CN101869576B - 无花果多糖的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了无花果多糖在制备鱼用免疫调节剂中的用途。本发明还提供了一种鱼用免疫调节剂，它是由有效量的无花果多糖为活性成分，加入可接受的辅料或辅助性成分制备而成。通过试验证实无花果多糖对有鳞鱼具有非特异性免疫调节的能力，所述的无花果多糖的用量，以辅料重量计，占0.1-0.8％w/w，具有较强的免疫调节功效，尤以无花果多糖的用量，以辅料重量计，为0.4％时效果最佳，此外，本发明鱼用免疫调节剂是多糖类物质，安全性好，同时也是一种碳水化合物，可以节省饲料中碳水化合物的用量，特别是作为鱼用饲料添加剂，具有良好的效果，且取材容易，是一种安全有效，成本节约的鱼用免疫调节剂。
Description
技术领域
本发明涉及无花果多糖的新用途，具体地，是无花果多糖在制备鱼用免疫调节剂中的用途。
背景技术
植物多糖是一种生物活性多糖，经大量研究证实，多糖类化合物具有强化人和动物机体(如小鼠、禽类)非特异性免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗凝血等独特功能，而且毒性小，其免疫功能日益受到重视，国外有关专家进行了一些研究，但是植物多糖在我国水产动物上的研究还很少、不系统、不全面。因此筛选出一种对水产动物免疫功能发挥良效的的植物多糖，对水产动物的科学养殖具有很深的意义。
目前报道的植物多糖对鱼类机体的免疫调节作用机理为：激活嗜中性粒细胞的吞噬作用和呼吸爆炸作用以及巨噬细胞的吞噬、破坏异物颗粒的能力；刺激淋巴细胞的增生或分泌淋巴因子；诱导抗体的产生及补体的生成等。如：黄芪多糖对尼罗罗飞鱼的免疫调节作用就是通过增强呼吸爆炸活性，溶菌酶活性增强，吞噬作用增强。王文博等(王文博，林小涛，方平，等.腹注甘草粗提物对鲫免疫力的影响.中山大学学报(自然科学版)2007，4：84-88)将甘草粗多糖腹腔注射鲫鱼，结果显示血清溶菌酶活性、血清杀菌活性、血液淋巴细胞计数等免疫参数都有所改善，表明鲫鱼免疫力在一定程度上得到了增强；Xu(Xuxiong Huang，Hongqi Zhou，Hui Zhang.The effect of Sargassum fusiformepolysaccharide extracts on vibriosis resistance and immune activity of the shrimp，Fenneropenaeus chinensis.Fish & She1lfish Immunology 2006，20，5，750-757)研究出马尾藻类海草多糖能提高南美北对虾对弧菌病的抵抗能力；Guo(2005)等研究了黄芪多糖在尼罗罗非鱼上的免疫效果，结果显示连续饲喂一周黄芪多糖能提高鱼体的溶菌酶活力，饲喂三周能增强吞噬细胞活性来提高机体抵抗外界物质的能力；王远吉(2004)研究证实枸杞多糖能提高鲫鱼血清溶菌酶活性，且在45mg/kg的添加时候效果最好；简记常等(2004)将黄芪和当归以5∶1比例投喂20天建鲤，结果显示血液中NBT阳性细胞以及血清中溶菌酶、补体均显著增强；张起信等(2003)报道添加免疫多糖试验组较未添加组鱼的平均体长、体重、存活率分别提高14mm、32.6g和4.89％；但是此类研究并没有明确植物多糖的优越性，对其作用机理也较少。
近年来，随着水产中化学药物残留、抗生素耐药性的日益严重，选择正确的防病方式才能让绿色渔业成为可能。水产动物进化程度低，免疫系统相对高等动物不完善，特异性免疫应答功能较为低下，通过提高鱼体的非特异性免疫水平是增强防病能力的有效措施之一。那些对哺乳动物或者禽类很有效的多糖类化合物能否同样作为一类富有成效的非特异性免疫增强剂广泛应用于水产值得开发。
无花果(ficus carica)属桑科(Moraceae)榕属，又名隐花果、映日果、奶浆果、蜜果、树地瓜、文先果、明目果等，因花小，藏于花托内故而得名。原产于欧洲地中海沿岸和中亚地区，西汉时引入中国。它不仅甜美富营养，又是一味治病的中药，我国医学巨著《本草纲目》上就有药用记载，具有健脾胃、清热润肠、润肺止咳、消肿解毒、抗肿瘤、降压、轻泻、助消化等功能。近年研究报道，其主要成分为有机酸、生物碱、甙类、糖类、无花果朊酶等，同时也有研究报道无花果中粗多糖部分可提高小鼠血清溶血素抗体水平、增强迟发型超敏反应的强度以及显著增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性，具有调节正常小鼠的免疫功能以及增强免疫抑制状态小鼠的免疫应答水平的良好效果。将无花果多糖用于水产动物，能否发挥药效，对本领域技术人员来，是无法预知的。
