CN111316986B - 顺丁烯二酰亚胺类化合物作为几丁质合成酶抑制剂的应用 - Google Patents

顺丁烯二酰亚胺类化合物作为几丁质合成酶抑制剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了式I所示的顺丁烯二酰亚胺类化合物作为几丁质合成酶抑制剂的应用，其中，R0为苯基、苄基、苯乙基、苯丙基、对氟苯基、对氯苯基、对溴苯基、对甲氧基苯基、对甲基苯基或对羟基苯基；R1为氢、甲基、苯基或氯；R2为氢、甲基、苯基或氯。本发明提供的顺丁烯二酰亚胺类化合物对于几丁质合成酶具有良好的抑制作用。

Description

顺丁烯二酰亚胺类化合物作为几丁质合成酶抑制剂的应用
技术领域
本发明涉及顺丁烯二酰亚胺类化合物作为几丁质合成酶抑制剂的应用。
技术背景
目前，由真菌引起的植物病害对各国的农业造成了巨大的经济损失，新型高效对环境无污染的抗真菌药物是治理农业病害的必然选择。几丁质是常见植物致病真菌生长发育过程中所必需的物质，也是真菌细胞壁的重要组成部分，并且几丁质不存在于植物与哺乳动物体内。如果通过某些小分子化合物来抑制几丁质生物合成中的关键酶，就可以干扰真菌中几丁质的代谢，同时也不会对植物和哺乳动物产生影响，因此，越来越多的学者认为几丁质代谢过程可作为抗真菌剂靶标。而几丁质合成酶作为几丁质新陈代谢过程中的关键酶，它主要负责几丁质的生物合成，可以将几丁质前体物质UDP-GlcNAc生物合成几丁质，因此，设计合成一系列活性较好的化合物抑制真菌中起关键作用的几丁质合成酶达到杀灭真菌的作用意义重大。
顺丁烯二酰亚胺又称马来酰亚胺(Maleimide)，是一种含N的五元杂环类化合物(如下式所示)，它结构中含有的α、β不饱和碳碳双键对很多亲核物质都具有很强的选择性，在农业及医学方面都有很好的抑菌活性。
Figure GDA0002484425020000011
本发明采用乙酸法和乙酸酐法得到高纯度的顺丁烯二酰亚胺类衍生物。接着对其生物活性进行研究发现，其具有很好的生物活性，部分衍生物对几丁质合成酶的抑制活性与商用几丁质合成酶抑制剂多抗霉素B的抑制活性相当，甚至效果最好的化合物对该酶的抑制IC50值低于多抗霉素B。因此，该类化合物具有作为几丁质合成酶抑制剂开发成为新型杀菌剂的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供顺丁烯二酰亚胺类化合物作为几丁质合成酶抑制剂的应用，所述顺丁烯二酰亚胺类化合物对于几丁质合成酶具有良好的抑制作用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了式I所示的顺丁烯二酰亚胺类化合物作为几丁质合成酶抑制剂的应用，
Figure GDA0002484425020000021
其中，R0为苯基、苄基、苯乙基、苯丙基、对氟苯基、对氯苯基、对溴苯基、对甲氧基苯基、对甲基苯基或对羟基苯基；R1为氢、甲基、苯基、或氯；R2为氢、甲基、苯基、或氯。
作为优选，所述的顺丁烯二酰亚胺类化合物选自下列之一：
Figure GDA0002484425020000022
Figure GDA0002484425020000031
Figure GDA0002484425020000041
Figure GDA0002484425020000051
进一步优选所述的顺丁烯二酰亚胺类化合物为下列之一：Ⅰ-A-2，Ⅰ-A-3，Ⅰ-B-1，Ⅰ-B-2，Ⅰ-B-3，Ⅰ-A-6，Ⅰ-B-9，Ⅰ-B-15，Ⅰ-B-16，Ⅰ-A-13，Ⅰ-A-16，Ⅰ-B-19，Ⅰ-A-20，Ⅰ-B-26，Ⅰ-B-27，Ⅰ-B-30，Ⅰ-A-24。这些化合物对几丁质合成酶的抑制率均超过50％。更进一步优选所述顺丁烯二酰亚胺类化合物为Ⅰ-B-2或Ⅰ-A-20，这两种化合物对几丁质合成酶的IC50值低于商用几丁质合成酶抑制剂多抗霉素B对几丁质合成酶的IC50值。最优选的顺丁烯二酰亚胺类化合物为Ⅰ-A-20。
本发明所述的顺丁烯二酰亚胺类化合物，可通过现有文献报道的方法进行制备。本发明具体推荐所述顺丁烯二酰亚胺类化合物通过如下方法制备：
Figure GDA0002484425020000052
(1)当R0为苯基、苄基、苯乙基、苯丙基时，制备化合物(Ⅰ-A-1)～(Ⅰ-A-24)方法A如下：称取等摩尔的式Ⅱ所示的酸酐和式Ⅲ所示的有机胺加入丙酮中，室温下反应生成相应的马来酰胺酸；将生成的马来酰胺酸添加5-10当量的乙酸酐和0.1-0.5当量的乙酸钠，然后回流加热2-3h，反应结束后，将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，得到浓缩液，将浓缩液进行薄层层析或硅胶柱层析分离，以体积比8～16：1的石油醚和乙酸乙酯混合液为洗脱剂，收集目标组分，真空旋转蒸发去溶剂，干燥(优选60℃真空干燥)，获得式Ⅰ所示化合物；
