CN111388660B - 美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于海水养殖病害防控技术领域，具体涉及一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗及其制备方法。1.通过筛选存在致病力和免疫原差异的两株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株，分别进行全菌灭活后添加枸杞多糖混合制成。本发明对海水鱼类的免疫保护效果突出，可有效防控对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的感染。

Description

美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于海水养殖病害防控技术领域，具体涉及一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗及其制备方法。
背景技术：
美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae)是弧菌科发光杆菌属细菌美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的一个亚种，由美国科学家Love等人首次报道于1981年的Science杂志，分离自患皮肤溃疡病的雀鲷科鱼类Chromis punctipinnis皮肤病灶处。随后，世界各地陆续有美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染鱼类、甲壳类、软体动物、海龟等不同海洋动物发病的案例。此外，该菌还可以感染鲸豚类等海洋哺乳动物发病，对人类也具有极强的致病力，可以感染人类导致严重的筋膜炎或败血症而死亡，是一种少见的分布于海洋环境中的人鱼共患病原。
到目前为止，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种在我国感染海水养殖动物发病的报道相对比较少见，因此也被认为是我国海水养殖近几年的新发病原之一。但从最新的流行病学调查显示，该菌可以感染卵形鲳鲹、石斑鱼、大菱鲆、半滑舌鳎、许氏平鲉等南北方的多种海水养殖鱼类，流行面积有不断扩大的趋势，对我国的海水养殖渔业生产安全构成了重大威胁。近五年来，本研究团队针对该菌进行了持续性的流行病学调查，在我国山东、河北、江苏、海南等地收集了30余株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株。病原学的研究结果表明，这些菌株不仅生理生化指标、抗生素药物敏感性、溶血特性等生理生化表型特征存在较明显的差异，对鱼类的致病力也存在着极为明显的差异。同时，初步的免疫研究结果也发现，不同致病力菌株的鸡源抗体相互之间不发生玻片凝集反应，证明不同美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株之间存在着免疫原差异性。
目前，防控鱼类疾病效率高、成本低的技术途径，依然是制备疫苗进行免疫预防。防控，仍然是应对。从前期的流行病学调查结果中已经可以确定，PDD常年、高丰度的分布于我国多地的养殖海域中，但菌株免疫原存在差异性。因此，运用美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的不同菌株制备多价的全菌灭活疫苗，对有效防控该菌具有重要的意义。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是针对不同的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株存在致病力和免疫原差异性，提供一种多价的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活疫苗，它是由经过筛选的、不同的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株灭活后添加枸杞多糖制备而成，可以为养殖生产中防控不同株型美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的感染提供保障技术。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，通过筛选存在致病力和免疫原差异的两株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株，分别进行全菌灭活后添加枸杞多糖混合制成。
进一步，所述的两株致病力和免疫原差异菌株分别是保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为：CGMCC No.19466(保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年3月12日)的无致病力菌株(Photobacterium.damselae subsp.damselae)存活菌株Pdd0909；以及保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为：CGMCC No.19467(保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年3月12日)的强致病力菌株(Photobacterium.damselae subsp.damselae)存活菌株Pdd1605。
进一步，这两株菌的全菌灭活方式是通过以下方法实现的：
(1)活化菌株；
(2)挑选单克隆菌落，培养种子液；
(3)制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株发酵液；
(4)离心后去除上清液，然后对菌体进行重悬，然后灭活；
(5)再次离心后去除上清液收集菌体，调整浓度，得到全菌灭活菌液；
(6)各取两株菌检验合格的灭活菌液，混合后制备成人鱼发光杆菌美人鱼亚种的多价灭活菌液；
(7)取纯品枸杞多糖溶解，得到枸杞多糖溶液；
(8)将(6)中的多价灭活菌液、(7)中的枸杞多糖溶液和缓冲液混合，并震荡均匀，最终制得美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活疫苗。
进一步的，检验菌落是否合格的方法如下：吸取制好的灭活菌液100μl涂布于TSB琼脂培养基在28℃培养24h，进行三次平行实验，检验灭活效果，若无菌落长出，证明灭活菌液合格。