发明内容
本发明的技术方案是提供了无花果多糖的新用途，具体地，是无花果多糖在制备鱼用免疫调节剂中的用途，本发明的另一技术方案是提供了一种免疫调节剂。
本发明提供了无花果多糖在制备鱼用免疫调节剂中的用途。
其中，所述的鱼用免疫调节剂具有非特异性免疫调节作用。
其中，所述的鱼类是有鳞鱼。
其中，所述的无花果多糖中糖含量不得低于85％w/w。
其中，所述的无花果多糖的制备方法为：取无花果，加水至温度75-85℃时，料液比为1∶16-20，提取4-8h；浓缩，加入乙醇至终末浓度为60％沉淀16-20h。进一步优选地，所述的无花果多糖的制备方法为：加水至温度80℃，料液比为1∶18，分2次提取共6h；浓缩，加入乙醇至终末浓度为60％沉淀18h。
本发明还提供了一种鱼用免疫调节剂，它是由有效量的无花果多糖为活性成分，加入可接受的辅料或辅助性成分制备而成。
其中，所述的无花果多糖的用量，以辅料重量计，占0.1-0.8％w/w。进一步优选地，所述的无花果多糖的用量，以辅料重量计，占0.2-0.6％w/w。进一步优选地，所述的无花果多糖的用量，以辅料重量计，占0.4％w/w。
其中，所述的辅料为鱼用饲料。
本发明通过试验证实无花果多糖对鲫鱼具有非特异性免疫调节的能力，无花果多糖的用量为饲料量的0.1-0.8％w/w的范围内，具有较强的免疫调节功效，尤以无花果多糖的用量为饲料量的0.4％最佳；无花果多糖主要从促进鲫鱼免疫分子的分泌和细胞功能方面来增强机体的非特异性免疫能力，此外，本发明鱼用免疫调节剂是多糖类物质，安全性好，同时也是一种碳水化合物，可以节省饲料中碳水化合物的用量，特别是作为鱼用饲料添加剂，具有良好的效果，且取材容易，是一种安全有效，成本节约的鱼用免疫调节剂。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明的上述基本技术思想前提下，还可以作出其它多种形式的修改、替换和变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1无花果多糖对鲫鱼总蛋白含量的影响(均值±标准差)(X±SD)
图2无花果多糖对鲫鱼血清补体C3含量的影响(均值±标准差)(X±SD)
图3无花果多糖对鲫鱼血清超氧化物歧化酶活性的影响(均值±标准差)
图4无花果多糖对鲫鱼血清溶菌酶活性的影响(均值±标准差)
图5无花果多糖对鲫鱼血液白细胞吞噬活性的影响(均值±标准差)(X±SD)
图6无花果多糖对鲫鱼血液白细胞杀菌指数的影响(均值±标准差)(X±SD)
具体实施方式
实施例1本发明无花果多糖的制备
本发明无花果多糖可采用文献报道的方法提取无花果多糖，也可采用如下方法制备：
取无花果100g，加水，温度80℃时以料液比为1∶18，分2次提取共6h；优化得到乙醇沉淀法分离无花果多糖最佳工艺为：浓缩比例为1∶1时加入乙醇至终末浓度为60％沉淀18h为最佳提取分离工艺。得到沉淀后冷冻干燥放置4℃冰箱中保存。将干燥后的沉淀5mg溶于50mL蒸馏水中，经多糖特殊显色硫酸蒽酮试剂显色阳性，硫酸苯酚试剂显色阳性。多糖重量百分含量为：85.4％。
实施例2本发明无花果多糖的制备
取无花果100g，加水，温度75℃时以料液比为1∶20，分2次提取共8h；乙醇沉淀法分离无花果多糖工艺为：浓缩比例为1∶1时加入乙醇至终末浓度为60％沉淀20h。得到沉淀后冷冻干燥放置4℃冰箱中保存。将干燥后的沉淀5mg溶于50mL蒸馏水中，经多糖特殊显色硫酸蒽酮试剂显色阳性，硫酸苯酚试剂显色阳性。
实施例3本发明无花果多糖的制备
取无花果100g，加水，温度85℃时以料液比为1∶16，分2次提取共4h；乙醇沉淀法分离无花果多糖工艺为：浓缩比例为1∶1时加入乙醇至终末浓度为60％沉淀16h。得到沉淀后冷冻干燥放置4℃冰箱中保存。将干燥后的沉淀5mg溶于50mL蒸馏水中，经多糖特殊显色硫酸蒽酮试剂显色阳性，硫酸苯酚试剂显色阳性。
