CN111328333A - 一种酸法制备抗体药物偶联物中间体的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种酸法制备抗体药物偶联物中间体的方法，它采用酸性添加剂，使得单甲基auristatin衍生物变成盐之后参与反应，酸性添加剂的加入能够显著的提高最终产物的产率，且酸的价格低廉，大大降低最终ADC产物的生产成本。除此之外，本发明提供的制备方法采用的是一步制备方法，除具有更高的终产物产率外，在生产中即节省了生产耗材、人工、设备、场地、原料等成本，也大大降低了产生的生产废液，降低了生产成本，提高了生产效率，适用于工业推广。

Description

一种酸法制备抗体药物偶联物中间体的方法及其应用
技术领域
本发明涉及抗体药物偶联物领域，具体涉及一种抗体药物偶联物中间体的制备方法及其在制备抗体药物偶联物中的应用。
背景技术
抗体偶联药物(Antibody-Drug Conjugate，ADC)作为一种新型的生物导弹，实现了单抗靶向作用和小分子药物细胞毒性的强强联合，现已成为肿瘤靶向治疗发展最快的领域之一。ADC的三个构件(抗体、细胞毒素和连接子)共同组成靶向药物递送系统，其中抗体实现靶向性，连接子保证在ADC在血液转运过程中的稳定性，而到达作用靶点后，毒素发挥对癌细胞的杀伤作用。
目前auristatin或maytansinoids是ADC开发中最广泛使用的两种有丝分裂抑制剂，它们能在长春碱结合位点附近与微管蛋白结合，引起G2/M细胞周期阻滞和随后的细胞凋亡。这种细胞杀伤机制在快速增殖的细胞中非常有效，但非分裂和静态细胞可能对药物作用不太敏感，导致产生耐药性，因肿瘤细胞分裂速度比大多数正常细胞更快，所以抗有丝分裂药物对癌细胞特别有效。由于这种固有的选择性，高效的微管蛋白抑制剂，如美登素和auristatin，已成功用作临床批准的ADC药物(brentuximabvedotin和trastuzumabemtansine等)。
海兔毒素(dolastatin)是从印度洋生物截尾海兔中发现的一类具有高细胞毒性的线性多肽类化合物，这类细胞毒药物能够显著抑制微管蛋白的形成和聚合。然而海兔毒素10在单独使用时存在毒副作用大、药代动力学性质差、治疗窗口窄等问题限制了其开发。Miyazaki等发现N端为仲胺的单甲基奥瑞他汀D(monomethyl auristatin D，MMAD)毒性与海兔毒素10相当，将这类N-单甲基取代的海兔毒素衍生物命名为奥瑞他汀类(auristatin)，它们可实现与连接子的有效连接，新一代的高效ADC也由此产生。目前，ADC研发常用的弹头分子为奥瑞他汀类化合物MMAE和MMAF(胡馨月,李艳萍,李卓荣.抗体药物偶联物的弹头分子研究进展[J].中国医药生物技术,2017(6):549-555.)。
MMAF(Monomethyl auristatin F)是海兔毒素10(dolastatin10，D10)的衍生物，可以抑制细胞有丝分裂，具有很强的抗肿瘤活性。目前已有多个处于临床阶段的ADC产品偶联的细胞毒分子即为MMAF，也是目前ADC中选择最多的一种单甲基auristatin衍生物。但是，这些小分子药物价格昂贵。
MMAF市场售价10mg的价格接近5000元，而用于偶联于抗体的中间体Mc-MMAF 1mg即接近6000元，从MMAF制备到Mc-MMAF中间体后的价格提升十多倍(MMAF、Mc-MMAF的价格可参见如下网址：https://www.medchemexpress.cn/mmaf-hydrochloride.html？src＝360-prod uct、https://www.medchemexpress.cn/McMMAF.html)。ADC中间体价格高昂是相关ADC生产成本高的一个重要因素。
相关ADC中间体(连接子-药物共价偶联物)价格相对于相应细胞毒分子价格急剧提升的一个重要原因是抗体药物偶联物中间体(即制备过程的收率较低。因此，提高相关ADC中间体的收率将能有效的控制ADC药物大规模生产时的成本。
Mc-MMAF结构如下所示：
Figure BDA0002392645340000021
Mc-MMAE结构如下所示：
Figure BDA0002392645340000022
Mc-MMAD结构如下所示：
Figure BDA0002392645340000023
专利公开号为CN1938046A的中国专利公开了两种制备Mc-MMAF的方法(说明书第206-207页和说明书第207-208页)，其中一种是利用叔丁酯合成Mc-MMAF，另一种是利用二甲氧基苄基酯合成Mc-MMAF，这两种方法的工艺路线分别为：
(1)利用叔丁酯合成Mc-MMAF
Figure BDA0002392645340000031
(2)利用二甲氧基苄基酯合成Mc-MMAF
Figure BDA0002392645340000032
这两个路线都采用两步合成的方法，利用叔丁酯合成Mc-MMAF路线是先合成Mc-MMAF-OtBu(即Mc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu)，再用三氟乙酸脱酯基，得到Mc-MMAF(总产率低于60％)。利用二甲氧基苄基酯合成Mc-MMAF路线是先合成Mc-MMAF-ODMB(即Mc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB)，再用三氟乙酸脱酯基，得到Mc-MMAF。缺点是两步合成，第一步产率只有57％，第二步产率73％，总产率仅为42％，而且MMAF-ODMB不易获得。
