CN111374236A - 一种提高肉鸡免疫力及饲料利用率的复合绿色饲料添加剂 - Google Patents

Abstract

一种提高肉鸡免疫力及饲料利用率的复合绿色饲料添加剂，将干燥的CM粉碎并超声提取，抽滤后收集滤液，减压蒸馏浓缩至粘稠状，降为常温后加无水乙醇，将混合液置于无菌环境静置，过滤分离溶液中的沉淀物，干燥至恒重；将5份的CMP加入1份的乙酸，再加入麦芽糊精，在加入麦芽糊精的过程中需要不断的搅拌，直至混合物的总质量为10份量，即获得复合绿色饲料添加剂。该复合饲料添加剂能提高肉鸡免疫力及其饲料利用率，从而避免抗生素作为饲料添加剂被过度滥用，及一系列的畜禽产品安全问题。

Description

一种提高肉鸡免疫力及饲料利用率的复合绿色饲料添加剂

技术领域

本发明涉及肉鸡饲养领域，具体为一种提高肉鸡免疫力及饲料利用率的复合绿色饲料添加剂。

背景技术

为了促进动物生长和保持动物健康，抗生素作为饲料添加剂被过度滥用，产生了一系列的畜禽产品安全问题，甚至诱导产生了耐药菌株。因此寻找安全无副作用的抗生素替代物应用于畜禽生产成了人们越来越关注的问题。

发明内容

本发明的目的在于，解决上述现有所存在的问题，提供了一种提高肉鸡免疫力及饲料利用率的复合绿色饲料添加剂，解决了抗生素作为饲料添加剂被过度滥用，产生了一系列的畜禽产品安全的问题。

本发明是这样实现的：复合绿色饲料添加剂的制备，包括以下步骤：

一、桑白皮多糖（CMP）的制备

桑白皮多糖已下简称CMP，桑白皮简称CM；将干燥的CM粉碎过80目筛，准确称量后加20倍质量的水溶解并进行超声提取，超声时间40min，提取温度50～52℃；抽滤后收集滤液，减压蒸馏浓缩至粘稠状，降为常温20～25℃，加入20倍质量的无水乙醇，并搅拌均匀，将混溶溶液置于5～8℃的无菌环境静置12 h，过滤分离溶液中的沉淀物，沉淀物干燥前需要使用无水乙醇冲洗3～5次，并在25℃下干燥至恒重。收率为4-6%。

二、复合饲料添加剂制备

将5份的CMP加入1份的乙酸，再加入麦芽糊精，在加入麦芽糊精的过程中需要不断的搅拌，直至混合物的总质量为10份量，即获得复合绿色饲料添加剂。

使用时，复合绿色饲料添加剂混入肉鸡配合饲料的比重为5‰。

本发明的有益效果是：中草药富含多种天然有效成分并且本身毒副作用极低，其中多糖、黄酮类物质能够提高动物免疫力，因此成为抗生素替代物的首选之一。我们筛选竹茹、黄芪、大黄、党参、白芍、甘草、野菊花、桑白皮、白薇、苍术、紫胡、合欢皮、板蓝根、金银花等14种中草药，发现桑白皮能够显著促进淋巴细胞增殖，提高肉鸡的细胞免疫功能。桑白皮(Cortex Mori, CM)为桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮，味甘、性寒，被用于泻肺平喘、利水消肿。近几年的药理学研究表明CM具有降血糖、镇痛、抗癌及抗病毒等作用。因此我们开展了大量试验，优化了CM中有效成分多糖的提取工艺，并验证了其对肉鸡具有显著的免疫增强作用，因此，将桑白皮多糖（Polysaccharide Isolated from Cortex Mori，CMP）作为抗生素替代物应用于肉鸡生产具有显著的社会效益和经济效益。

短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)是指碳链中碳原子数小于5的脂肪酸，多是由肠道内厌氧菌对寡糖、多糖、肽、蛋白和糖蛋白的发酵作用所产生的，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。研究发现，肠道中的SCFAs不仅可以作为营养物质被吸收还可以影响肠道各种生理作用，如促进肠上皮细胞增殖，抑制凋亡，促进肠道发育；通过影响某些炎性细胞释放细胞因子而起到抗炎作用；抑制肿瘤细胞的增殖、控制原癌基因的表达、促进肿瘤细胞的分化和凋亡，起到抗肿瘤的作用。我们前期采用乙酸作为饲料添加剂应用于大骨鸡饲粮，结果表明乙酸具有明显的改善肠道黏膜形态，促进饲料消化吸收的效果，因此，采用乙酸与CMP联合使用制备免疫增强型复合饲料添加剂，以期在促进肉鸡生长，提高饲料转化率方面表现出比CMP单独使用更大的优势。