实施例4本发明无花果多糖提取方法工艺筛选试验
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验药材
无花果购自新疆哈密地区，经鉴定为无花果。
1.1.2主要试剂
葡萄糖(中国药品生物制品检定所)、木瓜蛋白酶(北京奥博星生物技术责任有限公司)、DEAE-Sepharose fast flow交换柱(GE公司)、正丁醇、三氯甲烷、95％乙醇、无水乙醇、氢氧化钠、蒽酮、浓硫酸(95-98％)等，以上试剂均为分析纯试剂。
1.1.3主要仪器
电热鼓风干燥箱101A-4型 上海试验仪器厂有限公司
HHS-8S电子恒温不锈钢水浴锅 上海亚荣生化仪器厂
电子天平M0DEL JD200-3 沈阳龙滕电子有限公司
800型离心沉淀器 上海手术器械厂
SHZ-D型循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂
RE-3000A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂
UV725紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司
BSZ-16自动部分收集器 上海予腾生物科技有限公司
1.2方法
1.2.1标准曲线的绘制
葡萄糖标准溶液的配制：精密称取充分干燥至恒重的10g葡萄糖标准品，加去离子水溶解，配制100mL标准溶液，标准溶液浓度为0.1g/L。
显色剂葸酮试液的制备：称取葸酮2g，加1L浓硫酸溶解即得，现配现用。
制备标准曲线：精密量取对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8ml，分别置于10ml具塞试管中，各用蒸馏水补至1.0ml，空白管吸取蒸馏水1.0ml，与供试品管作以下同步处理。各管分别精密加入蒽酮试液3ml，摇匀，浸于冰水浴中冷却，然后移至沸水浴中加热10min，自来水冷却，室温放置10min，取出照分光光度法在620nm的波长处重蒸水为空白进行比色测定吸光度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
多糖含量计算公式：C＝(A-a)/b A：回归曲线、a：回归系数-对照品横坐标读数、b：葡聚糖纵坐标读数
多糖得率＝C/D×1000×100％ D：样品重量
1.2.2无花果多糖提取条件的优选
参考明道绪的《生物统计附试验设计》采用温浸法设计四因素三水平(见表1)正交实验对无花果多糖的提取条件进行优选，四素三水平的选择是：料液比(1∶6、1∶12、1∶18)，提取温度(60℃、80℃、100℃)，提取时间(3h、6h、9h)，提取次数(1次、2次、3次)设计的。称取无花果碎片10g，分别装在9个磨口三角瓶中，按表2正交设计方案浸提、抽滤，滤液用去离子水定容至200mL；分别吸取10ul按照配制标准曲线的方法处理样品，在620nm处测定其吸光度。
表1无花果多糖提取试验因素水平表
表2无花果多糖提取试验方案表
1.2.3无花果多糖分离工艺的研究
称取200g无花果碎片按最佳提取方案进行提取(即料液比为1∶18，提取时间为6h，提取温度为80℃，提取次数为2次)，提取液旋转蒸发至干，加入100mL水溶解，再用酶-sevag法除蛋白：称取木瓜蛋白酶100mg溶于100mI蒸馏水中，混匀后以1∶100体积比加入多糖水溶液中，于37℃水浴中恒温6h，再用经典的Sevag法按1∶1的体积加入Sevag液(氯仿∶正丁醇＝4∶1)，反复振荡，静置24h以上直至清晰分层，保留水相，反复除蛋白5次直至无蛋白层，最后加蒸馏水定容为200ml。
采用乙醇沉淀法设计三因素三水平(见表3)正交实验对无花果多糖分离工艺进行研究，选择的三因素三水平是：浓缩比例(1∶1、1∶2、1∶3)，沉淀时间(6h、12h、18h)，乙醇浓度(60％，70％和80％)。设计的L934-正交实验表见表4。
取5mL多糖溶液(每份相当于含有5g无花果)，按表4正交设计方案进行分离。每份得到的沉淀抽滤，用去离子水溶解，定容至50mL，吸取上述定容的样液5ul，按照配制标准曲线的方法处理样品，在620nm处测定其吸光度。
