CN101461793A - β-榄香烯脂质体及冻干粉的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备β－榄香烯脂质体的方法及该方法制备得到的β－榄香烯脂质体。本发明方法联合采用乙醇注入－挤压－冷冻干燥法制备β－榄香烯脂质体，乙醇注入与挤压法联用，制得的β－榄香烯脂质体粒径更均匀，包封率更高，将β－榄香烯脂质体混悬液冷冻干燥，制成冻干粉，增加了脂质体的稳定性，防止了其在液体中的泄漏，制得的β－榄香烯脂质体平均粒径为230nm左右，符合肝靶向的要求，通过药效试验证明，本发明β－榄香烯脂质体对肝癌的治疗能发挥其最大功效，其对肝组织靶向性最强，还具有一定缓释作用，药效明显，为临床治疗肝癌提供了一种新的选择。
Description
技术领域
本发明涉及β-榄香烯脂质体及冻干粉的制备方法，属医药领域。
背景技术
β-榄香烯(β-elemene)是从中药温莪术(Curcuma wenyujin Y.H.Chen etC.Ling)中提取分离得到的单体，是强脂溶性药物，目前已开发出口服乳剂与注射用乳剂用于临床治疗恶性肿瘤。β-榄香烯脂溶性大，刺激血管和组织，用药时出现疼痛、发热等症状，影响在临床上的推广应用，将β-榄香烯制成脂质体注射液，可降低对注射部位的刺激，起到缓释和靶向作用。
脂质体(liposomes)的载体材料磷脂类和胆固醇类，具有类似生物膜的双分子层结构。脂质体根据其结构和所包含的双层磷脂膜层数，可分为单室脂质体和多室脂质体。凡由一层类脂质双分子层构成者称为单室脂质体，它又分大单室脂质体(LUVs，粒径在0.1-1um之间)和小单室脂质体(SUVs，粒径0.02-0.08um，亦称纳米脂质体)。由多层类脂质双分子层构成的称为多室脂质体(MLVs)，粒径在1-5um之间。单室脂质体中水溶性药物的溶液包封于类脂质双分子层所形成的空腔中，脂溶性药物则分散于双分子层中。多室脂质体中有几层脂质双分子层将被包含有水溶性药物的水膜分开，形成不均匀的聚合体，脂溶性药物则分散于几层双分子层中。脂质体的制备方法较多，如薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、注入法和超声波分散法、pH梯度法、前体脂质体法等。凡经超声波分散的脂质体混悬液，绝大部分为单室脂质体；LUVs通过膜滤后也可得到SUVs。即使相同的原料药物制备成脂质体，采用不同的制备方法，制备的脂质体的理化性质不同，药效也不相同。
载药脂质体具有细胞亲和性和靶向性，载药脂质体进入体内可被巨噬细胞作为外界异物而吞噬，脂质体以静脉给药时，能选择地集中于网状内皮系统，70％-89％集中于肝、脾，可用于治疗肝肿瘤和防止肿瘤扩散转移。(崔福德，药剂学，人民卫生出版社，2008年1月第6版)。脂质体的粒径大小直接影响药物的生物利用度，大的脂质体缺乏血管通透性，不能通过肝血管的狄氏间隙，小于150nm的脂质体不易被肝、脾所摄取，因此应严格控制脂质体的大小范围100～400nm之间(杨秀芬.药物脂质体的稳定性[J].国外医学：药学分册，1990，17(1)：19-22.)。
目前报道的β-榄香烯脂质体具有抗肿瘤、免疫增强等作用。如：高天慧等，脂质体瘤苗抗小鼠H22腹水型肝癌作用研究，胃肠病学和肝病学杂志，2005年第14卷第04期，报道了β-榄香烯对脂质体瘤苗抗小鼠H22肝癌的免疫增强作用；雷冬梅等，榄香烯对人胃腺癌BGC-823细胞中HPA表达的影响，中国现代医生-2008年第24期，报道了榄香烯对人胃腺癌BGC-823细胞中HPA表达的影响的研究。作者认为榄香烯通过降低胃腺癌细胞HPA蛋白表达水平，从而遏制了肿瘤血管、淋巴管转移，为肿瘤靶向治疗提供了理论基础和实验依据；朱永坚等，纳米脂质体承载榄香烯诱导C6胶质瘤细胞凋亡的实验研究，中国中西医结合杂志，2008年，第7期，报道了榄香烯具有促进C6胶质瘤细胞凋亡和Caspase-3蛋白表达的作用，经纳米脂质体承载后榄香烯的这种作用有增强的趋势。吴琳华等，β-榄香烯脂质体在大鼠体内的药动学研究，中国中医药科技2007年11月第14卷第6期，指出在进行体内分布实验之前还不能得到有关此脂质体是否具有靶向及缓释作用的结论。宋笑丹等，β-榄香烯脂质体在大鼠体内的组织分布，中国药学杂志，2007年第42卷第19期，与榄香烯注射液相比，β-榄香烯脂质体在大鼠体内的分布特性有不同程度的改变，β-榄香烯脂质体及榄香烯注射液在大鼠的心、脾、肾组织中分布具有显著性差异。宋笑丹等，β-榄香烯脂质体的制备及其在大鼠体内的组织分布，中国新药与临床杂志，2007年第26卷第10期，采用薄膜分散法制备β-榄香烯脂质体，β-榄香烯脂质体在肝、脾、肾组织中分布相对较多，在心脏中分布较少，β-榄香烯脂质体在大鼠体内的分布特性有不同程度的改变，可提高疗效，降低心脏毒性。