(2)当R0为对氟苯基、对氯苯基、对溴苯基、对甲氧基苯基、对甲基苯基或对羟基苯基时，制备化合物(Ⅰ-B-1)～(Ⅰ-B-36)方法B如下：称取式Ⅱ所示的酸酐加入装有乙酸的三口烧瓶中，磁力搅拌溶解；同时称取与酸酐等摩尔的式Ⅲ所示的有机胺溶解于乙酸中，然后通过恒压滴液漏斗在室温下滴入三口烧瓶中，30-60min滴完，滴加完毕后加热反应2-3h，反应结束后，将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，得到浓缩液，将浓缩液进行薄层层析或硅胶柱层析分离，以体积比8～16：1的石油醚和乙酸乙酯混合液为洗脱剂，收集目标组分，真空旋转蒸发去溶剂，干燥(优选60℃真空干燥)，获得式Ⅰ所示化合物。
本发明还提供所述顺丁烯二酰亚胺类化合物作为几丁质合成酶抑制剂的筛选。实验中用到的几丁质合成酶提取自油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)。
本发明的有益效果主要体现在：本发明筛选出了多种对S.sclerotiorum中几丁质合成酶具有较好抑制作用的顺丁烯二酰亚胺类化合物，其中化合物Ⅰ-A-20对S.sclerotiorum中几丁质合成酶的IC50达到0.12mM，低于多抗霉素B对几丁质合成酶的IC50值；且这类化合物合成方法简单，原料便宜易得，同时对人体毒副作用较小，因而有希望作为几丁质合成酶抑制剂开发成为新型抗菌剂，并替代现有抗菌剂产品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：N-苯基-顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-1)的合成：
Figure GDA0002484425020000061
称取0.98g马来酸酐(Ⅱ-1)和0.93g苯胺(Ⅲ-1)加入到三口圆底烧瓶中，加入15mL丙酮室温下反应1h，生成相应的马来酰胺酸。将生成的马来酰胺酸加入5mL乙酸酐和100mg乙酸钠，然后回流加热2-3h。反应结束后，将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，得到浓缩液，将浓缩液经过硅胶柱层析分离(洗脱剂V石油醚：V乙酸乙酯＝8:1)，并收集目标液，真空旋转去溶剂，60℃真空干燥得到目标产物N-苯基-顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-1)。
Yield 78.6％,Purity 96.7％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.38-7.35(m,2H),7.35-7.31(m,2H),7.29(dq,J＝3.9,1.7Hz,1H),6.72(d,J＝5.0Hz,2H).HRMS[M+H]+:174.1715.
实施例2：N-苄基-顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-2)的合成：
Figure GDA0002484425020000062
将实施例1中原料苯胺(Ⅲ-1)改为苄胺(Ⅲ-2)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 73.3％,Purity 97.9％.1H NMR(500MHz CDCl3)δ7.38-7.35(m,2H),7.35-7.31(m,2H),7.29(dq,J＝3.9,1.7Hz,1H),6.72(d,J＝5.0Hz,2H),4.69(s,2H).HRMS[M+H]+:188.1985.
实施例3：N-苯乙基-顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-3)的合成：
Figure GDA0002484425020000071
将实施例1中原料苯胺(Ⅲ-1)改为苯乙胺(Ⅲ-3)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 77.2％,Purity 95.3％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.50-7.46(m,2H),7.29-7.24(m,2H),7.24-7.18(m,2H),7.16(s,1H),3.69-3.65(m,2H),2.86-2.82(m,2H).HRMS[M+H]+:202.0785.
