CN111358757A - 一种榄香烯纳米脂质体及制备方法 - Google Patents

一种榄香烯纳米脂质体及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种榄香烯纳米脂质体及制备方法，涉及药物制剂领域。其制备方法包括以下步骤：制备含有磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇的磷脂膜；将榄香烯加入到磷脂膜中，混合均匀，得到混合体系1；将混合体系1快速注射到快速搅拌的水中，得到混合体系2；除去混合体系2中残留的有机溶剂，得榄香烯纳米脂质体。本发明降低了榄香烯纳米脂质体粒径，提高了包封率，促进榄香烯纳米颗粒在肿瘤组织的聚集，提高了药效，具有良好的应用前景。

Description

一种榄香烯纳米脂质体及制备方法
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种榄香烯纳米脂质体及制备方法。
背景技术
现在各类抗肿瘤药物在肿瘤治疗中进展飞快，提高抗肿瘤药物在肿瘤组织周围聚集的选择性可明显提高治疗效果。相关研究发现25nm左右大小的低密度脂蛋白(LDL)会选择性聚集在肿瘤组织周围并作为“食物”被肿瘤细胞吞噬，这提示仿造LDL尺寸设计纳米制剂可能是提高抗肿瘤药物选择性聚集在肿瘤组织的一个有效途径。
现有制剂技术中脂质体的颗粒大小往往集中在80-120nm，而制备小于80nm药物脂质颗粒的技术在近30年来却鲜有发展。目前最为广泛应用的声波降解法可制备小至20nm的脂质颗粒，然而该方法却因为诸如易导致脂降解、难以大规模化生产等问题而受到极大限制，因此，发展一种新型的易操作、保持颗粒稳定，并且可以大规模生产的制剂技术是一项艰巨而又迫切的任务。
针对脂质体结构可以发现，脂质体一般由磷脂双分子层组成，而一层膜的厚度约为5nm，则磷脂双分子层的厚度使脂质颗粒的直径至少增加20nm。除此之外，脂质体空腔中还存在水溶液和空气，因此其粒径减小受到了本身结构的限制。如果将脂质体的双层膜结构变成磷脂单分子层，内部直接包裹脂溶性较好的药物，那么一方面整个磷脂纳米颗粒的尺寸将会大大减小，另一方面内部没有水与空气，提高了整个纳米颗粒包载的利用率，但是此方法仍面临制备困难的问题。
临床使用的天然活性产物榄香烯一般指的是β-榄香烯、γ-榄香烯、δ-榄香烯的混合物，其中β-榄香烯为其主要成分。榄香烯或β-榄香烯具有广谱的抗肿瘤活性，包括一些耐药肿瘤细胞；且不易引发肿瘤产生耐药性，甚至可以逆转部分肿瘤细胞的耐药性，比如与顺铂联用，可提高对顺铂耐药的细胞株对顺铂的敏感性；毒性较低，不引起骨髓抑制，并且能提高癌症病人的免疫功能。但榄香烯的溶解度小，几乎不溶于水，影响其广泛应用。
中国专利申请200410082866.8公开了一种榄香烯脂质体及其制备方法，其中包括步骤：取0.60g大豆磷脂、0.2g胆固醇、0.075g榄香烯、适量VE加10ml氯仿溶解，置于150ml茄形瓶中，减压蒸发氯仿，在瓶内壁形成一层脂质薄膜；加入5ml氯仿，10ml乙醚，然后加入15ml榄香烯的pH7.4磷酸盐缓冲液中，浴式超声3分钟使形成均一单相体系，减压蒸发去除氯仿乙醚至凝胶形成，继续减压蒸发5～10分钟，涡旋振荡至水性悬浊液即脂质体形成。该发明靶向效果明显优于普通注射液，利于疾病的治疗。但是超声波分散法制备脂质体更适合于水溶性药物脂质体的制备，虽然能制备脂质体，但所制得的脂质体包封率不高，制备量极小。
中国专利申请200910058074.X公开了一种制备β-榄香烯脂质体的方法及该方法制备得到的β-榄香烯脂质体。此方法联合采用乙醇注入-挤压-冷冻干燥法制备β-榄香烯脂质体，乙醇注入与挤压法联用，制得的β-榄香烯脂质体粒径更均匀，包封率更高，将β-榄香烯脂质体混悬液冷冻干燥，制成冻干粉，增加了脂质体的稳定性，防止了其在液体中的泄漏，但是此方法制得的β-榄香烯脂质体平均粒径为230nm左右，不能达到对粒径的要求，进而无法实现使抗肿瘤药物选择性聚集在肿瘤组织的效果。
临床应用中经常将榄香烯或β-榄香烯制成乳剂或脂质体的形式，但是它们的粒径通常较大，颗粒往往大于120nm，目前减小榄香烯制成的纳米颗粒粒径大小的方法鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种榄香烯纳米脂质体及制备方法，此方法简单易操作，并能有效降低榄香烯的纳米颗粒粒径，有助于避免体内肝脾网状内皮系统的吞噬，并增强榄香烯纳米脂质体在肿瘤组织附近的选择性富集，提高榄香烯纳米脂质体的体内活性。