专利公开号为CN109824759A的中国专利也公开了一种制备Mc-MMAF的方法(说明书第2页第[0009]行)，它是利用Mc与MMAF直接反应，其工艺路线为：
Figure BDA0002392645340000041
该路线MMAF的N终端缬氨酸的N上带有一个甲基，位阻较大，在这种情况下，将马来酰亚氨基正己酸(Mc-hex-Acid)接到MMAF上反应速度就会较慢。该路线用于小于1g的MC-MMAF合成，最后要应用高压反相制备除去异构杂质，产率低于50％。
发明内容
本发明提供了一种酸法制备抗体药物偶联物中间体的方法，本发明的技术方案为：
一种酸法制备抗体药物偶联物中间体的方法，所述方法的反应路线如下：
Figure BDA0002392645340000042
其中：
L为任意包含酰基结构的连接基团；
L’为共价连接单甲基auristatin衍生物后的连接基团残基；
溶剂A和溶剂B为任一极性或非极性溶剂；
所述方法包括以下步骤：
1)将连接基团L和缩合剂、有机碱溶解在溶剂A中，形成溶液1；
2)将单甲基auristatin衍生物和酸溶解在溶剂B中，形成溶液2；
3)将溶液1加到溶液2中，L与单甲基auristatin衍生物通过缩合反应得到L’-单甲基auristatin衍生物；
所述步骤1)中加入的有机碱的摩尔量大于步骤3)的反应体系中所有游离羧基的摩尔量。
进一步的，所述的酸选自三氟乙酸、磺酸中的一种或多种组合。
进一步的，所述单甲基auristatin衍生物包括MMAF、MMAE和MMAD。
进一步的，所述方法的反应路线如下：
Figure BDA0002392645340000051
Figure BDA0002392645340000061
进一步的，所述的缩合剂为DCC、EDCI、DIC、HATU、HBTU、HBPIPU、HBPyU、HCTU、HDMA、TATU、TBTU、TCTU、TCFH、TDBTU、TFFH、BTFFH、PyBOP、PyClOP、PyAOP、PyCIU、DEPBT、EEDQ中的一种或多种，优选的，所述的缩合剂为HATU。
进一步的，所述的有机碱为N，N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、二甲氨基吡啶、三乙烯二胺、N-甲基吗啉、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯、N-甲基咪唑、奎宁环、三甲基吡啶中的一种或几种，优选的，所述的有机碱为N，N-二异丙基乙胺、三乙胺。
进一步的，所述的溶剂A和溶剂B独立地选自DMF、DMA、NMP、二氯甲烷、四氯化碳、DMSO、氯仿、四氢呋喃、1,4-二氧六环、六甲基磷酰三胺、N，N-二甲基丙烯基脲、乙二醇二甲醚的一种或几种，溶剂A和溶剂B可以相同也可以不同；优选的，溶剂A和溶剂B为DMF、DMA、DMSO。
更进一步的，所述的磺酸包括对甲苯磺酸、苯亚磺酸、三氟甲磺酸、(-)-10-樟脑磺酸、(+)-10-樟脑磺酸、甲基磺酸中的一种或几种，所述的对甲苯磺酸优选为对甲苯磺酸一水化合物。
优选的，所述的L为任意包含酰基结构的连接基团，其结构如式(I)所示：
Figure BDA0002392645340000062
其中：
R1选自
Figure BDA0002392645340000071
Figure BDA0002392645340000072
R2选自
Figure BDA0002392645340000073
Figure BDA0002392645340000074
及其盐。
更优选的，所述的L选自如下结构：如下结构：
Figure BDA0002392645340000075
Figure BDA0002392645340000081
更优选的，所述的L’-MMAF选自如下结构：
Figure BDA0002392645340000082
更进一步的，所述酸与相应单甲基auristatin衍生物用量摩尔比优选大于或等于1或大于或等于2。
更进一步的，所述溶液1加入溶液2的方式为均匀加入或滴加。
本发明还提供了上述任一项所述的方法在制备抗体药物偶联物中的应用。
本发明提供的酸法制备抗体药物偶联物中间体(具体为连接基团-MMAF共价偶联物)的方法，是在传统的制备方法(专利公开号为CN1938046A的中国专利说明书第2页第[0009]行公开的制备方法)基础上添加了酸性添加剂，使得MMAF变成盐之后参与反应，经过一系列的反应，我们惊喜的发现，酸添加剂的加入能够显著的提高最终产物的产率，且酸的价格低廉(相对于MMAF可以忽略不计)，这将大大降低最终ADC产物的生产成本。除此之外，相较于专利公开号为CN1938046A公开的两种方法来说，本发明提供的制备方法采用的是一步制备方法，除具有更高的终产物产率外，在生产中既节省了生产耗材、人工、设备、场地、原料等成本，也大大降低了产生的生产废液，降低了生产成本，提高了生产效率，适用于工业大规模生产。
附图说明
图1是本发明实施例2中加入各种磺酸类添加剂的产物的液相色谱图。