1、CMP作为复合绿色饲料添加剂的主要成分，能激发鸡的免疫机能，其途径通过刺激T、B淋巴细胞增殖，进而促进免疫球蛋白和补体分泌，同时，能显著降低肉鸡的料重比(P<0.05)，提高其饲料转化率；

2、乙酸能够改善鸡的肠道黏膜形态，从而促进营养物质吸收；见表2-表4；

3、麦芽糊精作为载体起着稀释、填充的作用，可防潮结块，使产品易贮藏；

4、复合绿色饲料添加剂对肉鸡生长性能的影响见表 6；

5、复合绿色饲料添加剂对肉仔鸡外周血淋巴细胞增殖功能的影响见表7；

6、复合绿色饲料添加剂对肉仔鸡血清免疫球蛋白含量的影响见表8；

7、复合绿色饲料添加剂对肉仔鸡血清补体水平的影响见表9；

由此可见，复合绿色饲料添加剂的使用显著提高肉鸡免疫力及其饲料利用率。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的表格，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明：

一、乙酸对大骨鸡消化性能的影响

1、试验动物、饲养管理及试验设计

选取1日龄辽宁庄河大骨鸡48只，公鸡母鸡各半，将其随机分为对照组和试验组，实验期间，两组实验鸡均自由采食、自由饮水、笼养，实验组在基础日粮中添加0.5%的乙酸，实验至15天时，两组试鸡分别抽取4只（公母各半）屠宰并收集血样，静置15min，以3000 r/min的速度离心 10 min，将上清液分装于 1.5 mL EP管中，置于-20℃的冰箱中低温保存以备测定血清指标，同时，分别从两组选取2只公鸡、2只母鸡称重后屠宰，剪十二指肠前端1cm处肠段用生理盐水冲洗干净，置于10%福尔马林液中固定保存，用于制作石蜡切片，以备形态学分析。饲粮组成及营养水平见表1。

2、 试验结果

乙酸对辽宁庄河大骨鸡血清激素指标的影响见表2，实验组大骨鸡胰岛素样生长因子含量显著高于对照组，说明乙酸能够影响大骨鸡神经内分泌生长轴上相关激素（生长激素，促生长激素释放激素，胰岛素，胰岛素样生长因子）的分泌，从而起到促进大骨鸡生长发育的作用。

表2 乙酸对庄河大骨鸡血清激素指标的影响

项目	对照组	乙酸组
			血清INS含量	11.30±0.88	14.07±1.25
血清IGF-1含量	146.32±10.85<sup>b</sup>	220.15±21.39<sup>a</sup>
			血清GH含量	6.90±0.41	7.66±0.41
血清GHRH含量	45.61±3.99	51.17±4.90

注：数据以“平均值±标准误”表示。同行肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），下同。

乙酸对大骨鸡小肠黏膜形态的影响见表3，饲粮中添加浓度为0.5%的乙酸，十二指肠绒毛高度显著变高，表面积也相应增大，从而改善大骨鸡的小肠粘膜形态，提高其消化吸收能力。

表3 乙酸对大骨鸡小肠黏膜形态的影响

项目	对照组	乙酸组
			十二指肠绒毛高度(μm)	4694.05±218.22b	5569.78±253.98a
十二指肠绒毛宽度(μm)	639.28±117.22	911.39±75.12

乙酸对大骨鸡消化器官发育的影响见表4，相对于对照组，乙酸组小肠指数有明显提高（P<0.05）。表明饲粮中添加0.5%的乙酸可以促进小肠发育，进而提高大骨鸡消化功能。

表4 乙酸对大骨鸡消化器官发育的影响

项目	对照组	试验组
			肝脏指数	9.80±0.15	9.75±0.35
胰腺指数	1.07±0.18	1.32±0.09
			肌胃指数	11.45±1.70	10.19±0.58
腺胃指数	1.79±0.12	1.90±0.10
			小肠指数	7.99±0.54b	10.13±0.04a