实施例4：N-苯丙基-顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-4)的合成：
Figure GDA0002484425020000072
将实施例1中原料苯胺(Ⅲ-1)改为苯丙胺(Ⅲ-4)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 73.5％,Purity 98.3％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.48-7.44(m,1H),7.29-7.22(m,1H),7.22-7.11(m,2H),3.42-3.38(m,1H),2.62-2.58(m,1H),1.93-1.89(m,1H).HRMS[M+H]+:216.0958.
实施例5：N-苯基-3-甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-5)的合成：
Figure GDA0002484425020000073
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)改为柠康酸酐(Ⅱ-2)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 72.3％,Purity 97.7％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.47(dt,J＝9.9,1.9Hz,2H),7.37(tt,J＝3.6,1.7Hz,2H),7.36-7.34(m,1H),6.05(q,J＝1.8Hz,1H),2.19(t,J＝2.2Hz,3H).HRMS[M+H]+:188.1985.
实施例6：N-苄基-3-甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-6)的合成：
Figure GDA0002484425020000081
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为柠康酸酐(Ⅱ-2)和苄胺(Ⅲ-2)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 76.2％,Purity 96.1％.1H NMR(500MHz CDCl3)δ7.38-7.34(m,2H),7.34-7.30(m,2H),7.30-7.26(m,1H),6.34(q,J＝1.8Hz,1H),4.67(s,2H),2.09(d,J＝1.8Hz,3H).HRMS[M+H]+:202.2255.
实施例7：N-苯乙基-3-甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-7)的合成：
Figure GDA0002484425020000082
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为柠康酸酐(Ⅱ-2)和苯乙胺(Ⅲ-3)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 70.2％,Purity 98.0％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.29-7.24(m,2H),7.24-7.18(m,2H),7.16(s,1H),6.92(s,1H),3.75(s,1H),3.60(s,1H),2.86-2.82(m,2H),1.91-1.87(m,3H).HRMS[M+H]+:216.0952.
实施例8：N-苯丙基-3-甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-8)的合成：
Figure GDA0002484425020000083
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为柠康酸酐(Ⅱ-2)和苯丙胺(Ⅲ-4)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 66.5％,Purity 97.7％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.29-7.22(m,2H),7.22-7.11(m,3H),6.90(s,1H),3.49(s,1H),3.34(s,1H),2.62-2.58(m,2H),1.93-1.85(m,5H).HRMS[M+H]+:230.1113.
实施例9：N-苯基-3-苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-9)的合成：
Figure GDA0002484425020000091
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)改为一苯基马来酸酐(Ⅱ-3)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 83.3％,Purity 98.2％.1H NMR(500MHz,CDCl3)7.67(m,5H),7.55(m,1H),7.47(m,4H),7.27(s,1H).HRMS[M+H]+:250.0788.
实施例10：N-苄基-3-苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-10)的合成：
Figure GDA0002484425020000092
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为一苯基马来酸酐(Ⅱ-3)和苄胺(Ⅲ-2)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 73.7％.,Purity 97.5％.1H NMR(500MHz,CDCl3)7.85-7.65(m,6H),7.58(dt,J＝4.7,2.7Hz,2H),7.47-7.45(m,1H),7.39-7.36(m,2H),4,74(m,2H).HRMS[M+H]+:264.0953.
实施例11：N-苯乙基-3-苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-11)的合成：
Figure GDA0002484425020000093
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为一苯基马来酸酐(Ⅱ-3)和苯乙胺(Ⅲ-3)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 76.9％,Purity 96.9％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.50-7.41(m,3H),7.41-7.36(m,2H),7.31(s,1H),7.23-7.18(m,2H),7.14-7.05(m,3H),3.85(s,1H),3.67(s,1H),2.88-2.84(m,2H).HRMS[M+H]+:278.1112.
实施例12：N-苯丙基-3-苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-12)的合成：
Figure GDA0002484425020000101
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为一苯基马来酸酐(Ⅱ-3)和苯丙胺(Ⅲ-4)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 70.4％,Purity 96.4％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.50-7.43(m,3H),7.39(t,J＝5.7Hz,3H),7.26-7.17(m,2H),7.17-7.07(m,3H),3.57(s,1H),3.45(s,1H),2.58-2.54(m,2H),2.00-1.86(m,2H).HRMS[M+H]+:292.1267.
