480/OxR和HCT116/OxR细胞对奥沙利铂有明显的耐药性，结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株诱导成功。
实施例3
结直肠癌奥沙利铂耐药及非耐药细胞株中耐药相关lncRNA的差异表达
1、SW480、HCT116、SW480/OxR和HCT116/OxR细胞的总RNA提取
A、收集细胞于1.5ml EP管(RNase-free)中，4℃下，800g离心3min；
B、吸除上清液，每管加入1ml预冷的PBS，使用移液枪将细胞吹打混匀，4℃下，800g离心3min；
C、吸除上清液，每管加入1ml TRIZOL，使用移液枪吹打混匀，室温下孵育5min；
D、每管加入200μl氯仿(体积为TRIZOL体积的1/5)，使用涡旋仪涡旋混匀至液体为粉白色，室温下孵育5min；
E、4℃下，16000g离心20min，离心后，溶液共分为三层，分别为水相、有机相和中间层；
F、RNA溶于水相，使用移液枪小心将最上层的透明上清液转移至新的1.5ml EP管中，注意枪头不要碰到中间层，一般可以吸出500μl的上清液；
G、加入500μl(与上清液等体积)异丙醇，颠倒混匀后，置于-20℃冰箱沉淀过夜；
H、取出EP管，4℃下，16000g离心20min，可以看到EP管底有白色的RNA沉淀；
I、吸除上清液，缓慢向EP管中加入1ml的75％DEPC水配制的乙醇溶液，轻轻将RNA沉淀吹起，但不要吹散；
J、4℃下，16000g离心20min，吸除上清液，在通风橱中将EP管倒扣于干净的吸水纸上，晾置5min；
K、用适量DEPC水溶解RNA沉淀，涡旋仪轻轻涡旋混匀，使用Nanodrop测定RNA浓度及纯度；
L、RNA样品保存于-80℃，或直接用于后续qRT-PCR检测。
2、引物的设计及序列信息
本发明中所有的PCR引物均使用Primer 5.0软件进行设计，并交由南京金斯瑞生物科技完成引物合成，引物序列信息如表1所示。
表1引物序列信息
3、qRT-PCR检测
(1)逆转录反应
lncRNA和mRNA逆转录反应体系如表2和表3所示：
表2 lncRNA逆转录反应体系
表3 mRNA逆转录反应体系
其中，lncRNA在进行逆转录前，需要与Oligo(dT)、Random Primer(N9)及适量的DEPC水混匀，在70℃下加热10min以破坏其二级结构后，再与母液混合进行下述逆转录反应。
lncRNA或mRNA逆转录反应程序如表4所示：
表4 lncRNA或mRNA的逆转录反应程序
逆转录后的样品可保存于-20℃或进行后续的qRT-PCR实验。
(2)qRT-PCR反应
lncRNA或mRNA的qRT-PCR反应体系如表5所示：
表5 lncRNA或mRNA的qRT-PCR反应体系
lncRNA或mRNA的qRT-PCR反应程序如表6所示：
表6 lncRNA或mRNA的qRT-PCR反应程序
结合图3所示，qRT-PCR实验中所有反应均为一式三份，反应结束后，依据扩增曲线选取合适的阈值以得到每个复孔的Ct值，将lncRNA的表达水平相对于GAPDH mRNA进行归一化处理，随后作SW480/OxR和HCT116/OxR细胞中化疗耐药相关的lncRNA相对于SW480和HCT116细胞的相对表达水平柱状图。
结果表明：lncRNALINC00460和RP11-260A2.6在SW480/OxR细胞株中显著高表达。
实施例4
沉默LINC00460和RP11-260A9.6对SW480/OxR中奥沙利铂耐药性的影响
1、siRNA的设计与序列信息
本发明中所使用的siRNA由广州锐博生物科技设计并合成，siRNA序列信息如表7所示。
表7 siRNA序列信息
2、细胞转染
细胞转染步骤如下：
A、在转染前一天，将细胞接种于6孔板中，24h后贴壁细胞密度至70-80％；
B、用适量的opti-MEM培养基稀释si-LINC00460、si-RP11-260A9.6、ncRNA(100pmol/孔)以及Lipofectamine 2000(5μl/孔)，移液枪吹打混匀，室温下孵育15min；
C、将6孔板从细胞培养箱中取出，吸除原细胞培养液，PBS润洗细胞表面后吸除细胞表面液体；
D、将上述孵育好的转染工作液加入6孔板中，使用opti-MEM补齐体积至2ml/孔，轻轻摇匀后，置于37℃细胞培养箱中进行细胞转染；
E、转染4-6h后，吸除原培养液，更换为新的含血清RPMI 1640培养基或进行下一步实验处理。
F、换液后24h，如实施例3所述提取细胞总RNA。
3、SW480/OxR细胞中LINC00460和RP11-260A9.6的有效沉默