专利文献及非专利文献报道的β-榄香烯脂质体制备方法为单用乙醇注入法、反相蒸发法、挤出法、机械法等或者联用超声-挤压过滤法、薄膜超声分散法等，其中，超声波分散法或薄膜超声分散法制备脂质体更适合于水溶性药物脂质体的制备，虽然能制备脂质体，但所制得的脂质体包封率不高，制备量极小；薄膜分散法吹膜时有团块凝结，较厚，抽真空时起泡太少，水合时粘在试管壁上，颗粒大，成块，挤压滤过也困难，影响其制备收得率。另外，由于脂质体的粒径大小直接影响其生物利用度，采用目前公开的方法制备的脂质体多针对多个靶向器，不能确定其针对哪些器官有较佳的效果。如针对β-榄香烯固体脂质纳米粒的报道：王艳芝等，RP-HPLC法测定固体脂质纳米粒中β-榄香烯的含量，沈阳药科大学学报，2005年第22第4期；固体脂质纳米粒中β-榄香烯含量的气相色谱法测定，郑州大学学报，2008年第43卷第1期，报道了固体脂质纳米粒中β-榄香烯的含量和包封率的测定方法研究。该研究人员还报道了工艺因素对超声-挤压过滤法制备β-榄香烯固体脂质纳米粒(SLN)平均粒径的影响的研究。其方法为，以超声-挤压过滤法制备β-榄香烯SLN，研究超声强度、超声时间以及制备温度等因素对其平均粒径的影响。结果表明，绝大多数β-榄香烯脂质体的平均粒径小于150nm。其平均粒径随超声时间的延长和制备温度的提高而有所下降，但是受持续超声时间的影响较小；考察的制剂中，在超声强度为400W、超声温度为80℃、超声时间为6min条件下制备的β-榄香烯SLN的平均粒径最小。该研究的结论认为，采用超声-挤压过滤法可制备β-榄香烯SLN，超声强度、总体超声时间以及温度等是影响其平均粒径的主要工艺因素。刘红梅等，薄膜-超声分散法制备β-榄香烯固体脂质纳米粒，中草药2008年第39卷第2期，则报道采用薄膜-超声分散法制备，并以包封率为指标采用正交设计法优化β-榄香烯固体脂质纳米粒的制备工艺的研究。结果所得β-榄香烯固体脂质纳米粒的最佳制备条件是β-榄香烯20μL，卵磷脂90mg，硬脂酸90mg，2.5％聚山梨酯805mL，2.5％泊洛沙姆1885mL。该研究结论认为该处方可用于β-榄香烯固体脂质纳米粒的制备，工艺可行。申请号：02117219.6，发明名称：榄香烯注射剂及其制备方法和用途，涉及β-榄香烯纳米脂质体剂型，前体脂质体剂型，长循环脂质体剂型，长循环纳米脂质体剂型，纳米微乳剂型，静脉乳剂型，脂质纳米球剂型和脂肪乳剂型。其制备方法是用总倍半萜类含量≥70％的从植物中提取的提取物作为原料，添加表面活性剂，利用旋转蒸发仪成膜或CO2临界或超临界方法来混合均匀，添加注射用水，进行高压均质化处理和/或超声波处理，一直处理到获得分散相平均粒径≤100nm的稳定水性分散体为止，从而制得注射剂，其中提取物与表面活性剂的重量比是0.5-1.5:3.5-6.0，注射剂总倍半萜烯类的最终浓度为1～10mg/ml。
杜霞等，β-榄香烯脂质体的制备方法及质量研究，中国医院药学杂志，2007年第27卷第12期，报道了通过测定包封率，正交设计优选β-榄香烯脂质体制备工艺，将一定比例的卵磷脂和胆固醇溶于氯仿内，置于旋转蒸发器中，减压回收氯仿成膜。另取pH磷酸盐缓冲液适量，置于成膜的梨形烧瓶中，旋转将膜洗下，超声处理10min。将一定量的β-榄香烯样品与等量的无水乙醇稀释后，加入到超声后的溶液中继续超声40min，该方法是将薄膜分散法与超声分散法联合使用，制备的脂质体的粒径是152.3nm。
黄汉昌等，β-榄香烯脂质体的制备工艺研究，中草药，2006年第37卷第12期，报道确定了β-榄香烯脂质体较佳的配方组成和制备方法，对薄膜水化(TFH)、逆相蒸发(REV)和REV结合高压挤压法制备β-榄香烯脂质体的方法进行了比较，优选出较优的制备方法；光子相关衍射法测量β-榄香烯脂质体的粒径；气相色谱法测定包封率。其结果表明，薄膜水化法制备的β-榄香烯脂质体的包封率大于逆相蒸发法脂质体的包封率，但该法不易于批量生产。逆相蒸发法脂质体经高压挤压后在一定挤压程度内，粒径减小、包封率和载药量增加。
综上可知，不同的制备方法制备的脂质体的粒径、包封率等理化性质是不同的，更由于其中药物的复杂药效，决定了制备的脂质体具有多种药效和不同的靶向性。目前尚无β-榄香烯脂质体用于主要用于肝靶向的报道，也没有制备成这种特定药效的β-榄香烯脂质体的制备方法的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一种主要用于肝组织靶向的β-榄香烯脂质体的制备方法。
本发明提供了β-榄香烯脂质体的制备方法，它包括下述步骤：
a、取磷脂、胆固醇、β-榄香烯，其中β-榄香烯与磷脂的重量比为：1∶(0.7-4.7)，磷脂与胆固醇的摩尔比为(40-80)∶(60-20)；加无水乙醇溶解，以注射器注入磷酸盐缓冲溶液中，振荡；