二、CMP及CMP乙酸复合绿色饲料添加剂对于肉鸡生长性能及免疫性能的影响

1、试验动物、饲养管理及试验设计

选择1日龄的AA肉仔鸡公雏（Arbor Acres male broilers）480羽，随机分为4个处理，每个处理6个重复，每个重复20只，基础日粮为玉米-豆粕型，参照美国NRC《鸡营养需要》(1994)配制 (表 5)。试验全期42天，采用笼养的饲养方式。试验分组如下：

组为对照组：无添加的基础日粮组；

组：基础日粮中添加2500g/t CMP（0.25% CMP）；

组：基础日粮中添加5000g/t CMP（0.5% CMP）；

组，基础日粮中添加5000g/t 复合绿色饲料添加剂（0.5% 复合绿色饲料添加剂）。在试验的第21、42日的前一夜20点开始，禁食12h，次日早上8:00以重复为单位空腹称重，统计21、42日龄耗料量，计算平均日增重、采食量和料重比。

2、 血样采集

分别于第21、42 日龄在每个处理中随机选取已经空腹12 h 的试鸡6只（每个重复1只），无菌心脏采取1 mL 肝素抗凝血，于4小时内测定外周血淋巴细胞增殖功能。翅下静脉采血10mL，静置30 min，3000 r/min离心10 min，分离血清，分装后于-20 ℃冰箱里冷冻保存，用于测定血清免疫球蛋白和补体含量。

3、 淋巴细胞增殖功能

利用Percoll法分离肉鸡外周血淋巴细胞，取肉鸡肝素抗凝血1ml，用1ml D-Hanks液稀释混匀。另取10ml螺口离心管，先加入1.5ml淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝血沿管壁缓慢倒入倾斜的离心管内，保持液面分层清晰。2000r/min，离心20min。离心毕，试管内可见分为4层，其中第二层为薄薄的白膜层，主要含淋巴细胞。用一次性注射器轻轻插入至白膜层，沿试管壁周缘吸出白膜层细胞，置于离心管内，用PBS缓冲液重悬细胞，洗涤2次，每次以1500r/min离心10min，快速倾出上清液。最后一次洗涤时，要定量加入PBS液，吹打均匀后取样，用台盼蓝染色计数活细胞数（﹥95%），调整细胞浓度为1×106个/ml。

采用MTT法测定淋巴细胞增殖功能。将各组淋巴细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔均为100μl。然后每孔分别加入100μl RPMI-1640完全培养液和ConA（终浓度为5mg/L）的混合液，或100μl RPMI-1640完全培养液和LPS（终浓度为20mg/L）的混合液，每组均设4复孔。将96孔细胞培养板置于温度为37℃、CO2浓度为5%的CO2培养箱中连续培养44小时后取出，每孔加入20μl MTT。继续培养4小时，取出培养板，1800r/min，37 °C 离心10分钟后弃上清，每孔加入150μl DMSO，振荡培养板至形成的紫色结晶完全溶解，用奥地利 TECAN-GENious酶标仪测定570nm处吸光度A值。ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS主要刺激B淋巴细胞增殖，因此利用两种有丝分裂原刺激不同淋巴细胞，可分别测定猪外周血T、B淋巴细胞的增殖功能。

4、 血清免疫球蛋白和补体含量测定

采用免疫比浊法，试剂盒购买于潍坊三位生物工程集团有限公司，用紫外可见分光光度计进行分析测定。

5、 试验结果

复合绿色饲料添加剂对肉仔鸡生长性能的影响见表6。饲粮中添加0.5% 的CMP和0.5%的复合绿色饲料添加剂能显著降低生长前期和生长后期肉鸡的料重比(P<0.05)，0.5%的复合绿色饲料添加剂能显著提高生长后期肉鸡平均日增重(P<0.05)。