为了实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：
本发明提供一种榄香烯纳米脂质体的制备方法，包括以下步骤：
S1、按照摩尔百分比制备含磷脂45％-100％、胆固醇0％-45％、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇0％-50％的磷脂膜；
S2、将榄香烯加入到步骤S1所得的磷脂膜中，混合均匀，得到混合体系1；
S3、将步骤S2得到的混合体系1注射到搅拌的水中，得到混合体系2；
S4、除去步骤S3所得混合体系2中残留的有机溶剂，得榄香烯纳米脂质体。
其中，
所述榄香烯优选为β-榄香烯。
所述步骤S1中，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的分子量为1000-5000，优选为2000。
步骤S1中，所述磷脂膜的制备方法为：将磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)溶于有机溶剂，减压旋干，并继续在真空条件下放置，直到机溶剂完全挥发，得磷脂膜。
其中，减压旋干的温度为20℃-50℃。
所述步骤S1中，磷脂膜按照以下摩尔百分比构成：磷脂55％、胆固醇45％；或磷脂100％；或磷脂45％、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇10％、胆固醇45％。
所述步骤S1中，磷脂为1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)和蛋黄磷脂(PC98T)中的一种或多种，优选为POPC或PC98T中的任一种。
所述步骤S2中，有机溶剂为二氯甲烷、甲醇、乙醇、四氢呋喃或异丙醇中的一种或多种，优选为乙醇。
所述步骤S2中，榄香烯与磷脂膜的摩尔比1:10-10:1，优选为1:1。
所述步骤S3中，混合体系1和水的体积比为1:1-1:20，优选为1:9。
所述步骤S3中，所述的注射的速度为400-3000μL/s，优选为833μL/s。
所述步骤S3中，所述的快速搅拌的速度为300-2000r/min，优选为500r/min。
所述步骤S4中，去除有机溶剂的方式包括但不限于减压旋干、透析交换、超滤等方法。
此外，本发明还提供由上述的制备方法制备的榄香烯纳米脂质体，由单层脂质膜包裹，脂质体粒径大小为20-148nm。
本发明的有益效果是：
(1)本发明制备的榄香烯纳米脂质体颗粒直径小，能够提高榄香烯在水中分布的均匀度；有助于避免体内肝脾网状内皮系统的吞噬；促使榄香烯在肿瘤组织附近选择性富集；提高榄香烯的体内活性；
(2)本发明制备的榄香烯纳米脂质体包封率好；
(3)本发明制备方法工艺简单、适合工业化生产。
附图说明
图1为β-榄香烯纳米脂质体制剂的体内药效活性对比图，其中，纵坐标为肿瘤重量，百分值标记代表肿瘤生长抑制率；
图2为榄香烯纳米脂质体制剂的体内药效活性对比图，其中，纵坐标为肿瘤重量，百分值标记代表肿瘤生长抑制率；
图3为β-榄香烯纳米脂质体或榄香烯纳米脂质体给药后小鼠体重的变化情况，其中，纵坐标为小鼠体重。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下属实施例中榄香烯和β-榄香烯由石药集团远大(大连)制药有限公司提供，货号分别为190420、171102。
实施例1
S1、取3.345mL的32.89mM POPC的氯仿溶液，以及9mL的10mM胆固醇的氯仿溶液，20℃-50℃条件下减压旋干，继续在真空条件下放置，直到有机溶剂完全挥发，得磷脂膜；
S2、取50mM的榄香烯的乙醇溶液，使榄香烯和磷脂膜的摩尔比为1：1，加入到上述的磷脂膜中，混合均匀，得混合体系1；
S3、取12mL的样品瓶，往其中加入大小合适的搅拌子，再加入9mL水；放置在搅拌器上搅拌，调节搅拌速度至500r/min；吸取1mL混合体系1，以833μL/s的速度注射到搅拌的水中，注射完毕后继续搅拌5min，得混合体系2。