表3无花果多糖醇沉试验因素水平表
表4无花果多糖醇沉试验方案表
1.2.4无花果多糖含量测定
将100g无花果多糖经最佳提取方法提取，称重并测定粗多糖含量，再经DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析和PBS液透析后，分别称重和测定两种纯多糖的含量。
2结果与分析
2.1葡萄糖标准曲线的绘制
以标准葡萄糖浓度c为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A＝0.0125c+0.0065，相关系数r＝0.9995。葡萄糖浓度在0～0.8g/L浓度范围内服从朗伯一比耳定律。
2.2提取无花果多糖正交实验结果与分析
根据表5正交实验结果分析得出：4个因素对无花果多糖浸提的影响顺序大小为：料液比C＞提取时间B＞提取次数D＞提取温度A，即料液比对无花果多糖的提取影响最大，四因素三水平最佳提取组合为A2B2C3D2。即温浸法提取无花果多糖以温度为80℃，料液比为1∶18，提取6h，分2次提取时，无花果多糖的得率为最高。
表5温浸法提取无花果多糖正交实验(L934)的结果分析
2.3分离无花果多糖正交试验结果与分析
根据表6正交实验结果分析得出：3个因素对分离无花果多糖的影响大小顺序为：乙醇加入量C＞乙醇浓度A＞沉淀时间B，即终末乙醇浓度对分离无花果多糖的影响最大，三因素三水平最佳分离组合为A1B3C2，即乙醇沉淀法分离无花果多糖以终末乙醇浓度为60％，沉淀时间为18h，浓缩体积比为1∶1时多糖的含量是最高的。
表6无花果多糖醇沉正交实验(L934)的结果分析
表7无花果粗多糖中多糖含量(％)及无花果多糖得率(％)
3讨论
本实验采用硫酸-葸酮法测定多糖，重现性高，快速、简单、易行。
以下通过具体实验证明本发明的有益效果。
试验例1各种植物多糖对鱼非特异性免疫功能的作用
选择淫羊藿多糖、香菇多糖、枸杞多糖、猪苓多糖、无花果多糖五种植物多糖进行鱼非特异性免疫功能的实验。每组20尾鱼。
各组鲫鱼在饲喂21d后，将浓度为108CFU/mL嗜水气单胞菌菌液对受试鱼进行染毒，每尾鱼腹腔注射0.2mL。每组鱼攻毒50尾，连续观察每组的死亡情况，统计具有特征性嗜水气单胞菌病变(内脏充血出血、腹部膨胀、腹水增多)且肝脏细菌于气单胞菌特殊培养基上呈阳性生长的死亡鱼。
结果：其中，使用淫羊藿多糖、香菇多糖、枸杞多糖组24h全部死亡，猪苓多糖组在24h有两只未死，无花果多糖组96h仍有4尾鱼未死。
试验结果表明，并非所有的植物多糖具有鱼非特异性免疫功能，在五种植物多糖的试验中，仅有无花果多糖具有稳定的药效。
试验例2无花果多糖对鲫鱼非特异性免疫功能的影响
1.材料与方法
1.1试验材料
无花果多糖按实施例1的方法制备；试验鲫鱼，由四川农业大学渔场提供；无花果，购自新疆哈密地区。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，均由四川农业大学鱼病研究中心保存提供。
1.2试验设计与饵料制作
试验设计五个组：A0组、A1组、A2组、A3组、A4组。每组80尾鱼。其中A0组为对照组，投喂基础饵料；A1组、A2组、A3组、A4组试验组投喂试验饲料(基础饵料中分别添加0.1％、0.2％、0.4％、0.8％的实施例1制备的无花果多糖)。试验设两个平行。
试验饵料营养水平主要参照鲫鱼NRC需要设计，相应缺少的需求参数则参考NRC上鲤鱼相关营养需求进行设计。饵料配方及营养成分如下：
试验饵料营养水平主要参照鲫鱼NRC(1993)需要设计，缺少的需求参数则参考鲤鱼相关营养需求设计。饵料配方及营养成分见表8。每日投喂两次，均按饱食量投喂。
表8试验基础饵料的组成及主要营养指标1
注：1.氨基酸预混料(g/kg)：赖氨酸12.3，蛋氨酸11.93，a-淀粉16.1；
2.微量元素预混料(mg/kg)：Fe，30；Cu，0.6；Zn，6；Mn，2.6；Se，0.05；I，0.12；Ca，3.2；
3.复合维生素预混料(g/kg)：VA1，2.667；VD3，1.666；VE，33.33；VK3，0.334；VB1，0.170；VB2，2.334g；VB6，2.0；VB12，0.003；Vc，23.3；D-泛酸钙，10；VPP，10.0；D-VH，3.34；磷脂酰肌醇，146.7；叶酸，0.33。