b、通过挤压器挤压，得脂质体混悬液，脂质体为大单室脂质体。
a步骤所述的β-榄香烯与磷脂的重量比为：1∶2.7，磷脂与胆固醇的摩尔比为55∶45；a步骤中磷酸盐缓冲溶液与磷脂、胆固醇、β-榄香烯的无水乙醇溶解物的体积比与为：14∶1；所述的磷脂为卵磷脂、大豆磷脂。进一步优选地，所述的磷脂为蛋黄卵磷脂。
其中，所述的b步骤中挤压过程采用挤压器挤压，400nm滤膜一次，200nm滤膜二次，氮气压力为2Mpa。
其中，a步骤所述的β-榄香烯的提取方法为：采用G-排式同步精馏装置进行多排式同步精馏取收集到的馏份，加入一条精密分馏柱下的烧瓶内进行精密分馏，再进行二次分离；所得的馏份为原料进行二次硅胶柱层析，干法装柱；用石油醚30～60℃进行洗脱，去溶剂，制得重量百分含量为98.0％以上的β-榄香烯。
本发明还提供了一种β-榄香烯脂质体冻干粉的制备方法，它是由上述制备方法制备得到的脂质体混悬液，加乳糖、维生素E，进行冷冻干燥，将冻干粉无菌分装，即得。
其中，c步骤所述的乳糖、维生素E的用量与β-榄香烯的重量配比为：
β-榄香烯 2-16份、乳糖 20-150份、维生素E 0.1-6.0份。
进一步优选地，c步骤所述的乳糖、维生素E的用量与β-榄香烯的重量配比为：
β-榄香烯 8.74份、乳糖 71.52份、维生素E 0.94份。
其中，c步骤所述的冷冻干燥的条件为：预冻温度为-45℃，预冻时间为6小时，开始抽真空，并升温至-40℃，保持8小时；再升温至-30℃，保持6小时；升温至-20℃，保持6小时；升温至-10℃，保持4小时；升温至0℃，保持4小时；升温至15℃，保持3小时；升温至30℃，保持3小时。
其中，a步骤所述的β-榄香烯的提取方法为：采用G-排式同步精馏装置进行多排式同步精馏取收集到的馏份，加入一条精密分馏柱下的烧瓶内进行精密分馏，再进行二次分离(β-榄香烯含量为93.0％以上)。所得的馏份为原料进行二次硅胶柱层析，干法装柱。用石油醚(30～60℃)进行洗脱，去溶剂，制得98.0％以上的β-榄香烯。
本发明还提供了上述方法制备的β-榄香烯脂质体冻干粉，其中β-榄香烯脂质的平均粒径为150nm～300nm；包封率为90％-96％。进一步优选地，β-榄香烯脂质的平均粒径为218nm-262nm；更进一步优选地，β-榄香烯脂质的平均粒径为240nm-262nm。
本发明方法制备的脂质体属于大单室脂质体，用于肝靶向给药。本发明方法联合采用乙醇注入-挤压-冷冻干燥法制备β-榄香烯脂质体，乙醇注入与挤压法联用，制得的β-榄香烯脂质体粒径更均匀，包封率更高，将β-榄香烯脂质体混悬液冷冻干燥，制成冻干粉，增加了脂质体的稳定性，防止了其在液体中的泄漏，制得的β-榄香烯脂质体平均粒径为230nm左右，符合肝靶向的要求；三批试制样品平均包封率达93.60％，一次性制备量为100g，收得率平均95.66％，高于目前报道的β-榄香烯的制备方法，且通过药效试验证明，本发明β-榄香烯脂质体对肝癌的治疗能发挥其最大功效，其对肝组织靶向性最强，还具有一定缓释作用，药效明显，为临床治疗肝癌提供了一种新的选择。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
具体实施方式
实施例1 本发明β-榄香烯脂质体的制备
取卵磷脂16.61g、胆固醇6.91g、β-榄香烯8.74g，加乙醇50ml溶解，以注射器缓缓注入磷酸盐缓冲溶液(pH6.8，油水体积比为1∶14)中，振荡40分钟，再通过挤压器，400nm滤膜一次，200nm滤膜二次，氮气压力约2Mpa，得脂质体混悬液。
本发明方法可使用
挤压器(加拿大北方脂质体公司制造)，也可以采用目前市售的其它挤压器。
实施例2 本发明脂质体冻干粉的制备
取所得脂质体混悬液加乳糖71.52g、维生素E 0.94g，按以下条件进行冷冻干燥：预冻温度为-45℃，预冻时间为6小时，开始抽真空，并升温至-40℃，保持8小时；再升温至-30℃，保持6小时；升温至-20℃，保持6小时；升温至-10℃，保持4小时；升温至0℃，保持4小时；升温至15℃，保持3小时；升温至30℃，保持3小时。将冻干粉无菌分装，即得。
实施例3 β-榄香烯的制备
采用G-排式同步精馏装置进行多排式同步精馏取收集到的馏份，加入一条精密分馏柱下的烧瓶内进行精密分馏，再进行二次分离(β-榄香烯含量为93.0％以上)。所得的馏份为原料进行二次硅胶柱层析，干法装柱。用石油醚(30～60℃)进行洗脱，去溶剂，制得纯度大于98.0％的β-榄香烯。
进一步详细的制备β-榄香烯的工艺为：