S4、将10mL的混合体系2导入50mL梨形瓶中，于旋转蒸发仪中在20℃-40℃下减压旋蒸，除掉乙醇，然后加入1mL 10×PBS溶液，得榄香烯纳米脂质体制剂。
实施例2
S1、取6.082mL的32.89mM POPC的氯仿溶液，在20℃-50℃条件下减压旋干，继续在真空条件下放置，直到有机溶剂完全挥发，得磷脂膜；
S2、取50mM的榄香烯的乙醇溶液，使榄香烯和磷脂膜的摩尔比为1：1，加入到上述磷脂膜中，混合均匀，得混合体系1；
S3、取12mL的样品瓶，往其中加入大小合适的搅拌子，再加入9mL水；放置在搅拌器上搅拌，调节搅拌速度至500r/min；吸取1mL混合体系1，以833μL/s的速度注射到搅拌的水中，注射完毕后继续搅拌5min，得混合体系2。
S4、将10mL的混合体系2导入50mL梨形瓶中，于旋转蒸发仪中在20℃-40℃下减压旋蒸，除掉乙醇，然后加入1mL 10×PBS溶液，得榄香烯纳米脂质体制剂。
实施例3
S1、取6.082mL的25mg/mL蛋黄磷脂的氯仿溶液，在20℃-50℃条件下减压旋干，继续在真空条件下放置，直到有机溶剂完全挥发，得磷脂膜；
S2、取50mM的榄香烯的乙醇溶液，使榄香烯和磷脂膜的摩尔比为1：1，加入到上述的磷脂膜中，使二者混合均匀，得混合体系1；
S3、取12mL的样品瓶，往其中加入大小合适的搅拌子，再加入9mL水；放置在搅拌器上搅拌，调节搅拌速度至500r/min；吸取1mL混合体系1，以833μL/s的速度注射到搅拌的水中，注射完毕后继续搅拌5min，得混合体系2。
S4、将10mL的混合体系2导入50mL梨形瓶中，于旋转蒸发仪中在20℃-40℃下减压旋蒸，除掉乙醇，然后加入1mL 10×PBS溶液，得榄香烯纳米脂质体制剂。
实施例4
S1、取6.082mL的32.89mM POPC的氯仿溶液，在20℃-50℃条件下减压旋干，继续在真空条件下放置，直到有机溶剂完全挥发，得磷脂膜；
S2、取50mM的β-榄香烯的乙醇溶液，使β-榄香烯和磷脂膜的摩尔比为1：1，加入到上述的磷脂膜中，混合均匀，得混合体系1；
S3、取12mL的样品瓶，往其中加入大小合适的搅拌子，再加入9mL水；放置在搅拌器上搅拌，调节搅拌速度至500r/min；吸取1mL混合体系1，以833μL/s的速度注射到搅拌的水中，注射完毕后继续搅拌5min，得混合体系2。
S4、将10mL的混合体系2导入50mL梨形瓶中，于旋转蒸发仪中在20℃-40℃下减压旋蒸，除掉乙醇，然后加入1mL 10×PBS溶液，得β-榄香烯纳米脂质体制剂。
实施例5
S1、取2.8445mL的31.64mM DSPC的氯仿溶液，1.122mL的8.91MmDSPE-PEG-2000的氯仿溶液，以及10mL 10mM胆固醇的氯仿溶液，混合均匀后，在20℃-50℃条件下减压旋干，继续在真空条件下放置，直到有机溶剂完全挥发，得磷脂膜；
S2、取50mM的β-榄香烯的二氯甲烷溶液，使β-榄香烯和磷脂膜的摩尔比为1：1，加入到上述的磷脂膜中，混合均匀，得混合体系1；
S3、取12mL的样品瓶，往其中加入大小合适的搅拌子，再加入9mL水；放置在搅拌器上搅拌，调节搅拌速度至500r/min；吸取1mL混合体系1，以833μL/s的速度注射到搅拌的水中，注射完毕后继续搅拌5min，得混合体系2。
S4、将10mL的混合体系2导入50mL梨形瓶中，于旋转蒸发仪中在20℃-40℃下减压旋蒸，除掉乙醇，然后加入1mL 10×PBS溶液，得β-榄香烯纳米脂质体制剂。
实施例6
S1、取6.082mL的25mg/mL蛋黄磷脂的氯仿溶液，在20℃-50℃条件下减压旋干，继续在真空条件下放置，直到有机溶剂完全挥发，得磷脂膜；
S2、取50mM的β-榄香烯的乙醇溶液，使β-榄香烯和磷脂膜的摩尔比为1：1，加入到上述的磷脂膜中，混合均匀，得混合体系1；
S3、取12mL的样品瓶，往其中加入大小合适的搅拌子，再加入9mL水；放置在搅拌器上搅拌，调节搅拌速度至500r/min；吸取1mL混合体系1，以833μL/s的速度注射到搅拌的水中，注射完毕后继续搅拌5min，得混合体系2。
S4、将10mL的混合体系2导入50mL梨形瓶中，于旋转蒸发仪中在20℃-40℃下减压旋蒸，除掉乙醇，然后加入1mL 10×PBS溶液，得β-榄香烯纳米脂质体制剂。
实施例7
S1、取6.082mL的32.89mM POPC和PC98T混合物的氯仿溶液，POPC和PC98T的摩尔比为2:1，在20℃-50℃条件下减压旋干，继续在真空条件下放置，直到有机溶剂完全挥发，得磷脂膜；