图2是本发明实施例3中加入不同摩尔量对甲苯磺酸一水合物时反应产物的面积比(面积比指色谱图中产物的峰面积与基准面积的比值，基准面积采用酸性添加剂与MMAF用量摩尔比等于1：1时的峰面积)折线图。
图3是本发明实施例4中加入不同摩尔量N,N-二异丙基乙胺反应产物的液相色谱图。
具体实施方式
[缩写]
除非另有说明，本发明使用的所有缩写具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。如本发明所用，常用的缩写及其定义如下所示：
Figure BDA0002392645340000091
Figure BDA0002392645340000101
[定义]
与说明书的各方面相关的各种术语在说明书和权利要求书中通篇使用。除非另外指明，否则此类术语被赋予本领域的普通含义。其它具体定义的术语应按照与本文所提供的定义相符的方式理解。
如本文所用，术语“一个”和“一种”和“所述”是按照标准惯例使用的并且意指一个或多个，除非上下文另有指示。因此例如，对“一种抗体药物偶联物”的提及包括两个或更多个抗体药物偶联物的组合等等。
应当理解，无论何处在本文中用语言“包含”描述方面，除此之外还提供了以“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的类似方面。
尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。
本发明中所用的
Figure BDA0002392645340000111
是指含
Figure BDA0002392645340000112
的基团在此处与其他基团通过化学键连接。
本发明中的术语“连接基团”是指一种具有双官能团或多官能团的分子，可分别与蛋白/抗体分子和MMAF反应，因此做为一种“桥梁”将蛋白/抗体与MMAF连接起来。本发明涉及的连接基团特指那些结构中含有酰基结构的基团。
本发明中的术语“抗体药物偶联物中间体”是指连接基团和MMAF共价偶联物。
[具体实施例]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商建议的条件进行，未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用于与本领域熟悉人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明办法中。文中所述的较佳实施方式与材料仅作示范之用。
实施例1Mc-MMAF制备方法中酸性试剂加入效果对照
Mc-MMAF制备方法1(不加酸)
Figure BDA0002392645340000121
称取Mc-OH 84.6mg和HATU 144.6mg，加入50mL圆底烧瓶中，用5mL注射器取5mL N,N-二甲基甲酰胺加入圆底烧瓶，再用200μL移液枪取165.4μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于磁力搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 146.4mg加入一个25mL圆底烧瓶中，用10mL注射器取10mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将磁力搅拌器上的冰浴撤去，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
反应完成后，用旋蒸仪将溶剂旋干，加入5mL乙腈，用5mL注射器吸取后，用有机相针式滤器过滤至10mL进样瓶中，制备液相法纯化。制备方法为流动相A：H2O，0.1％HCOOH，流动相B：MeCN，0.1％HCOOH，流速40mL/min，梯度：25％B-70％B，30min，在25.1min出峰。第一针进样5mL，得到45mL制备液，向样品瓶中加入5mL乙腈，第二针进样5mL，得到制备液45mL。将得到的制备液合并到250mL圆底烧瓶中，放-80℃冰箱冷冻3h，放冻干机冷冻干燥后，得到产品Mc-MMAF纯品102.7mg。收率52％。LC-MS：(M+H)+：924.4；(M-H)-：922.9。
Mc-MMAF制备方法2(添加三氟乙酸)
Figure BDA0002392645340000131
称取Mc-OH 84.8mg和HATU 144.7mg，加入50mL圆底烧瓶中，用5mL注射器取5mL N,N-二甲基甲酰胺加入圆底烧瓶，再用200μL移液枪取165.4μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于磁力搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 146.4mg和三氟乙酸22.8mg，加入一个25mL圆底烧瓶中，用10mL注射器取10mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将磁力搅拌器上的冰浴撤去，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