取莪术挥发油，采用G-排式同步精馏装置进行多排式同步精馏，真空度为1～3HHmg，收集柱温为78～88℃的馏份，取收集到的馏份，加入一条精密分馏柱下的烧瓶内进行精密分馏，精密分馏柱内以2.5mm×2.5mmQ型不锈钢为填料，真空度为1～3HHmg，收集柱温为90～110℃的馏份(β-榄香烯含量为93％以上)。按以上条件进行二次分离，真空度为2～5，温度范围为86～93℃，分馏比为5：1或4：1，反应时间为10小时，最佳条件为真空度2，分馏比5：1，反应时间10小时，三个馏份，86～88℃、89～90℃及91～93℃，β-榄香烯主要处于89～90℃的馏份中，接收89～90℃的馏分。再同法操作，重新进行一次，也收集89～90℃的馏分，其中精馏柱高1.4m，直径6cm，内装用120目不锈钢卷3mm×3mm空心圆柱体为填料，塔板数为N＝40。所得的馏份为原料进行柱层析。玻璃柱长100cm，直径10cm，用115～125℃活化1.5小时后的硅胶(薄层层析硅胶H，粒度10～15um)2kg，冷后干法装柱。用石油醚(30～60℃)进行洗脱，每接收200ml为一序号。收集No.33～56洗脱液(收得率6％)，去溶剂，经鉴定为β-榄香烯及γ-榄香烯。将所得产品再上柱，收集No.33～56洗脱液，去溶剂，即得。
实施例4 本发明脂质体冻干粉的制备
取所得脂质体混悬液加乳糖20g、维生素E 0.1g，按实施例2的方法制备成脂质体冻干粉。
实施例5 本发明脂质体冻干粉的制备
取所得脂质体混悬液加乳糖150g、维生素E 6g，按实施例2的方法制备成脂质体冻干粉。
实施例6 本发明脂质体及制备工艺的筛选试验
一、辅料的选择
不同的磷脂如卵磷脂、大豆磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱等的质量对脂质体包封率及稳定性的影响较大，国内脂质体的制备多用大豆磷脂，不稳定。蛋黄卵磷脂纯度高，经试验预试，用注入法制得β-榄香烯脂质体混悬液，室温下放置15天较稳定。确定用蛋黄卵磷脂，符合卫生部药品标准二部第6册卵磷脂标准。胆固醇为上海伯奥生物科技有限公司生产，符合卫生部药品标准二部第6册胆固醇标准。β-榄香烯脂质采用实施例3的方法制备。
采用乙醇注入法，按处方比例分别以卵磷脂和大豆磷脂制备β-榄香烯脂质体混悬液，所得脂质体质量及在室温下放置15天后质量变化情况如下表：
从结果可以看出，制备时β-榄香烯脂质体质量：以卵磷脂制备的β-榄香烯脂质体，其在包封率和氧化指数较以大豆磷脂制备的脂质体质量更优，放置15天后，以卵磷脂制备的β-榄香烯脂质体包封率明显降低，氧化指数明显升高，即质量明显下降，表明以卵磷脂制备的β-榄香烯脂质体质量较优，稳定性较好。
二、制备方法的筛选
脂质体常用的制备方法有薄膜分散法、逆相蒸发法、注入法、冷冻干燥法、融熔法、PH梯度法等。由于β-榄香烯为强脂溶性药物，适用于薄膜分散法、注入法等制备。因此，按蛋黄卵磷脂与胆固醇之摩尔比为1∶1，磷脂质量与β-榄香烯质量比为10∶1的处方比例，分别用薄膜分散法和注入法制备，结果如下：
(1)薄膜分散法取蛋黄卵磷脂209.0mg、胆固醇86.9mg、β-榄香烯110.0mg于试管中，加氯仿约2.5ml溶解，以N2吹成膜，在-0.1Mp真空下抽干溶剂(约2小时)，加入20ml磷酸盐缓冲溶液(PH6.8)中，振荡30分钟。实验结果：吹膜时有团块凝结，较厚，抽真空时起泡太少，水合时粘在试管壁上，颗粒大，成块。因此，薄膜分散法不适宜制备β-榄香烯脂质体。
(2)注入法 取蛋黄卵磷脂209.0mg、胆固醇86.9mg、β-榄香烯110.0mg于试管中，加乙醇约2.5ml溶解，以注射器注入20ml磷酸盐缓冲溶液(pH6.8)中，振荡30分钟。再通过挤压器，以控制脂质体的粒径大小。挤压过程为：400nm滤膜一次，200nm滤膜二次，氮气压力约2MPa。
实验结果：注入法制得的脂质体混悬均匀，室温放置5天后未分层，表明注入法制备β-榄香烯脂质体可行。
三、工艺条件的筛选
注入法制备脂质体的影响因素有：蛋黄卵磷脂与胆固醇之比(摩尔比)、药物与磷脂量之比(质量百分比)、加缓冲溶液比例(药物、磷脂量之和与所加缓冲溶液体积比)、振荡时间、孔径、挤压次数等，本试验采用均匀试验的方法以包封率为指标对以上因素进行筛选。
1、β-榄香烯含量测定方法
(1)材料与方法
(2)仪器 TRACE GC型气相色谱仪；检测器FID。
(3)药品与试剂 β-榄香烯(乐清市温特莪术油研究所，批号：050301)无水乙醇(西安化学试剂厂)，正辛醇(西安化学试剂厂)。
(4)标准液和内标液的配制
对照品溶液的制备：精密称取β-榄香烯对照品98.2mg，置50ml容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为β-榄香烯母液。
内标溶液的制备：精密称取正辛醇110.0mg置25ml容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为内标溶液。