实施例13：N-苯基-3，4-二甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-13)的合成：
Figure GDA0002484425020000102
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)改为3,4-二甲基马来酸酐(Ⅱ-4)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 79.3％,Purity 98.9％.1H NMR(500MHz,DMSO)7.50(d,J＝7.9Hz,2H),7.32-7.28(m,2H),7.02(t,J＝7.4Hz,1H),2.07(s,6H).HRMS[M+H]+:202.0788.
实施例14：N-苄基-3,4-二甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-14)的合成：
Figure GDA0002484425020000103
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为3,4-二甲基马来酸酐(Ⅱ-4)和苄胺(Ⅲ-2)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 78.2％,Purity 98.4％.1H NMR(500MHz,CDCl3)7.37-7.30(m,5H),4.66(s,2H),1.97(s,6H).HRMS[M+H]+:216.0954.
实施例15：N-苯乙基-3,4-二甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-15)的合成：
Figure GDA0002484425020000111
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为3,4-二甲基马来酸酐(Ⅱ-4)和苯乙胺(Ⅲ-3)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 67.3％,Purity 96.3％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.29-7.24(m,2H),7.24-7.18(m,2H),7.16(s,1H),3.70-3.66(m,2H),2.86-2.82(m,2H),1.90-1.86(m,6H).HRMS[M+H]+:230.1112.
实施例16：N-苯丙基-3,4-二甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-16)的合成：
Figure GDA0002484425020000112
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为3,4-二甲基马来酸酐(Ⅱ-4)和苯丙胺(Ⅲ-4)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 72.6％,Purity 98.6％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.30-7.24(m,2H),7.24-7.12(m,3H),3.34-3.30(m,2H),2.64-2.60(m,2H),1.97-1.88(m,2H),1.87-1.83(m,6H).HRMS[M+H]+:244.1263.
实施例17：N-苯基-3,4-二氯顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-17)的合成：
Figure GDA0002484425020000113
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)改为3,4-二氯马来酸酐(Ⅱ-5)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 70.3％,Purity 97.2％.1H NMR(500MHz,CDCl3)7.53-7.48(m,2H),7.43(dd,J＝8.5,6.4Hz,1H),7.38-7.33(m,2H).HRMS[M+H]+:241.9686.
实施例18：N-苄基-3,4-二氯顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-18)的合成：
Figure GDA0002484425020000121
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为3,4-二氯马来酸酐(Ⅱ-5)和苄胺(Ⅲ-2)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 72.7％,Purity 95.9％.1H NMR(500MHz,CDCl3)7.38(dt,J＝4.7,2.7Hz,2H),7.37-7.35(m,1H),7.35-7.30(m,2H),4.76(s,2H).HRMS[M+H]+:255.9848.
实施例19：N-苯乙基-3,4-二氯顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-19)的合成：
Figure GDA0002484425020000122
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为3,4-二氯马来酸酐(Ⅱ-5)和苯乙胺(Ⅲ-3)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 73.8％,Purity 98.2％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.29-7.26(m,2H),7.26-7.13(m,6H),3.70-3.66(m,3H),2.85-2.81(m,3H).HRMS[M+H]+:270.0016.
实施例20：N-苯丙基-3,4-二氯顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-20)的合成：
Figure GDA0002484425020000123
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为3,4-二氯马来酸酐(Ⅱ-5)和苯丙胺(Ⅲ-4)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 72.5％,Purity 97.0％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.28-7.22(m,1H),7.22-7.12(m,2H),3.44-3.40(m,1H),2.62-2.58(m,1H),1.92-1.88(m,1H).HRMS[M+H]+:284.0174.
实施例21：N-苯基-3,4-二苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-21)的合成：
Figure GDA0002484425020000131
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)改为3,4-二苯基马来酸酐(Ⅱ-6)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 71.2％,Purity 96.7％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.68-6.84(m,15H).HRMS[M+H]+:326.1113.
实施例22：N-苄基-3,4-二苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-22)的合成：
Figure GDA0002484425020000132
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为3,4-二苯基马来酸酐(Ⅱ-6)和苄胺(Ⅲ-2)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 64.7％,Purity 97.3％.1H NMR(500MHz,CDCl3)7.42-7.11(m,10H),7.10(dt,J＝3.8,2.4Hz,2H),7.07(m,1H),7.06(m,2H),4.54(m,2H).HRMS[M+H]+:340.1263.