对照组：面粉669.221；试验组：对照组-多糖含量/0.3；
Note：1.Amino acids mix(g/kg)：lys12.3，gly11.93，a-starch1.61；2：Mineral mix(mg/kg)：Fe，30；Cu，0.6；Zn，6；Mn，2.6；Se，0.05；I，0.12；Ca，3.2；
3.Vitamin
mix(g/kg)：VA1，2.667；VD3，1.666；VE，33.33g/kg，VK3，0.334；VB1，0.170；VB2，2.334；VB6，2.0；VB12，0.003；Vc，23.3；D-calpanate，10，VPP，10.0；D-VH，3.34；phosphatidylinositol，146.7；folacin，0.33；control：flour669.221g，test group：control-PPS/0.3每日投喂两次，均按饱食量投喂。
1.3饲养管理
试验鲫鱼共800尾，体重40±2g，雌雄随机。选择规格一致、体格健壮的鲫鱼，购回后用氯化钠溶液消毒，养于80cm×60cm×50cm的水族箱中，养殖水质严格遵守渔业水质标准GB11607-1989，每日早晚各投喂一次饵料，换水1次，换水量为原来水量的1/3～1/2，同时抽去残饵和粪便。经过15d后驯养，开始正式试验。驯养期间饲喂鲫鱼基础日粮。试验周期35d。
1.4测定指标
1.4.1采血
分别于投喂药饵后的第0、7、14、21、28、35d对各组试验鱼随机采样，每组取五尾，用一次性注射器进行尾静脉采血，每尾采血2.5mL。然后将每尾鱼的血液分成两份，一份1.0mL制备抗凝血，一份1.5mL供制备血清。
1.4.2血清的制备和血细胞的收集
将所采血液1.5mL放于室温4h待其凝固后，再放4℃冰箱静置过夜，然后以4000r/min速度离心10min，收集上层血清用于血清学免疫指标(补体C3含量、总蛋白含量、SOD酶活性、溶菌酶活性)测定；另一份血液取1.0mL加入无菌0.5‰肝素钠0.05mL，制成抗凝血，供制备白细胞悬液，用于白细胞吞噬活性和杀菌活性的测定。
1.4.3白细胞悬液的制备
取0.5mL抗凝血按照1∶1比例加入0.5mL淋巴细胞分离液(1.0771±0.001)，参照Guo等的方法，以2500r/min的转速离心15min，吸取白细胞层，用Hank’s平衡盐溶液重悬三次，计数板计数调整细胞浓度至2×106CFU/mL，经台盼蓝染色检测白细胞存活率≥90％。
1.4.4吞噬菌体的制备
将金黄色葡萄球菌接种在液体肉汤培养基中，37℃培养24～48h，离心集菌，用灭菌生理盐水清洗3次，调整细菌浓度至1.0×108CFU/mL，4℃保存，用于白细胞吞噬活性菌体。
1.4.5血清总蛋白含量测定
总蛋白的测定采用Bradford所示的方法。以考马斯亮蓝(G-250)为指示剂，以牛血清白蛋白(BSA)为标准，测定595nm下不同牛血清蛋白质量浓度的0D值，以0D值描点绘制标准曲线。从标准曲线求得样品的蛋白含量，结果以“mg/mL”计。
1.4.6血清补体C3含量测定
采用补体C3试剂盒(浙江伊利康生物技术有限公司)测定。方法参照试剂盒说明书进行。
1.4.7血清SOD酶活性和溶菌酶活性的测定
分别采用SOD试剂盒和溶菌酶试剂盒(南京建成生物技术有限公司)测定，方法参照试剂盒说明书进行。
1.4.8白细胞吞噬活性和杀菌活性的测定
取0.5m1白细胞悬液加入0.5ml Hank’s液和100μ1.0×108cfu/mL的金黄色葡萄球菌，混匀，置于25℃下分别孵育15min、45min、75min和105min后，取出以2000r/min离心(对照组不离心)，以分离白细胞和胞外细菌。弃去上清液，下层即为吞噬细胞的细胞层。洗涤2次后用1.5ml 2％的Tween-20水溶液溶解细胞，然后加入1ml的MEM。置于20℃培养箱孵育16h，取出后每管分别加入90μl的MTT溶液，轻度震荡15min后在600nm处测定OD值并选择最佳孵育时间。