进一步的，步骤(1)活化菌种的培养条件为从-80℃保存的菌种盒中活化两株菌的菌种，在28℃的条件下，用TSB琼脂平板培养基单菌落纯化培养3次，每次培养时间为20-22h；不低于20h，不超过24h；步骤(2)培养种子液的条件为从TSB琼脂平板培养基上挑选纯化好的一个单克隆菌落，接种至5ml TSB液体培养基中，在28℃、180rpm震荡条件下，培养10-12h，作为种子液。
进一步的，步骤(3)发酵的具体操作为：吸取300ul上述培养好的种子液转接至500ml TSB液体培养基种，在28℃、180rpm震荡条件下，培养16-20h；吸取5ml进行梯度稀释测定吸光值(OD 600)，按照Y＝(0.6518X-0.0158)×10 9cfu/ml公式计算发酵液中活菌浓度值，公式中X为OD 600的数值，Y为发酵液活菌浓度，OD 600取值仅在0.2～0.8范围内有效。当菌液浓度达到10 9cfu/ml或以上时，停止发酵，制成美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株发酵液。
进一步的，步骤(4)灭活的具体操作为：用两个50ml的离心管，在8000rpm条件下离心5min后倒去上清液，分5次将制备好的500ml发酵液中的菌体收集至两个离心管中；收集完毕后，分别在两个离心管中各加入40ml的1.5％无菌NaCl溶液，对菌体进行重悬，并将两个离心管中的重悬菌液转移至一个高温灭菌的250ml锥形瓶中，补充20ml的1.5％无菌NaCl溶液至总体积为100ml，再加入0.5ml甲醛使其浓度达到0.5％，然后在4℃、90rpm灭活48h。
进一步的，步骤(5)的具体操作为：将灭活完成菌液在8000rpm条件下离心5min后倒去上清液，收集菌体。依据(2-3)计算的菌液浓度值和体积倍比关系，加入适量的体积0.2％甲醛溶液，最终调整灭活菌液浓度为2.0～4.0×10 10cfu/ml，分别制得两株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的全菌灭活菌液，存放于4℃备用。
进一步的，步骤(6)具体为各取1ml两株菌检验合格的灭活菌液，混合后制备成2ml的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的多价灭活菌液，存放于4℃备用；步骤(7)具体为取纯品枸杞多糖400mg，溶解于20ml的PBS缓冲液中(PH＝7.2)，在105℃灭菌30min后，自然冷却制得20mg/ml的枸杞多糖溶液。
进一步，步骤(8)为将上述2ml的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活菌液、10ml的枸杞多糖溶液和8ml的无菌PBS缓冲液(PH＝7.2)进行混合，并震荡均匀，最终制得美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活疫苗。
一种利用上述方法制备的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗，一次接种84天后对鱼类的免疫保护率仍能够达到80％以上，免疫保护效果突出，可实现对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染的有效预防。
本发明的有益效果在于：
1.通过申请人前期的研究发现，不同致病力美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株的免疫原性是存在显著差异的。现有的文献报道也证实，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种致病力的强弱是由菌株是否携带高致病的毒性质粒所决定的。而细菌的质粒是存在水平传播风险的，极有可能从强致病力菌株转移至无致病力菌株中，从而造成原本无致病力的菌株产生致病性。而只用一种菌株进行疫苗制备，因为存在抗原差异性，就会使原本产生的抗体对新的致病力菌株失效，从而使免疫动物失去免疫保护性。本发明用于制备多价灭活疫苗的两株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株，是经过系统的流行病学和病原学研究而筛选出来的，菌株的致病力和免疫原差异性显著，具有很好的互补性，弥补了单菌株疫苗效价低的缺点，从而有效的解决了上述问题。
2、本发明一次接种84天后对鱼类的免疫保护率仍能够达到80％以上，免疫保护效果突出，可实现对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种感染的有效预防。
3、本发明适用对象多，能够用于我国大多数海水养殖鱼类的的免疫接种。
附图说明
图1注射美人鱼发光杆菌美人鱼亚种Pdd1605菌株后许氏平鲉的死亡曲线。
图2美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌多价灭活疫苗对许氏平鲉的免疫保护率。
具体实施方式：
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗，其制备方法包括以下步骤：
(1-1)首先从-80℃保存的菌种盒中活化两株菌的菌种，在28℃的条件下，用TSB琼脂平板培养基单菌落纯化培养3次，每次培养时间为20-22h为佳，不低于20h，不超过24h。
(1-2)从TSB琼脂平板培养基上挑选纯化好的一个单克隆菌落，接种至5ml TSB液体培养基中，在28℃、180rpm震荡条件下，培养10-12h，作为种子液。
(1-3)吸取300ul上述培养好的种子液转接至500ml TSB液体培养基种，在28℃、180rpm震荡条件下，培养16-20h。吸取5ml进行梯度稀释测定吸光值(OD 600)，按照Y＝(0.6518X-0.0158)×10 9cfu/ml公式计算发酵液中活菌浓度值，公式中X为OD 600的数值，Y为发酵液活菌浓度，OD 600取值仅在0.2～0.8范围内有效。当菌液浓度达到10 9cfu/ml或以上时，停止发酵，制成美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株发酵液
(1-4)用两个50ml的离心管，在8000rpm条件下离心5min后倒去上清液，分5次将制备好的500ml发酵液中的菌体收集至两个离心管中。收集完毕后，分别在两个离心管中各加入40ml的1.5％无菌NaCl溶液，对菌体进行重悬，并将两个离心管中的重悬菌液转移至一个高温灭菌的250ml锥形瓶中，补充20ml的1.5％无菌NaCl溶液至总体积为100ml，再加入0.5ml甲醛使其浓度达到0.5％，然后在4℃、90rpm灭活48h。