供试品溶液的制备：精密吸取β-榄香烯脂质体溶液1ml，置10ml容量瓶中，精密加入内标溶液1ml，再加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
阴性样品溶液的制备：精密吸取空白β-榄香烯脂质体溶液1ml，按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。
(5)色谱条件色谱柱：SE-54。汽化室温度：240℃，检测室温度：240℃，程序升温，140℃保持4.5分钟，然后以40℃/min的速率升至185℃，再保持8分钟。载气：氮气30ml/min，氢气80ml/min，空气350ml/min。流速：1.5。分流比10∶1，range：10^1.
(6)专属性考察 分别吸取对照品溶液及内标溶液，注入气相色谱测定，β-榄香烯保留时间为10.4分钟，正辛醇保留时间为4.41分钟，再注入空白脂质体溶液，对对照品和内标物均无干扰。
(7)线性关系 精密吸取β-榄香烯母液0.1、0.5、1、2、4、8ml，分别置10ml容量瓶中，各加入内标溶液1ml，加入无水乙醇定容，分别进样2ul进行测定。以样品与内标的峰面积之比(Y)对浓度(X)进行线性回归。结果见表1。
表1 线性关系的考察结果
实验结果表明样品在0.02002～1.6016mg/ml范围内线性关系良好。
2、包封率的测定
常用的包封率测定方法有离心法、透析法、凝胶柱层析法、导数光谱法等，本试验采用超滤法测定。超滤法是一种能够将溶液进行净化、分离或者浓缩的膜透过法分离技术，超滤非对称结构的多孔膜孔径为1～20nm，主要滤除5～100nm的颗粒。
本实验采用了A/G超滤器超滤，此方法耗时短，脂质体样品不需稀释即可超滤，可降低稀释所带来的药物渗漏，且超滤加样回收率良好，可用于β-榄香烯脂质体的测定。本实验超滤器所用超滤柱为UFP-300-C-MMO6A切向流超滤柱，其聚砜膜截留相对分子量为30000，可以阻滞脂质体的滤过，而β-榄香烯的相对分子量很小为204，可顺利透过超滤膜。
(1)游离药物超滤加样回收率
精密称取β-榄香烯适量，加入到空白脂质体混悬液中，使β-榄香烯浓度分别为0.1001、0.2002、0.8008mg/ml，取上述溶液各10ml至超滤器中进行超滤，按以上色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表2。
表2 游离药物超滤加样回收率实验结果
(2)超滤膜对空白脂质体截留能力的考察
取空白脂质体混悬液10ml至超滤器中进行超滤，收集滤液，用定磷法测定滤液中磷的含量。结果表明，滤液中检测不到磷，说明超滤器对脂质体能够完全截留。
(3)包封率的测定
取β-榄香烯脂质体10ml蒸馏水复溶，至超滤器中超滤，收集滤液，精密量取该滤液适量，用无水乙醇稀释至适当浓度进行测定，计算游离药物含量m游，精密称取β-榄香烯脂质体，用无水乙醇溶解并稀释至适当浓度测定，计算脂质体中药物总含量m总，并计算包封率。包封率＝(m总-m游)/m总×100％。
3、均匀实验设计：蛋黄卵磷脂与胆固醇之比(摩尔比)、药物与磷脂量之比(质量百分比)、加缓冲溶液比例(油水体积比)、振荡时间(min)四个因素各拟9水平，因素水平表见下表：
表3 均匀设计实验因素水平表
根据均匀实验方法，按U* 9(94)表安排实验。
表4 均匀实验表
根据实验结果分析，5号为最佳试验结果，即最佳工艺条件为蛋黄卵磷脂与胆固醇之比(摩尔比)为55∶45、药物与磷脂量之比(质量百分比)为1∶2.7、加缓冲溶液比例(油水体积比)为1∶14、振荡时间40min，再通过挤压器，以控制脂质体的粒径大小。挤压过程为：400nm滤膜一次，200nm滤膜二次，氮气压力约2MPa。
4、脂质体的粒径
(1)粒径的选择：脂质体的粒径大小直接影响其生物利用度，大的脂质体缺乏血管通透性，不能通过肝血管的狄氏间隙，小于150nm的脂质体不易被肝、脾所摄取，因此应严格控制脂质体的大小范围100～400nm之间。β-榄香烯脂质体用于治疗肝癌，需要其在肝聚集，所以将β-榄香烯脂质体的粒径控制在150nm～300nm之间。
(2)粒径的测定：采用激光散射粒径仪(Nicomp 370 submicron particlesizer，Santa Burbara，CA，制造)测定脂质体粒径，它是一种基于光全散射原理的新型颗粒粒度仪，用于测量超细颗粒的粒度分布，颗粒粒径测量范围为0.001～100um。
(3)挤压方法对粒径的影响
分别通过挤压和通过高压乳匀机20分钟的粒径变化考察：
表5 挤压和高压乳匀前后粒径变化结果表