反应完成后，用旋蒸仪将溶剂旋干，加入5mL乙腈，用5mL注射器吸取后，用有机相针式滤器过滤至10mL进样瓶中，制备液相法纯化。制备方法为流动相A：H2O，0.1％HCOOH，流动相B：MeCN，0.1％HCOOH，流速40mL/min，梯度：25％B-70％B，30min，在25.1min出峰。第一针进样5mL，得到45mL制备液，向样品瓶中加入5mL乙腈，第二针进样5mL，得到制备液45mL。将得到的制备液合并到250mL圆底烧瓶中，放-80℃冰箱冷冻3h，放冻干机冷冻干燥后，得到产品Mc-MMAF纯品114.1mg。收率62％。LC-MS：(M+H)+：924.4；(M-H)-：922.9。
Mc-MMAF制备方法3(添加对甲苯磺酸一水合物)
Figure BDA0002392645340000132
称取Mc-OH 84.6mg和HATU 144.2mg，加入50mL圆底烧瓶中，用5mL注射器取5mL N,N-二甲基甲酰胺加入圆底烧瓶，再用200μL移液枪取165.4μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于磁力搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 146.4mg和对甲苯磺酸一水合物34.8mg，加入一个25mL圆底烧瓶中，用10mL注射器取10mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将磁力搅拌器上的冰浴撤去，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
反应完成后，用旋蒸仪将溶剂旋干，加入5mL乙腈，用5mL注射器吸取后，用有机相针式滤器过滤至10mL进样瓶中，制备液相法纯化。制备方法为流动相A：H2O，0.1％HCOOH，流动相B：MeCN，0.1％HCOOH，流速40mL/min，梯度：25％B-70％B，30min，在25.1min出峰。第一针进样5mL，得到45mL制备液，向样品瓶中加入5mL乙腈，第二针进样5mL，得到制备液45mL。将得到的制备液合并到250mL圆底烧瓶中，放-80℃冰箱冷冻3h，放冻干机冷冻干燥后，得到产品Mc-MMAF纯品125.9mg。收率68％。LC-MS：(M+H)+：924.4；(M-H)-：922.9。
Mc-MMAF制备方法4(添加(-)-10-樟脑磺酸)：
Figure BDA0002392645340000141
称取Mc-OH 84.2mg和HATU 144.4mg，加入50mL圆底烧瓶中，用5mL注射器取5mL N,N-二甲基甲酰胺加入圆底烧瓶，再用200μL移液枪取165.4μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于磁力搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 147.0mg和(-)-10-樟脑磺酸46.8mg，加入一个25mL圆底烧瓶中，用10mL注射器取10mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将磁力搅拌器上的冰浴撤去，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
反应完成后，用旋蒸仪将溶剂旋干，加入5mL乙腈，用5mL注射器吸取后，用有机相针式滤器过滤至10mL进样瓶中，制备液相法纯化。制备方法为流动相A：H2O，0.1％HCOOH，流动相B：MeCN，0.1％HCOOH，流速40mL/min，梯度：25％B-70％B，30min，在25.1min出峰。第一针进样5mL，得到45mL制备液，向样品瓶中加入5mL乙腈，第二针进样5mL，得到制备液45mL。将得到的制备液合并到250mL圆底烧瓶中，放-80℃冰箱冷冻3h，放冻干机冷冻干燥后，得到产品Mc-MMAF纯品117.4mg。收率64％。LC-MS：(M+H)+：924.4；(M-H)-：922.9。
Mc-MMAF制备方法5(添加三氟甲磺酸)
Figure BDA0002392645340000151
称取Mc-OH 84.6mg和HATU 144.7mg，加入50mL圆底烧瓶中，用5mL注射器取5mL N,N-二甲基甲酰胺加入圆底烧瓶，再用200μL移液枪取165.4μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于磁力搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 146.5mg和三氟甲磺酸30.0mg，加入一个25mL圆底烧瓶中，用10mL注射器取10mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将磁力搅拌器上的冰浴撤去，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
反应完成后，用旋蒸仪将溶剂旋干，加入5mL乙腈，用5mL注射器吸取后，用有机相针式滤器过滤至10mL进样瓶中，制备液相法纯化。制备方法为流动相A：H2O，0.1％HCOOH，流动相B：MeCN，0.1％HCOOH，流速40mL/min，梯度：25％B-70％B，30min，在25.1min出峰。第一针进样5mL，得到45mL制备液，向样品瓶中加入5mL乙腈，第二针进样5mL，得到制备液45mL。将得到的制备液合并到250mL圆底烧瓶中，放-80℃冰箱冷冻3h，放冻干机冷冻干燥后，得到产品Mc-MMAF纯品121.2mg。收率66％。LC-MS：(M+H)+：924.4；(M-H)-：922.9。