(1-5)将灭活完成菌液在8000rpm条件下离心5min后倒去上清液，收集菌体。依据(2-3)计算的菌液浓度值和体积倍比关系，加入适量的体积0.2％甲醛溶液，最终调整灭活菌液浓度为2.0～4.0×10 10cfu/ml，分别制得两株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的全菌灭活菌液，存放于4℃备用。
(1-6)吸取制好的灭活菌液100μl涂布于TSB琼脂培养基在28℃培养24h，进行三次平行实验，检验灭活效果，若无菌落长出，证明灭活菌液合格。
(1-7)各取1ml两株菌检验合格的灭活菌液，混合后制备成2ml的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的多价灭活菌液，存放于4℃备用。
(1-8)取纯品枸杞多糖400mg，溶解于20ml的PBS缓冲液中(PH＝7.2)，在105℃灭菌30min后，自然冷却制得20mg/ml的枸杞多糖溶液。
(1-9)将上述2ml的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活菌液、10ml的枸杞多糖溶液和8ml的无菌PBS缓冲液(PH＝7.2)进行混合，并震荡均匀，最终制得美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活疫苗。
效果验证：
以许氏平鲉为实验动物，检验美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌多价灭活疫苗的免疫保护效果。具体实验方案为：选用平均体重40g的健康许氏平鲉进行免疫保护实验，实验分成8个组别，其中4组为对照组，4组为实验组，每组30尾鱼，共计240尾鱼。所有实验鱼都养在水族实验室的500L的玻璃钢桶中，每组一桶，每桶每天分早晚两餐投喂共计10g的颗粒饲料，每两天换水四分之一。
所有实验鱼暂养一周确认健康后，实验组鱼按照0.08ml/尾剂量注射美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌多价灭活疫苗，对照组鱼按照相同剂量注射灭菌的PBS缓冲液中(PH＝7.2)，注射部位均是背部肌肉。在免疫注射后的第28d、42d、56d和84d分别挑取一组对照组鱼和实验组鱼，都用1.1×10 6cfu/ml的Pdd1605活菌液进行攻毒(该菌株对许氏平鲉具有极强的致死能力，见图1)，测定各组别的免疫保护率，攻毒采用注射的方式进行，注射剂量为0.04ml/尾，注射部位是背部肌肉。
攻毒后每天观察对照组和实验组鱼的临床症状，统计14d内的各组实验鱼的死亡数量，并按照以下公式计算相对保护率(RPS)
Figure GDA0003027329730000061
实验结果如图2所示。其中，在注射疫苗后的第28天即已显现出一定的免疫保护效果，相对免疫保护率为46％。而在第56天，相对免疫保护率达到了最高为87％，并在第84天仍维持在84％的水平。是结果充分证实，本发明的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活疫苗对许氏平鲉具有极好的的免疫保护效果。

Claims (10)

1.一种美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于：通过筛选存在致病力和免疫原差异的两株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株，分别进行全菌灭活后添加枸杞多糖混合制成；
所述的两株致病力和免疫原差异菌株分别是保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为：CGMCC No.19466的无致病力菌株，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；以及保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为：CGMCC No.19467的强致病力菌株，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)活化菌株；
(2)挑选单克隆菌落，培养种子液；
(3)制备美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株发酵液；
(4)离心后去除上清液，然后对菌体进行重悬，然后灭活；
(5)再次离心后去除上清液收集菌体，调整浓度，得到全菌灭活菌液；
(6)各取两株菌检验合格的灭活菌液，混合后制备成人鱼发光杆菌美人鱼亚种的多价灭活菌液；
(7)取纯品枸杞多糖溶解，得到枸杞多糖溶液；
(8)将(6)中的多价灭活菌液、(7)中的枸杞多糖溶液和缓冲液混合，并震荡均匀，最终制得美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活疫苗。
3.如权利要求2所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于：吸取制好的灭活菌液涂布于TSB琼脂培养基进行培养，进行三次平行实验，检验灭活效果，若无菌落长出，证明灭活菌液合格。
4.如权利要求2所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(1)活化菌种的培养条件为从-80℃保存的菌种盒中活化两株菌的菌种，在28℃的条件下，用TSB琼脂平板培养基单菌落纯化培养3次，不低于20h，不超过24h；步骤(2)培养种子液的条件为从TSB琼脂平板培养基上挑选纯化好的一个单克隆菌落，接种至5ml TSB液体培养基中，在28℃、180rpm震荡条件下，培养10-12h，作为种子液。
5.如权利要求4所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(1)活化菌种的培养条件为从-80℃保存的菌种盒中活化两株菌的菌种，在28℃的条件下，用TSB琼脂平板培养基单菌落纯化培养3次，每次培养时间为20-22h。