通过粒径图可以看出，挤压前平均粒径320nm，分布范围较广，粒径大小不均匀，通过挤压后平均粒径180nm，粒径均匀，通过高压乳匀后粒径为110nm，粒径较均匀，本制剂要求将β-榄香烯脂质体的粒径控制在150nm～300nm之间，因此选择挤压。
5、灭菌
脂质体不宜加热灭菌，其灭菌方法国外通常采用的是加抑菌剂或滤过除菌，如用200～400nm滤膜过滤。本制备方法在控制粒径时即是通过400nm滤膜一次，通过200nm滤膜两次，已经达到灭菌效果，因此只需无菌环境下进行工艺制备操作，不需再灭菌。
6、冷冻干燥
按优化工艺制备的β-榄香烯脂质体是混悬液，根据考察结果，其在室温条件下和冷冻保存条件下的稳定性都不太好，为提高脂质体的稳定性，考虑将脂质体混悬液通过冷冻干燥使之成为冻干粉，临用前加注射用水重建。
6.1 冷冻参数的筛选
以外观、水分和包封率为指标进行筛选，取适量β-榄香烯脂质体混悬液，加入10％乳糖，分别按以下条件A、B、C进行冷冻干燥：
包封率的测定：取冻干后的β-榄香烯脂质体冻干粉，加注射用水2.4.2所确定的包封率的测定方法测定。
表6 冷冻干燥条件表
表7 冷冻干燥条件筛选结果表
分别以条件A、B、C进行冷冻干燥，实验结果显示，三种条件所制得的成品水分均符合标准，条件B、C所制得成品外观性状优于条件A，而条件B所制得的成品包封率较高，条件C所制得的成品包封率低，因此，拟选择冷冻干燥条件为B：即预冻温度为-45℃，预冻时间为6小时，开始抽真空，并升温至-40℃，保持8小时；再升温至-30℃，保持6小时；升温至-20℃，保持6小时；升温至-10℃，保持4小时；升温至0℃，保持4小时；升温至15℃，保持3小时；升温至30℃，保持3小时，得成品。
6.2 支撑剂的选择
冷冻干燥常用的支撑剂有甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻酸、蔗糖等。而所加比例一般为固形物的9％～12％。
分别以甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻酸、蔗糖为支撑剂，每种支撑剂所加比例分别为6％、9％、12％，按上冷冻干燥条件进行冷冻干燥，考察冻干粉的外观性状。
评价指标：外观以可以维持原液体积，不塌陷，不皱缩，表面光洁为佳。色泽以均匀，无花斑，质地细腻为佳。再分散性，取各冻干产品，加注射用水2ml，振摇后能在30s之内完全溶解均匀为佳。
表8 支撑剂及其用量考察结果表
由表可知9％和12％乳糖为冻干支撑剂，冻干品均无气泡，无塌陷，无皱缩，表面光洁，呈白色，色泽均匀，无花斑，质地细腻，加注射用水2ml，振摇后能在30s之内完全溶解均匀。而考虑尽可能载药量大，故确定以9％乳糖作为β-榄香烯脂质体的冻干支撑剂。
6.3 冻干粉复溶后与冻干前混悬液的粒径及包封率的比较：
在脂质体冻结过程和升华干燥过程中由于塌陷等原因可能引起脂质体粒径变化，还可能会引起脂质体包容药物的泄漏(即引起包封率的变化)，影响其在体内的作用效果。因此，以判断脂质体药物质量两个重要指标——脂质体粒径及包封率对冻干粉复溶后与冻干前混悬液的粒径及包封率进行了比较。
表9 冻干前后粒径及包封率变化结果表
结果表明，本品冻干前后粒径有所增大，但变化不大，包封率变化亦不大，而冷冻干燥可以大大增加样品的稳定性，所以本研究采用冷冻干燥法将脂质体混悬液冷冻干燥成冻干粉。
6.4 抗氧化剂维生素E加入量的考察
卵磷脂易氧化，因此制备脂质体时必须使用抗氧化剂。维生素E因其氧杂萘满环上6-位羟基氢可提供自由基给过氧化物自由基，使其失活，可终止脂肪酸过氧化反应，是一种常用的脂质体抗氧化剂。因此，在制备前加入适量维生素E，以防止脂质体氧化。为考察维生素E的用量，在制备时分别加入卵磷脂2％、4％、6％的维生素E，分别放置1、2、5、10、15、20、30日，测定脂质体的氧化指数。
维生素E加入量的考察结果见下表：
表10 维生素E加入量考察结果表
根据以上实验结果，表明加入4％维生素E后可明显防止脂质体的氧化，因此，在工艺制备时加入4％维生素E。
以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效果。
试验例1 β-榄香烯脂质体在大鼠体内分布试验
将24只大鼠随机分为4组，雌雄各半，给药前禁食不禁水16h。第4组为正常对照组，iv生理盐水，其余3组iv实施例2制备的β-榄香烯脂质体冻干粉100mg/kg。给药组分别于注射后15min、30min、180min各取6只大鼠于颈动脉插管取血并处死，离心取血清，置-20℃冰箱备用；剖取心、肝、脾、肺、肾、脑、脂肪，置-20℃冰箱备用。对照组同法处理。实验时称取各脏器组织，在冰浴下用生理盐水制成组织匀浆，测定药物含量及血清药物浓度。
各组织分布结果：