S2、取50mM的β-榄香烯的乙醇溶液，使β-榄香烯和磷脂膜的摩尔比为1：1，加入到上述的磷脂膜中，混合均匀，得混合体系1；
S3、取12mL的样品瓶，往其中加入大小合适的搅拌子，再加入9mL水；放置在搅拌器上搅拌，调节搅拌速度至500r/min；吸取1mL混合体系1，以833μL/s的速度注射到搅拌的水中，注射完毕后继续搅拌5min，得混合体系2。
S4、将10mL的混合体系2导入50mL梨形瓶中，于旋转蒸发仪中在20℃-40℃下减压旋蒸，除掉乙醇，然后加入1mL 10×PBS溶液，得β-榄香烯纳米脂质体制剂。
实施例8-15
与实施例4不同的是，步骤S3中，实施例8-15的搅拌速度和注射速度分别如表1所示，其余皆相同。
表1实施例8-15的搅拌速度和注射速度
Figure BDA0002410283530000071
实施例16
与实施例5不同的是，将DSPE-PEG-2000的氯仿溶液替换成DSPE-PEG-1000的氯仿溶液，其余皆相同。
实施例17
与实施例5不同的是，将DSPE-PEG-2000的氯仿溶液替换成DSPE-PEG-5000的氯仿溶液，其余皆相同。
实施例18
与实施例7不同的是，用1，2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺代替POPC，其余皆相同。
实施例19
与实施例4不同的是，使用β-榄香烯的甲醇溶液，其余皆相同。
实施例20与实施例4不同的是，使用β-榄香烯的四氢呋喃溶液，其余皆相同。
实施例21
与实施例4不同的是，β-榄香烯和磷脂膜的摩尔比为1：10，其余皆相同。
实施例22
与实施例4不同的是，β-榄香烯和磷脂膜的摩尔比为10：1，其余皆相同。
实施例23
与实施例4不同的是，步骤S3中加入1mL水，其余皆相同。
实施例24
与实施例4不同的是，步骤S3中加入20mL水，其余皆相同。
对比例1
与实施例4不同的是，步骤S3中加入25mL水，其余皆相同。
对比例2
与实施例4不同的是，β-榄香烯和磷脂膜的摩尔比为1：15，其余皆相同。
对比例3
与实施例4不同的是，β-榄香烯和磷脂膜的摩尔比为15：1，其余皆相同。
对比例4
与实施例4不同的是，磷脂膜含磷脂40％、胆固醇50％、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇制备的磷脂膜10％。
对比例5
与实施例4不同的是，含磷脂50％、胆固醇50％、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇制备的磷脂膜10％。
检测结果
实施例1-24的检测结果如表2所示。
表2.实施例1-24的检测结果
Figure BDA0002410283530000081
Figure BDA0002410283530000091
对比例1-5的检测结果如表3所示。
表2.对比例1-5的检测结果
Figure BDA0002410283530000092
由实施例8-15可以看出，注射器注射速度以及水溶液搅拌速度对纳米颗粒大小\是否为单层脂质膜以及包封率具有重要影响，其中注射速度为833μL/s，水溶液的搅拌速度为500r/min时效果最佳。实施例14和15转速和搅拌速度太高，但是无法达到某些低转速的实验效果，考虑到操作和成本问题，不宜应用到工艺生产。
实施例16、17表明，替换DSPE-PEG的分子量会使得最终颗粒的直径相差较大，使用DSPE-PEG-2000效果最佳。
对比例1可以看出，水的用量会影响所得纳米脂质体的性质，对比例2、3表明，榄香烯和磷脂膜的摩尔比过大或过小，都会使所得纳米脂质体包封率降低，对比例4、5则表明，磷脂膜的组成会影响所得纳米脂质体的粒径和包封率。
实验例体内药效研究结果
选取体重为18-22g并成功接种H22肝癌肿瘤细胞的雌性ICR小鼠(来自上海思捷实验动物中心)，随机分成12组，每组6只，分组情况如表3所示。其中模型对照组注射与给药相同体积的生理盐水溶液；紫杉醇和β-榄香烯、榄香烯原料药的溶解溶剂为DMF:吐温80:5％生理盐水＝10:2:88(V:V:V)。