在SW480/OxR细胞中进行上述细胞转染操作后，如实施例3所述使用qRT-PCR检测SW480/OxR细胞中LINC00460和RP11-260A9.6的基因沉默情况。
结合图4A-B所示，相对于ctrl和ncRNA处理组，SW480/OxR细胞中转染si-LINC00460(图4A)和si-RP11-260A9.6(图4B)后，LINC00460和RP11-260A9.6的表达水平显著下调。
结果表明：si-LINC00460和si-RP11-260A9.6可以显著抑制SW480/OxR细胞中LINC00460和RP11-260A9.6的表达。
4、沉默LINC00460和RP11-260A9.6后对SW480/OxR细胞的影响
结合图4C-D所示，在SW480/OxR细胞中以细胞转染的方式沉默LINC00460和RP11-260A9.6后，采用CCK-8实验分析相对细胞活性，具体步骤如下：
A、如前所述进行细胞转染操作，转染4-6h后，消化并收集细胞于1.5ml EP管，室温下800g离心3min，吸除上清液，每管加入1ml新的含血清RPMI 1640培养基重悬细胞；
B、取10μl细胞悬液，并使用血细胞计数板进行细胞计数；
C、当检测不同浓度奥沙利铂(0/10/20/35/50μM)处理下的细胞活力时，将上述转染处理后的SW480/OxR细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板中，置于37℃细胞培养箱中培养48h；
D、当检测不同时间点20μM奥沙利铂处理下的细胞活力时，将上述转染处理后的SW480/OxR细胞以5×103/孔的密度接种于96孔板中，置于37℃细胞培养箱中分别培养0/24/48/72h；
E、取出上述步骤C和D中的96孔板，避光条件下配制CCK-8工作液(含10％CCK-8原液的RPMI 1640培养基)，使用吸泵吸除96孔板中的培养液，并加入配制好的CCK-8工作液，每孔100μl；
F、置于37℃的细胞培养箱中孵育1h后，使用酶标仪测定450nm波长下的OD值。
结果表明：在奥沙利铂处理下，SW480/OxR细胞中LINC00460的下调对细胞生长呈现剂量依赖(图4C)和时间依赖(图4D)的抑制作用，即LINC00460基因沉默使得SW480/OxR细胞恢复对奥沙利铂的敏感性，但SW480/OxR细胞中RP11-260A9.6基因沉默后没有观察到明显的作用。
Claims (9)
1.结直肠癌奥沙利铂耐药相关的lncRNA的筛选，其特征在于，通过结直肠癌细胞株SW480和HCT116诱导为结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR和HCT116/OxR，达到构建耐药细胞株模型后筛选耐药相关lncRNA的目的。
2.根据权利要求书1所述的耐药细胞株模型，其特征在于，采用逐渐提高SW480和HCT116细胞培养液中奥沙利铂终浓度的方法，实现结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR和HCT116/OxR的诱导。
3.根据权利要求书3所述耐药细胞株的诱导，奥沙利铂处理浓度为1-10μM。
4.根据权利要求书1所述的筛选，通过qRT-PCR检测筛选出lncRNA LINC00460和RP11-260A9.6在结直肠癌奥沙利铂耐药细胞株SW480/OxR中高表达。
5.根据权利要求书4所述lncRNA的qRT-PCR检测，将lncRNA与Oligo(dT)、RandomPrimer(N9)及适量的DEPC水混匀，在70℃下加热10min以破坏其二级结构后，再进行逆转录反应程序。
6.结直肠癌奥沙利铂耐药相关的lncRNA的应用，其特征在于，采用特异性的siRNA沉默SW480/OxR细胞中的LINC00460和RP11-260A9.6，达到下调SW480/OxR细胞中LINC00460和RP11-260A9.6的目的。
7.根据权利要求书6所述的应用，通过CCK-8实验分析发现在奥沙利铂处理下，LINC00460下调对SW480/OxR细胞生长呈现剂量依赖和时间依赖的抑制作用。
8.根据权利要求书7所述的抑制作用，采用CCK-8实验检测不同奥沙利铂浓度处理下LINC00460下调对SW480/OxR细胞生长的作用时，奥沙利铂浓度梯度为0/10/20/35/50μM，处理时间为48h。
9.根据权利要求书7所述的抑制作用，采用CCK-8实验检测奥沙利铂处理下LINC00460下调对SW480/OxR细胞生长在不同时间点的作用时，奥沙利铂浓度为20μM，处理时间为0/24/48/72h。
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