取白细胞悬液0.5mL，加入0.1mL的浓度为1.0×108cfu/mL的金黄色葡萄球菌液，混匀后置于28℃水浴中孵育1h，离心10min弃上清液，加入0.5mLHank’s液重悬。在原温度下继续孵育80min、100min、120min和150min，定时从中吸取0.2mL细胞悬液于另一试管中，加入1.0mL0.2％的Tween-20破碎白细胞，并加入0.5mLMEM培养基培养16h，再加入0.06mL的5.0mg/mL的MTT(四甲基偶氮唑盐)，摇动15min后用分光光度计在600nm处测定吸光度。按下列公式计算杀菌指数(BI)：
杀菌指数(BI)＝Tx时间还原MTT的OD值/T0时间还原MTT的0D值(BI＜1.0为具有杀菌能力；BI＞1.0则无杀菌能力；BI值升高，杀菌能力降低，反之亦然。)
1.4.9攻毒试验
各组鲫鱼在饲喂35d后，将浓度为108CFU/mL嗜水气单胞菌菌液对受试鱼进行染毒，每尾鱼腹腔注射0.2mL。每组鱼攻毒50尾，连续观察每组的死亡情况96h，统计具有特征性嗜水气单胞菌病变(内脏充血出血、腹部膨胀、腹水增多)且肝脏细菌于气单胞菌特殊培养基上呈阳性生长的死亡鱼，求植物多糖对鲫鱼的免疫保护率。
1.5数据处理
数据用“平均数±SD”表示，采用SPSS15.0软件对数据进行方差分析，并用Duncan’s法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极其显著。
2结果
2.1添加不同剂量的无花果多糖对鲫鱼血清总蛋白含量的影响
投喂无花果多糖对鲫鱼血清总蛋白含量的影响结果(表9、图1)。在试验的第7d，检测各组血清总蛋白含量水平升高，A2组、A3组与A0组差异明显(p＜0.05)；14d时，A2组、A3组达到峰值，A3组为最大，为0.483g/L，A3组与A0、A1组、A4组差异极其显著(p＜0.01)；A2组与A0组差异显著(p＜0.05)。14-35d这一阶段，A2组、A3组血清总蛋白水平下降，并趋于稳定，且A3组优于A2组。而A0组、A1组、A4组之间在各时间点检测均无显著差异(p＞0.05)。本试验结果显示，在饲喂添加无花果多糖的饲料后鲫鱼的总蛋白水平与对照组相比显著升高(P＜0.05)，肝脏合成总蛋白的能力增强，从而使机体对细菌的抵抗能力增强，表现出较高的免疫保护能力，其中以A2组、A3组效果最佳，尤其是A3组(0.4％)发挥最佳药效。
表9无花果多糖对鲫鱼总蛋白含量的影响(X±SD)
2.2添加不同剂量的无花果多糖对鲫鱼血清补体C3含量的影响
投喂无花果多糖对鲫鱼血清补体C3含量的影响结果(表10、图2)。在试验的7d检测，A2组、A3组补体C3含量与A0组相比差异显著(p＜0.05)。在试验的第14d，各组血清补体C3含量达到峰值，A2组、A3组与A0组差异极其显著(p＜0.01)，分别为73.25mg/L、78.65mg/L，与A1组、A4相比差异显著(p＜0.05)。14-35d这一期间，血清补体C3含量下降，并趋于稳定，组内无差异(p＞0.05)。在整个试验期间，A2组、A3组在第14天检测时开始显著高于A1组、A4组(p＜0.05)，且A3组优于A2组。而A0组、A1组、A4组之间在各时间点检测均无显著差异(p＞0.05)，三组之间也无显著差异(p＞0.05)。
表10无花果多糖对鲫鱼血清补体C3含量的影响(X±SD)
2.3添加不同剂量的无花果多糖对鲫鱼血清超氧化物歧化酶活性的影响
超氧化物歧化酶(SOD)具有促使超氧自由基分解的功能，可作为机体非特异性免疫指标来评判免疫刺激剂对机体非特异性免疫力的影响。正常健康机体内自由基的形成和清除处于一种动态平衡中，即巨噬细胞产生超氧自由基的能力和SOD清除超氧自由基的能力应该平衡，一旦这种动态平衡遭到破坏，使得超氧自由基在体内积累过多或过少，机体就会患病或衰老。
投喂无花果多糖对鲫鱼血清超氧化物歧化酶活性的影响结果(表11、图3)。在试验的第7d，检测各组血清超氧化物歧化酶活性升高，但均与A0组差异不明显(p＞0.05)；14d时检测，A2组、A3组与A0组相比差异极其显著(p＜0.01)，与A1组、A4组之间相比显著差异(p＞0.05)，A3组达到峰值为96.3U/mL；A2组在21d时达到峰值，为89.2U/mL。21-35d这一阶段，A2组、A3组血清超氧化物歧化酶活性下降，并趋于稳定，与A0组相比差异极其显著(p＜0.01)，与A1组、A4组之间相比显著差异(p＞0.05)，且A3组优于A2组。而A0组、A1组、A4组之间在各时间点检测均无显著差异(p＞0.05)。