注：数据用平均值±标准误表示。同行数字肩标不同字母代表差异显著 (P<0.05)，以下同。

复合绿色饲料添加剂对肉仔鸡外周血淋巴细胞增殖功能的影响见表7。淋巴细胞增殖是机体免疫系统遭受外来抗原刺激之后产生的保护性生理反应，对机体抵抗外来病原微生物的感染具有十分重要的意义。为此，在体外利用各种刺激原激发淋巴细胞，根据其转化程度可测定淋巴细胞的功能状态与机体的免疫状况。T淋巴细胞介导机体的细胞免疫反应，刺激T细胞分裂的有丝分裂原主要为刀豆蛋白A（Concanavalin A，ConA），B淋巴细胞介导机体的体液免疫反应，刺激B细胞分裂的有丝分裂原主要为细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），因此本试验分离鸡外周血淋巴细胞后分别用ConA和LPS刺激，即能够分别测定不同处理肉鸡T细胞和B细胞的免疫功能，从而反应出肉鸡的细胞免疫功能和体液免疫功能。本研究结果表明，21日龄时，饲粮中添加0.5%的CMP以及0.5%的复合绿色饲料添加剂均显著提高了ConA和LPS诱导的肉仔鸡外周血淋巴细胞增殖功能（P<0.05）。42日龄时，0.5%的复合绿色饲料添加剂提高了ConA诱导的肉仔鸡外周血淋巴细胞增殖水平（P<0.05）。由此说明CMP及复合绿色饲料添加剂对鸡的特异性细胞免疫应答和体液免疫应答均有一定程度的正向调节作用，其中复合绿色饲料添加剂对免疫指标的改善效果优于CMP单独添加。

复合绿色饲料添加剂对肉仔鸡血清免疫球蛋白含量的影响见表8。免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是存在于动物血液、组织液和其他外分泌液中的一类具有相似结构的球蛋白，由B淋巴细胞分化成熟后产生。IgG是生物体液内主要的免疫球蛋白，经由抗原的诱导可以转化为抗体，介导体液免疫。IgM是动物机体初次体液免疫反应最早产生的Ig，具有抗菌、抗病毒、中和毒素等免疫活性。IgA有单体、双体或多聚体等不同形式，血清型IgA主要为7S单体，同样具有IgG和IgM的免疫活性。本试验结果显示，21日龄时，相对于对照组，饲粮中添加0.5%的复合绿色饲料添加剂显著提高了21日龄和42日龄肉鸡血清IgA和IgG水平（P<0.05）。而单独添加0.5%CMP仅能显著提高42日龄肉鸡血清IgG水平（P<0.05），但对IgA水平影响不大。说明复合绿色饲料添加剂比CMP单独使用更能激发鸡的体液免疫机能，其途径是通过刺激B淋巴细胞增殖，进而促进免疫球蛋白分泌造成的。

复合绿色饲料添加剂对肉仔鸡血清补体水平的影响见表9。补体（complement，C），是存在于动物血清及组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质。补体可辅助和补充特异性抗体，同时也能加强细胞免疫功能，介导免疫溶菌、溶血作用，广泛参与机体微生物防御反应以及免疫调节，是体内发挥非特异性免疫机能的重要免疫分子，同时参与特异性免疫应答。C3是补体系统中含量最多，最重要的一个组分，也是旁路活化途径中最关键的组分，表现出多方面的功能，不仅是非特异性免御系统中重要的组成部分，在特异性免疫中也有重要作用，有利于免疫细胞间的相互呈递，其含量可反映血清总补体水平；C₄则在经典途径的活化阶段起着重要作用。本试验研究表明，相对于对照组，饲粮中添加0.5%复合绿色饲料添加剂显著提高了21日龄和42日龄肉鸡血清C4水平（P<0.05），同时比单独添加0.5%CMP的21日龄肉鸡血清C4含量也有显著提高（P<0.05）。表明复合绿色饲料添加剂也能够提高肉仔鸡的非特异性免疫机能。

Claims (1)

1.一种提高肉鸡免疫力及饲料利用率的复合绿色饲料添加剂，其特征在于，包括以下步骤：

一、桑白皮多糖（CMP）的制备

桑白皮多糖已下简称CMP，桑白皮简称CM；将干燥的CM粉碎过80目筛，准确称量后加20倍质量的水溶解并进行超声提取，超声时间40min，提取温度50～52℃；抽滤后收集滤液，减压蒸馏浓缩至粘稠状，降为常温20～25℃，加入20倍质量的无水乙醇，并搅拌均匀，将混溶溶液置于5～8℃的无菌环境静置12 h，过滤分离溶液中的沉淀物，沉淀物干燥前需要使用无水乙醇冲洗3～5次，并在25℃下干燥至恒重；

二、复合饲料添加剂制备

将5份的CMP加入1份的乙酸，再加入麦芽糊精，在加入麦芽糊精的过程中需要不断的搅拌，直至混合物的总质量为10份量，即获得复合绿色饲料添加剂。