为正确的评价本发明β-榄香烯脂质体的肝靶向性，建立了β-榄香烯在小鼠体内的含量测定方法，通过组织中最高药物浓度、组织/血浆比值等靶向性指标的分析，与文献报道β-榄香烯注射液相比较，β-榄香烯脂质体在肝、脾、肺的药物浓度较高，说明脂质体可明显提高药物在这些组织器官中的分布，对肝、脾、肺均有靶向性，而肝组织中药物浓度在15、30、180min均为各组织中最高，因此，β-榄香烯脂质体用于对肝癌的治疗能发挥其最大功效，其对肝组织靶向性最强，而且30min、180min的药物浓度消除较缓慢，说明本发明β-榄香烯脂质体不仅有靶向作用，还具有一定缓释作用。
试验例2 本发明β-榄香烯脂质体的药效药理
1、本发明β-榄香烯脂质体对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用
昆明种小鼠60只，雄性，体重18～22g，取腹腔接种S180瘤株7天的荷瘤小鼠，无菌操作下抽取腹腔瘤液，以灭菌生理盐水稀释成1：3的瘤细胞悬液(镜检含瘤细胞数为6×107个/ml)，按0.2ml/鼠的剂量于小鼠右前肢腋窝皮下接种。接种后24小时称重，按体重随机分成6组，每组10只。设模型对照和阳性对照(环磷酰胺)，β-榄香烯注射剂(50mg/kg)、实施例2制备的β-榄香烯脂质体3个剂量组(25、50、100mg/kg)。模型对照组腹腔注射生理盐水，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺25mg/kg，β-榄香烯注射剂、β-榄香烯脂质体3个剂量组采用尾静脉注射给药，注射容积为0.2ml/10g体重，每日1次，连续10天。给药10日后次日处死小鼠，解剖瘤体称重，计算抑瘤率。结果：β-榄香烯脂质体所试100mg和50mg/kg剂量组与对照组比较，其瘤重均显著减小(P<0.05或0.01)，并呈一定的量效关系，此外β-榄香烯注射液50mg/kg也能显著抑制小鼠S180瘤株的生长，但药效较脂质体50mg/kg弱一些。表明β-榄香烯脂质体对S180荷瘤小鼠有明显的抑瘤作用，脂质体较注射液的作用更好。
2、本发明β-榄香烯脂质体对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用
昆明种小鼠60只，雄性，体重18～22g，取腹腔接种H22瘤株7天的荷瘤小鼠，无菌操作下抽取腹腔瘤液，以灭菌生理盐水稀释成1：3的瘤细胞悬液(镜检含瘤细胞数为6×107个/ml)，按0.2ml/鼠的剂量于小鼠右前肢腋窝皮下接种。接种后24小时称重，按体重随机分成6组，每组10只。设模型对照和阳性对照(环磷酰胺)，β-榄香烯注射剂(50mg/kg)、实施例2制备的β-榄香烯脂质体3个剂量组(25、50、100mg/kg)。模型对照组腹腔注射生理盐水，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺25mg/kg，β-榄香烯注射剂、β-榄香烯脂质体3个剂量组采用尾静脉注射给药，注射容积为0.2ml/10g体重，每日1次，连续10天。给药10日后次日处死小鼠，解剖瘤体称重，计算抑瘤率。结果：β-榄香烯脂质体所试100mg和50mg/kg剂量组与对照组比较，其瘤重均显著减小(P<0.05或0.01)，并呈一定的量效关系；β-榄香烯注射液50mg/kg能一定程度抑制小鼠H22瘤株的生长，但没有显著性差异，表明药效较脂质体50mg/kg弱。结果表明β-榄香烯脂质体对H22荷瘤小鼠有明显的抑瘤作用，脂质体较注射液的作用更好。
3、本发明β-榄香烯脂质体对环磷酰胺所致免疫底下小鼠溶血素抗体生成的影响
昆明种小鼠70只，雌雄各半，随机分为7组，第7组为正常对照组，iv生理盐水，其余各组分别iv相应药物，1次/日，连续7日。此外，除正常对照组外其余各组皮下注射环磷酰胺20mg/kg，1次/2日，共3次；首次给药1h后每鼠以5％鸡血球0.2ml腹腔注射免疫，第7日各鼠于眼眶取血20ul，加入1ml生理盐水，再加入4％鸡红血球0.5ml、10％豚鼠血清0.5ml，于37℃水浴中孵育40min，冰浴终止反应，于2000rpm离心10min，取上清液1ml，加入3ml都氏液，混匀，10min后于540nm以都氏液调零，测定各管吸收度。结果：正常对照组与环磷酰胺组比有明显差异(P<0.01)，说明模型组造型成功；β-榄香烯脂质体所试100mg剂量组与环磷酰胺组比较，其吸收度显著增加(P<0.01)，此外β-榄香烯脂质体及β-榄香烯注射液50mg/kg不能明显抑制环磷酰胺致小鼠溶血素抗体生成的减少，但本发明β-榄香烯脂质体较注射液有一定数量上的提高，表明药效较注射液强。结果表明β-榄香烯脂质体对环磷酰胺致小鼠溶血素抗体低下有明显的抑制作用，脂质体较注射液的作用更好。
4、本发明β-榄香烯脂质体对小鼠网状内皮系统对血流中惰性炭粒吞噬能力的影响
昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，第6组为正常对照组，iv生理盐水，其余各组分别iv相应药物，1次/日，连续7日。末次给药24h于鼠尾静脉注入稀释印度墨汁0.1ml/10g，于注入墨汁后30s及6min从小鼠眼眶后静脉丛取血0.025ml，立刻吹入0.1％ Na2CO3液2ml中，于分光光度计上675nm处比色，计算吞噬指数K及吞噬系数α，剖取小鼠肝脏、脾脏、胸腺称重，比较各组差异。结果：β-榄香烯脂质体所试100mg和50mg/kg剂量组与对照组比较，其吞噬指数显著增加(P<0.01)，虽然这两个剂量组的吞噬系数较对照组在数量上有一定的提高，但无明显差异；β-榄香烯脂质体50mg/kg与同等剂量的注射液组比较，在吞噬系数及吞噬指数都有一定数量上的提高，表明药效较注射液强。结果表明β-榄香烯脂质体对小鼠网状内皮系统有明显的增强作用，能刺激小鼠巨噬细胞的增殖，脂质体及注射液对小鼠的免疫器官没有明显影响。
综上所述，本发明制备的β-榄香烯脂质体对肝癌的治疗能发挥其最大功效，尤其对肝组织靶向性最强，还具有一定缓释作用，药效明显，为临床治疗肝癌提供了一种新的选择。
Claims (10)
1、β-榄香烯脂质体的制备方法，它包括下述步骤：
a、取磷脂、胆固醇、β-榄香烯，其中β-榄香烯与磷脂的重量比为1∶(0.7-4.7)，磷脂与胆固醇的摩尔比为(40-80)∶(60-20)；加无水乙醇溶解，以注射器注入磷酸盐缓冲溶液中，振荡；
b、通过挤压器挤压，得脂质体混悬液，脂质体为大单室脂质体。
2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：a步骤所述的β-榄香烯与磷脂的重量比为1∶2.7，磷脂与胆固醇的摩尔比为55∶45；a步骤中磷酸盐缓冲溶液与磷脂、胆固醇、β-榄香烯的无水乙醇溶解物的体积比与为14∶1；所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂。
3、根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的磷脂为蛋黄卵磷脂。
4、根据权利要求1的制备方法，其特征在于：所述的b步骤中挤压过程采用挤压器挤压，400nm滤膜一次，200nm滤膜二次，氮气压力为2Mpa。
5、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：a步骤所述的β-榄香烯的提取方法为：采用G-排式同步精馏装置进行多排式同步精馏取收集到的馏份，加入一条精密分馏柱下的烧瓶内进行精密分馏，再进行二次分离；所得的馏份为原料进行二次硅胶柱层析，干法装柱；用石油醚30～60℃进行洗脱，去溶剂，制得重量百分含量为98.0％以上的β-榄香烯。
6、一种β-榄香烯脂质体冻干粉的制备方法，它是由权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到的脂质体混悬液，加乳糖、维生素E，进行冷冻干燥，将冻干粉无菌分装，即得。
7、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：c步骤所述的乳糖、维生素E的用量与β-榄香烯的重量配比为：
β-榄香烯2-16份、乳糖20-150份、维生素E0.1-6.0份。
8、根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：c步骤所述的乳糖、维生素E的用量与β-榄香烯的重量配比为：
β-榄香烯8.74份、乳糖71.52份、维生素E0.94份。
9、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：c步骤所述的冷冻干燥的条件为：预冻温度为-45℃，预冻时间为6小时，开始抽真空，并升温至-40℃，保持8小时；再升温至-30℃，保持6小时；升温至-20℃，保持6小时；升温至-10℃，保持4小时；升温至0℃，保持4小时；升温至15℃，保持3小时；升温至30℃，保持3小时。
10、权利要求6-9所述的任一方法制备的β-榄香烯脂质体冻干粉，其特征在于：β-榄香烯脂质的平均粒径为150nm～300nm；包封率为90％-96％。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011140872A1 (zh) | 2010-05-10 | 2011-11-17 | Xie Tian | 抗肿瘤植物药榄香烯缓释片 |
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