6.如权利要求2所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(3)发酵的具体操作为：吸取300ul上述培养好的种子液转接至500ml TSB液体培养基中，在28℃、180rpm震荡条件下，培养16-20h；吸取5ml进行梯度稀释测定OD600，按照Y＝(0.6518X-0.0158)×109cfu/ml公式计算发酵液中活菌浓度值，公式中X为OD 600的数值，Y为发酵液活菌浓度，OD 600取值仅在0.2～0.8范围内有效；当菌液浓度达到109cfu/ml或以上时，停止发酵，制成美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株发酵液。
7.如权利要求2所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于步骤(4)灭活的具体操作为：用两个50ml的离心管，在8000rpm条件下离心5min后倒去上清液，分5次将制备好的500ml发酵液中的菌体收集至两个离心管中；收集完毕后，分别在两个离心管中各加入40ml的1.5％无菌NaCl溶液，对菌体进行重悬，并将两个离心管中的重悬菌液转移至一个高温灭菌的250ml锥形瓶中，补充20ml的1.5％无菌NaCl溶液至总体积为100ml，再加入0.5ml甲醛使其浓度达到0.5％，然后在4℃、90rpm灭活48h。
8.如权利要求2所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于步骤(5)的具体操作为：将灭活完成菌液在8000rpm条件下离心5min后倒去上清液，收集菌体；依据步骤(3)计算的菌液浓度值和体积倍比关系，加入适量的体积0.2％的甲醛溶液，最终调整灭活菌液浓度为2.0～4.0×1010cfu/ml，分别制得两株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的全菌灭活菌液，存放于4℃备用。
9.如权利要求2所述的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗的制备方法，其特征在于步骤(6)具体为各取1ml两株菌检验合格的灭活菌液，混合后制备成2ml的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的多价灭活菌液，存放于4℃备用；步骤(7)具体为取纯品枸杞多糖400mg，溶解于20ml的PBS缓冲液中，在105℃灭菌30min后，自然冷却制得20mg/ml的枸杞多糖溶液；步骤(8)为将上述2ml的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活菌液、10ml的枸杞多糖溶液和8ml的无菌PBS缓冲液，进行混合，并震荡均匀，最终制得美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价灭活疫苗，所述PBS缓冲液PH＝7.2。
10.一种用权利要求1-9任一一项所述的方法制备的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种多价疫苗。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111304131B (zh) * 2020-03-17 2021-07-16 中国水产科学研究院黄海水产研究所 致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株及应用
CN113281506A (zh) * 2021-05-14 2021-08-20 中国水产科学研究院黄海水产研究所 美人鱼发光杆菌美人鱼亚种elisa检测试剂盒及应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101461940A (zh) * 2009-01-09 2009-06-24 中国水产科学研究所南海水产研究所 美人鱼发光杆菌疫苗及其制备方法和应用
CN102139103A (zh) * 2011-04-07 2011-08-03 淮海工学院 半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的制备与使用方法
CN109646674A (zh) * 2019-01-25 2019-04-19 中国农业大学 一种球虫病活疫苗及其应用
CN109865135A (zh) * 2019-03-18 2019-06-11 宁波大学 一种银鲳美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌联合灭活疫苗
CN109880766A (zh) * 2019-03-18 2019-06-14 宁波大学 一种银鲳美人鱼发光杆菌菌株及灭活疫苗
CN110747285A (zh) * 2019-11-27 2020-02-04 中国水产科学研究院黄海水产研究所 强致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的快速鉴定方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101461940A (zh) * 2009-01-09 2009-06-24 中国水产科学研究所南海水产研究所 美人鱼发光杆菌疫苗及其制备方法和应用
CN102139103A (zh) * 2011-04-07 2011-08-03 淮海工学院 半滑舌鳎美人鱼发光杆菌疫苗的制备与使用方法
CN109646674A (zh) * 2019-01-25 2019-04-19 中国农业大学 一种球虫病活疫苗及其应用
CN109865135A (zh) * 2019-03-18 2019-06-11 宁波大学 一种银鲳美人鱼发光杆菌和灿烂弧菌联合灭活疫苗
CN109880766A (zh) * 2019-03-18 2019-06-14 宁波大学 一种银鲳美人鱼发光杆菌菌株及灭活疫苗
CN110747285A (zh) * 2019-11-27 2020-02-04 中国水产科学研究院黄海水产研究所 强致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的快速鉴定方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
多糖类制剂;张学波等;《医学免疫学》;北京：中国医药科技出版社;20161231;第232页 *
美人鱼发光杆菌研究进展;王洪彬等;《黑龙江畜牧兽医》;20181231;第9卷;第55-58页 *

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