本实验通过添加无花果多糖到鲫鱼基础饲料中，鲫鱼血液中白细胞的吞噬活性增强、SOD活性也相应得到增强，这表明无花果多糖能很好的激活SOD活性，调节超氧自由基和SOD活性之间的平衡，其中以A2组、A3组效果最佳，尤其是A3组(0.4％)发挥最佳药效。
表11无花果多糖对鲫鱼血清超氧化物歧化酶活性的影响(X±SD)
2.4添加不同剂量的无花果多糖对鲫鱼血清溶菌酶活性的影响
水产动物体内的溶菌酶是一种重要的非特异性防御因子，可以体现病原菌及其他环境因素对鱼体健康的影响。溶菌酶活性是决定吞噬细胞对所吞噬的致病菌能否被杀灭的物质基础之一，可以因机体接触抗原性物质或者免疫刺激剂而上升。
投喂无花果多糖对鲫鱼血清溶菌酶活性的影响结果(表12、图4)。在试验的第7d，检测各组血清溶菌酶活性活性升高，A2组、A3组与A0组差异显著(p＜0.05)；14d时检测，A2组、A3组与A0组相比差异极其显著(p＜0.01)，与A1组、A4组相比差异显著(p＜0.05)，A1组、A4组与对照组差异显著(p＜0.05)；21d时，A2组、A3组血清溶菌酶活性活性达到峰值与A0组相比差异极其显著(p＜0.01)，且A3组优于A2组。21d-35d期间各组溶菌酶活性趋于平稳，。整个试验期间，A2组、A3组与A0组相比差异均极其显著(p＜0.01)，A1组、A4组与对照组差异显著(p＜0.05)。
本实验中随着添加量的增高溶菌酶活性升高，而且溶菌酶活性最高的时候，血液白细胞吞噬活性也最强，当到0.4％时又随着剂量增高而有所抑制，相应的白细胞吞噬活性也降低，映证并补充了植物多糖对溶菌酶活性的激活反应。
表12无花果多糖对鲫鱼血清溶菌酶活性的影响(X±SD)
2.5添加不同剂量的无花果多糖对鲫鱼血液白细胞吞噬活性的影响
鱼类非特异性免疫包括体液免疫和细胞免疫，白细胞的吞噬活性是细胞免疫的一部分。白细胞的吞噬功能是动物非特异性免疫的重要组成部分，因此，通过测定血液中白细胞的吞噬功能，可以反映机体的非特异性细胞免疫状态。血液中的白细胞作为吞噬细胞的一种可以吞噬进入体内的异物，在消化病原微生物的同时可保留有关抗原信息并且将其传递给有关的淋巴细胞，激发机体体液免疫和细胞免疫；另一方面，机体的体液免疫反作用于吞噬活性，当体液免疫分泌的物质升高后，如溶菌酶活性、球蛋白含量升高后，也可以激发机体白细胞吞噬活性的能力。
投喂无花果多糖对鲫鱼血液白细胞吞噬活性的影响结果(见表13、图5)。在试验的第7d，检测A2组、A3组血液白细胞吞噬活性活性升高，且与A0组差异显著(p＜0.05)；14d时，A2组、A3组与A0组相比差异极其显著(p＜0.01)，A3组与A1组、A4组相比差异显著(p＜0.05)。21d时A2组、A3组达到峰值，A3组最大达0.492。21-35d这一阶段，A2组、A3组血液白细胞吞噬活性活性下降，并趋于稳定，且A3组优于A2组，A2组、A3组与A0组相比差异均极其显著(p＜0.01)，与A1组、A4组相比差异显著(p＜0.05)，而A2组与A3组之间无显著差异(p＜0.05)；A0组在各时间点检测均无显著差异(p＞0.05)。
本试验中无花果多糖0.2％和0.4％的添加量均使血液白细胞吞噬活性与对照组相比差异极其显著(P＜0.01)，其中以0.4％的添加量的效果最佳，证明提高机体白细胞吞噬活性是无花果多糖调节鲫鱼非特异性免疫能力的途径之一。
表13无花果多糖对鲫鱼血液白细胞吞噬活性的影响(X±SD)
2.6添加不同剂量的无花果多糖对鲫鱼血液白细胞杀菌活性的影响
白细胞的杀菌活性是鱼类消除病原微生物的最强有力的方式。当病原菌侵入机体时候，首先被吞噬细胞吞噬，再被吞噬细胞所杀灭，是反应动物机体的一种最直接的免疫能力强弱标志之一。