在前期试验中，我们在上述Mc-MMAF制备方法1的基础上作了进一步的探索，在配制MMAF反应液时，通过加入酸或碱试剂使MMAF先转换成盐后再进行后续反应。我们试验添加了三氟乙酸、叔丁醇钾等试剂进行初步试验，发现在配制MMAF反应试剂时，加入三氟乙酸后(Mc-MMAF制备方法2)，Mc-MMAF的产品收率有了显著的提升。
后续进一步探索了加入其他酸的效果。其中，加入多种酸均对产品收率起到的惊奇的提升效果。如加入对甲苯磺酸一水合物(Mc-MMAF制备方法3)进行比较对照试验，Mc-MMAF的产品收率也有了惊奇的提升。Mc-MMAF的产品收率从52％提升到了68％，收率绝对值提升了16个百分点，相对于未加酸的制备方法1，加入酸后的收率相对值提高了30.7％((68％-52％)/52％)。此外，加入(-)-10-樟脑磺酸及三氟甲磺酸的试验组中的Mc-MMAF产品收率也分别达到了64％和66％。
试验结果表明，通过在反应体系中加入酸性试剂，可以有效提升Mc-MMAF的产品收率。
实施例2加入各种磺酸类添加剂的试验结果
Figure BDA0002392645340000161
试验例1)添加(-)-10-樟脑磺酸：称取Mc-OH 11.5mg和HATU 20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取22.3μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和(-)-10-樟脑磺酸6.3mg，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mLN,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例2)添加(+)-10-樟脑磺酸：称取Mc-OH 11.5mg和HATU 20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取22.3μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和(+)-10-樟脑磺酸6.3mg，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mLN,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例3)添加10-樟脑磺酸：称取Mc-OH 11.5mg和HATU 20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取22.3μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF20.0mg和10-樟脑磺酸6.3mg，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例4)添加甲基磺酸：称取Mc-OH 11.5mg和HATU 20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取22.3μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF20.0mg和甲基磺酸2.6mg，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例5)添加三氟甲磺酸：称取Mc-OH 11.5mg和HATU 20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取22.3μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF20.0mg和三氟甲磺酸4.1mg，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例6)添加对甲苯磺酸一水合物：称取Mc-OH 11.5mg和HATU 20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取22.3μLN,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物4.7mg，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
检测的结果如图1所示，加入各类磺酸，如(-)-10-樟脑磺酸、(+)-10-樟脑磺酸、10-樟脑磺酸、甲基磺酸及三氟甲磺酸添加剂到反应体系中，能起到与加入对甲苯磺酸一水合物添加剂相当的反应促进效果，均能够有效提升Mc-MMAF的产品收率。
实施例3酸性添加剂添加用量的影响试验