下表中市售药剂分别购自：紫杉醇购自四川太极制药有限公司，货号为17100021；β-榄香烯原料药由石药集团远大(大连)制药有限公司提供，货号为171102；榄香烯原料药由石药集团远大(大连)制药有限公司提供，货号为190420；β-榄香烯注射液由石药集团远大(大连)制药有限公司提供，货号为170906；榄香烯乳注射液购自大连华立金港药业有限公司，货号为1811261。
表3.小鼠分组情况
Figure BDA0002410283530000101
给药方式为1天给药一次，连续给药21天。实验结束后，处死老鼠并手术剥离肿瘤称重。
通过以下公式计算肿瘤生长抑制率：
Figure BDA0002410283530000111
实验结果表明，POPC包裹的β榄香烯体内药效活性最好，抑瘤率达到(10mg/kg，70％)，优于两天给药一次的阳性对照药紫杉醇(6mg/kg，抑瘤率64.3％)、β-榄香烯注射液(10mg/kg，抑瘤率62.7％)以及榄香烯乳液(10mg/kg，57.1％)。而POPC或PC98T包裹的β-榄香烯或榄香烯的体内药效活性均优于未包裹的β-榄香烯或榄香烯原料药或其制剂，说明粒径的减小促进了β-榄香烯在肿瘤组织附近选择性富集、提高β-榄香烯的体内活性。
同时，POPC包裹的β-榄香烯体内药效活性(10mg/kg，70％)也优于POPC包裹的榄香烯(10mg/kg，62.9％)。
再者，以PC98T为磷脂包裹材料的β榄香烯(10mg/kg，66.67％)或榄香烯(10mg/kg，60.60％)在体内药效活性整体表现均稍弱于POPC包裹的β-榄香烯(10mg/kg，70％)或榄香烯(10mg/kg，62.9％)，但优于原有上市制剂。
此外，紫杉醇显著降低了小鼠体重，而β-榄香烯纳米脂质体或榄香烯纳米脂质体则在发挥抗肿瘤作用时对小鼠体重没有显著影响，表明β-榄香烯纳米脂质体或榄香烯纳米脂质体的毒性小于紫杉醇。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种榄香烯纳米脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、按照摩尔百分比制备含磷脂45％-100％、胆固醇0％-45％、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇0％-10％的磷脂膜；
S2、将榄香烯加入到步骤S1所得的磷脂膜中，混合均匀，得到混合体系1；
S3、将步骤S2得到的混合体系1注射到搅拌的水中，得到混合体系2；
S4、除去步骤S3所得混合体系2中残留的有机溶剂，得榄香烯纳米脂质体；
所述榄香烯优选为β-榄香烯、γ-榄香烯、δ-榄香烯中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述榄香烯为β-榄香烯。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的分子量为1000-5000。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，磷脂膜按照以下摩尔百分比构成：
磷脂55％和胆固醇45％；
或磷脂100％；
或磷脂45％、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇10％和胆固醇45％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，磷脂为1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，榄香烯与磷脂膜的摩尔比为1:10-10:1。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，混合体系1和水的体积比为1:1-1:20。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，注射的速度为400-3000μL/s，搅拌的速度为300-2000r/min。
9.一种由权利要求1-8任一项所述的制备方法制备的榄香烯纳米脂质体。
10.根据权利要求9所述的榄香烯纳米脂质体，其特征在于，所述榄香烯纳米脂质体由单层脂质膜包裹，脂质体粒径大小为20-148nm。
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