投喂无花果多糖对鲫鱼血液白细胞杀菌指数的影响结果(表14、图6)。试验的第7d，检测A2组、A3组血液白细胞杀菌活性指数降低，杀菌活性升高，且与A0组差异显著(p＜0.05)；14d时，A3组与A0组相比差异极其显著(p＜0.01)，A2组与A0组、A1组、A4组相比差异显著(p＜0.05)，杀菌活性继续升高。21d时检测，A2组白细胞杀菌指数与A0组、A1组、A4组相比差异极其显著(p＜0.01)，与A3组相比差异不显著(p＞0.05)；A4组与A0组相比差异显著(p＜0.05)。在21-35d这一阶段，A2组、A3组血液白细胞杀菌指数趋于稳定，且A2组优于A3组但差异不显著(p＞0.05)；A2组与A0组、A1组、A4组相比差异极其显著(p＜0.01)；A3组与A0组相比差异极其显著(p＜0.01)，与A1组、A4组相比差异显著(p＜0.05)；A4组与A0组相比差异显著(p＜0.05)，A1组与A0组之间差异不显著(p＞0.05)。
在本实验中，0.2％和0.4％组都能很好的促进白细胞杀菌活性的能力，但是剂量是0.8％时候，随着吞噬活性的减弱，其杀菌活性也减弱，对嗜水气单胞菌的抵抗能力也相应减弱。
表14无花果多糖对鲫鱼血液白细胞杀菌指数的影响(X±SD)
2.7添加不同剂量的无花果多糖对鲫鱼嗜水气单胞菌的保护率
嗜水气单胞菌对水产动物具强致病性且对多种抗生素表现出强耐药性，仅依靠化学药物进行治疗该病变得更为困难。本试验添加无花果多糖后，受试鲫鱼对嗜水气单胞菌的保护率升高极其显著增强(P＜0.01)，可能与这无花果多糖能够促进鲫鱼肝脏合成总蛋白的能力以及补体C3的分泌，增强SOD活性和溶菌酶活性，并能提高血液白细胞吞噬活性和杀菌活性等有关。鱼体的非特异性免疫得到全面调节，对嗜水气单胞菌的抵抗力也相应增强，因此存活率也相应提高。
投喂无花果多糖对嗜水气单胞菌保护率影响结果(表15)。对照组在注射后基本上都死亡，而无花果多糖各剂量添加组的鲫鱼都有保护作用，0.4％组多糖达到最高为66％，0.2％的稍微低些为56％。
表15无花果多糖对嗜水气单胞菌保护率的影响
3、讨论
鱼类非特异性免疫系统是鱼类抵抗外界刺激的重要途径之一，本实验研究了无花果多糖在鲫鱼养殖中的应用，当添加剂量为0.2％和0.4％时，鲫鱼血清中的总蛋白和补体C3的含量升高，溶菌酶活性和SOD酶活性增强，血液中白细胞吞噬活性和杀菌活性得到了提高，其中以无花果多糖的用量为饲料量的0.4％w/w时的效果最佳。
综上所述，本发明鱼用免疫调节剂是多糖类物质，安全性好，同时也是一种碳水化合物，可以节省饲料中碳水化合物的用量，特别是作为鱼用饲料添加剂，具有良好的效果，且取材容易，是一种安全有效，成本节约的鱼用免疫调节剂。
Claims (9)
1.无花果多糖在制备鱼用免疫调节剂中的用途；所述的无花果多糖的制备方法为：取无花果，加水至温度75-85℃时，料液比为1∶16-20，提取4-8h；浓缩，加入乙醇至终末浓度为60％沉淀16-20h。
2.根据权利要求1所要的用途，其特征在于：所述的鱼用免疫调节剂具有非特异性免疫调节作用。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的鱼类是有鳞鱼。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的无花果多糖中糖含量不得低于85％w/w。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的无花果多糖的制备方法为：加水至温度80℃，料液比为1∶18，分2次提取共6h；浓缩，加入乙醇至终末浓度为60％沉淀18h。
6.一种鱼用免疫调节剂，它是由有效量的无花果多糖为活性成分，加入可接受的辅料或辅助性成分制备而成；其中，所述的无花果多糖的制备方法为：取无花果，加水至温度75-85℃时，料液比为1∶16-20，提取4-8h；浓缩，加入乙醇至终末浓度为60％沉淀16-20h。
7.根据权利要求6所述的鱼用免疫调节剂，其特征在于：所述的无花果多糖的用量，以辅料重量计，占0.1-0.8％w/w。
8.根据权利要求7所述的鱼用免疫调节剂，其特征在于：所述的无花果多糖的用量，以辅料重量计，占0.2-0.6％w/w。
9.根据权利要求8所述的鱼用免疫调节剂，其特征在于：所述的无花果多糖的用量，以辅料重量计，占0.4％w/w。
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| 戴伟娟等.无花果多糖对小鼠单核吞噬细胞吞噬功能影响的研究.《中医药学刊》.2002,第20卷(第1期),98－99. |
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