试验例1)不加酸性添加剂：称取Mc-OH 11.5mg(0.055mmol)和HATU 20.5mg(0.054mmol)，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取35.7μL(0.216mmol)N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg(0.027mmol)，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例2)酸性添加剂与MMAF用量摩尔比等于1：100：称取Mc-OH 11.5mg和HATU20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取35.7μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物46μg(2.7*10-4mmol)，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例3)酸性添加剂与MMAF用量摩尔比等于1：20：称取Mc-OH 11.5mg和HATU20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取35.7μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物0.23mg(13.5*10-4mmol)，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例4)酸性添加剂与MMAF用量摩尔比等于1：10：称取Mc-OH 11.5mg和HATU20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取35.7μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物0.46mg(2.7*10-3mmol)，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例5)酸性添加剂与MMAF用量摩尔比等于1：5：称取Mc-OH 11.5mg和HATU20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取35.7μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物0.92mg(5.4*10-3mmol)，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例6)酸性添加剂与MMAF用量摩尔比等于2：5：称取Mc-OH 11.5mg和HATU20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取35.7μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物1.84mg(0.011mmol)，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例7)酸性添加剂与MMAF用量摩尔比等于1：2：称取Mc-OH 11.5mg和HATU20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取35.7μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物2.3mg(0.014mmol)，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例8)酸性添加剂与MMAF用量摩尔比等于1：1：称取Mc-OH 11.5mg和HATU20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取35.7μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物4.6mg(0.027mmol)，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例9)酸性添加剂与MMAF用量摩尔比等于2：1：称取Mc-OH 11.5mg和HATU20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取35.7μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物9.3mg(0.054mmol)，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例10)酸性添加剂与MMAF用量摩尔比等于3：1：称取Mc-OH11.5mg和HATU20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取35.7μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物13.9mg(0.081mmol)，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例11)酸性添加剂与MMAF用量摩尔比等于4：1：称取Mc-OH 11.5mg和HATU20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取35.7μL N,N-二异丙基乙胺加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物18.6mg(0.108mmol)，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
检测结果如图2所示，酸性添加剂与MMAF用量摩尔比大于1时，对于反应有显著的促进效果。
实施例4溶液1中有机碱加入量对于反应体系的影响
为验证溶液1(含连接基团的溶液)中使用的有机碱的量是否影响反应的结果，本实施例中以DIPEA为例进一步开展了相关试验。
试验例1)碱性添加剂(DIPEA)与酸性添加剂用量摩尔比等于2：1：称取Mc-OH11.5mg(0.055mmol)和HATU 20.5mg(0.054mmol)，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取8.9μL N,N-二异丙基乙胺(0.055mmol)加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg(0.027mmol)和对甲苯磺酸一水合物4.6mg(0.027mmol)，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例2)碱性添加剂(DIPEA)与酸性添加剂用量摩尔比等于3：1：称取Mc-OH11.5mg和HATU 20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取13.4μL N,N-二异丙基乙胺(0.081mmol)加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物4.6mg，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例3)碱性添加剂(DIPEA)与酸性添加剂用量摩尔比等于4：1：称取Mc-OH11.5mg和HATU 20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取17.9μL N,N-二异丙基乙胺(0.108mmol)加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物4.6mg，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例4)碱性添加剂(DIPEA)与酸性添加剂用量摩尔比等于5：1：称取Mc-OH11.5mg和HATU 20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取22.3μL N,N-二异丙基乙胺(0.135mmol)加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物4.6mg，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例5)碱性添加剂(DIPEA)与酸性添加剂用量摩尔比等于6：1：称取Mc-OH11.5mg和HATU 20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取26.8μL N,N-二异丙基乙胺(0.162mmol)加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物4.6mg，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
试验例6)碱性添加剂(DIPEA)与酸性添加剂用量摩尔比等于7：1：称取Mc-OH11.5mg和HATU 20.5mg，加入5mL样品瓶中，用1mL移液枪取1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，再用100μL移液枪取31.3μL N,N-二异丙基乙胺(0.189mmol)加入样品瓶，放置于平行反应搅拌器上，加入搅拌子，室温搅拌0.5h。称取MMAF 20.0mg和对甲苯磺酸一水合物4.6mg，加入另一个5mL样品瓶中，用1mL移液枪取两次1mL N,N-二甲基甲酰胺加入样品瓶，加入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加冰浴搅拌。在冰浴条件下，用5mL塑料滴管将Mc-OH体系转移入MMAF的溶液中，将反应瓶放置平行反应器上，继续搅拌1h。停止反应，用10μL移液枪取样10μL加入1.5mL离心管，再用1mL移液枪取1mL乙腈加入离心管，再用1mL注射器吸取后用有机相针式滤器过滤后，送样，通过LC-MS检测反应情况。
在整个反应体系中，MMAF的投入量为0.027mmol时，投入的Mc-OH为0.055mmol摩尔，酸试剂为0.027mmol摩尔，反应体系中总的存在的游离羧基为0.109mmol。而根据图3的检测结果，显示当DIPEA投入的摩尔量小于或等于0.108mmol时，没有反应或反应率低；当DIPEA摩尔量大于0.108mmol后，即体系中有机碱的摩尔量大于反应体系中游离羧基的总摩尔数后，反应促进效果显著。
通过以上实施例不难看出，相较于不添加酸性添加剂(实施例1中制备方法1)而言，通过利用本发明提供的制备方法(即酸法制备抗体药物偶联物中间体)制备的Mc-MMAF收率明显提高，具有意料不到的技术效果。
由此可见，根据上述以Mc-MMAF合成为试验例所验证的试验原理，可以推知通过加入酸试剂使单甲基auristatin衍生物先转换成盐后再进行后续反应均可以显著促进反应的进行，极大的提高产率。并且在生产中既节省了生产耗材、人工、设备、场地、原料等成本，也大大降低了产生的生产废液，降低了生产成本，提高了生产效率，适用于工业大规模生产。
本发明已通过各个具体实施例作了举例说明。但是，本领域普通技术人员能够理解，本发明并不限于各个具体实施方式，普通技术人员在本发明的范围内可以作出各种改动或变型，并且在本说明书中各处提及的各个技术特征可以相互组合，而仍不背离本发明的精神和范围。这样的改动和变型均在本发明的范围之内。

Claims (14)

1.一种酸法制备抗体药物偶联物中间体的方法，所述方法的反应路线如下：
Figure FDA0002392645330000011
其中：
L为任意包含酰基结构的连接基团；
L’为共价连接单甲基auristatin衍生物后的连接基团残基；
溶剂A和溶剂B为任一极性或非极性溶剂；
所述方法包括以下步骤：
1)将连接基团L和缩合剂、有机碱溶解在溶剂A中，形成溶液1；
2)将单甲基auristatin衍生物和酸溶解在溶剂B中，形成溶液2；
3)将溶液1加到溶液2中，L与单甲基auristatin衍生物通过缩合反应得到L’-单甲基auristatin衍生物；
步骤1)中加入的有机碱的摩尔量大于步骤3)的反应体系中所有游离羧基的摩尔量。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的酸选自三氟乙酸、磺酸中的一种或多种组合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述单甲基auristatin衍生物包括MMAF、MMAE和MMAD。
4.根据权利要求1－3中任一项所述的方法，所述方法的反应路线如下：
Figure FDA0002392645330000021
5.根据权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，所述的缩合剂为DCC、EDCI、DIC、HATU、HBTU、HBPIPU、HBPyU、HCTU、HDMA、TATU、TBTU、TCTU、TCFH、TDBTU、TFFH、BTFFH、PyBOP、PyClOP、PyAOP、PyCIU、DEPBT、EEDQ中的一种或多种，优选的，所述的缩合剂为HATU。
6.根据权利要求1－5中任一项所述的方法，其特征在于，所述的有机碱为N，N-二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶、二甲氨基吡啶、三乙烯二胺、N-甲基吗啉、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一碳烯、N-甲基咪唑、奎宁环、三甲基吡啶中的一种或几种，优选的，所述的有机碱为N，N-二异丙基乙胺、三乙胺。
7.根据权利要求1－6中任一项所述的方法，其特征在于，所述的溶剂A和溶剂B独立地选自DMF、DMA、NMP、二氯甲烷、四氯化碳、DMSO、氯仿、四氢呋喃、1,4-二氧六环、六甲基磷酰三胺、N，N-二甲基丙烯基脲、乙二醇二甲醚的一种或几种，溶剂A和溶剂B可以相同也可以不同；优选的，溶剂A和溶剂B为DMF、DMA、DMSO。
8.根据权利要求1－7中任一项所述的方法，其特征在于，所述的磺酸包括对甲苯磺酸、苯亚磺酸、三氟甲磺酸、(-)-10-樟脑磺酸、(+)-10-樟脑磺酸和甲基磺酸的一种或几种；所述的对甲苯磺酸优选为对甲苯磺酸一水化合物。
9.根据权利要求1－8任一项所述的方法，其特征在于，所述的L为任意包含酰基结构的连接基团，其结构如式(I)所示：
Figure FDA0002392645330000031
其中：
R1选自
Figure FDA0002392645330000032
Figure FDA0002392645330000033
R2选自
Figure FDA0002392645330000041
Figure FDA0002392645330000042
及其盐。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的L选自如下结构：
Figure FDA0002392645330000043
11.根据权利要求10任一项所述的方法，其特征在于，所述的L’-MMAF选自如下结构：
Figure FDA0002392645330000051
12.根据权利要求1－11任一项所述的方法，其特征在于，所述酸与相应单甲基auristatin衍生物用量摩尔比大于或等于1。
13.根据权利要求1－12任一项所述的方法，其特征在于，所述溶液1加入溶液2的方式为均匀加入，进一步优选为滴加。
14.权利要求1－13任一项所述的方法在制备抗体药物偶联物中的应用。
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