实施例23：N-苯乙基-3,4-二苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-23)的合成：
Figure GDA0002484425020000133
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为3,4-二苯基马来酸酐(Ⅱ-6)和苯乙胺(Ⅲ-3)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 66.2％,Purity 96.8％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.49-7.37(m,4H),7.30-7.22(m,6H),7.22-7.17(m,2H),7.16-7.09(m,3H),3.71-3.67(m,2H),2.86-2.82(m,2H).HRMS[M+H]+:354.1416.
实施例24：N-苯丙基-3,4-二苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-A-24)的合成：
Figure GDA0002484425020000141
将实施例1中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和苯胺(Ⅲ-1)改为3,4-二苯基马来酸酐(Ⅱ-6)和苯丙胺(Ⅲ-4)，其它操作同实施例1，投料比均保持不变。
Yield 76.3％,Purity 96.0％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.44-7.32(m,4H),7.28-7.19(m,6H),7.19-7.10(m,5H),3.55-3.51(m,2H),2.62-2.58(m,2H),1.96-1.92(m,2H).HRMS[M+H]+:368.1568.
实施例25：N-(4-氟苯基)-顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-1)的合成：
Figure GDA0002484425020000142
称取0.98g马来酸酐(Ⅱ-1)加入10mL乙酸的三口烧瓶中，磁力搅拌溶解，同时称取1.91g对氟苯胺(Ⅲ-5)溶解于15mL乙酸中，然后通过恒压滴液漏斗在室温下滴入三口烧瓶中，30min滴完。滴加完毕后加热反应2-3h。反应结束后，将反应液冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，得到浓缩液，将浓缩液经过硅胶柱层析分离(洗脱剂V石油醚：V乙酸乙酯＝6:1)，并收集目标液，真空旋转去溶剂，60℃真空干燥得到目标产物N-苯基-顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-1)。
Yield 83.8％,Purity 98.5％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.36-7.32(m,2H),7.21-7.14(m,2H),6.88(q,2H).HRMS[M+H]+:192.1618.
实施例26：N-(4-氯苯基)-顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-2)的合成：
Figure GDA0002484425020000151
将实施例25中原料对氟苯胺(Ⅲ-5)改为对氯苯胺(Ⅲ-6)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 86.5％.,Purity 96.5％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.48-7.44(m,2H),7.36-7.30(m,2H),6.88(m,2H).HRMS[M+H]+:208.6136.
实施例27：N-(4-溴苯基)-顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-3)的合成：
Figure GDA0002484425020000152
将实施例25中原料对氟苯胺(Ⅲ-5)改为对溴苯胺(Ⅲ-7)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 73.8％,Purity 97.4％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.62-7.53(m,1H),7.53-7.49(m,1H),7.46-7.31(m,1H).HRMS[M+H]+:251.9586.
实施例28：N-(4-甲苯基)-顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-4)的合成：
Figure GDA0002484425020000153
将实施例25中原料对氟苯胺(Ⅲ-5)改为对甲苯胺(Ⅲ-8)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 75.2％,Purity 97.2％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.53-7.49(m,2H),7.49-7.36(m,2H),7.31-7.17(m,2H),2.36-2.32(m,3H).HRMS[M+H]+:188.0641.
实施例29：N-(4-羟基苯基)-顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-5)的合成：
Figure GDA0002484425020000161
将实施例25中原料对氟苯胺(Ⅲ-5)改为对羟基苯胺(Ⅲ-9)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 63.4％,Purity 97.9％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.53-7.49(m,2H),7.40-7.25(m,2H),6.93-6.79(m,2H),3.62(s,1H).HRMS[M+H]+:190.0433.
实施例30：N-(4-甲氧基苯基)-顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-6)的合成：
Figure GDA0002484425020000162
将实施例25中原料对氟苯胺(Ⅲ-5)改为对甲氧基苯胺(Ⅲ-10)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 67.8％,Purity 97.2％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.53-7.49(m,2H),7.49-7.38(m,2H),7.05-6.91(m,2H),3.83-3.79(m,3H).HRMS[M+H]+:204.0585.
实施例31：N-(4-氟苯基)-3-甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-7)的合成：
Figure GDA0002484425020000163
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)改为柠康酸酐(Ⅱ-2)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 84.7％,Purity 97.1％.1H NMR(500MHz,CDCl3)7.36-7.32(m,2H),7.18-7.14(m,2H),6.50(q,J＝1.7Hz,1H),1.92(d,J＝1.8Hz,3H).HRMS[M+H]+:206.1895.
实施例32：N-(4-氯苯基)-3-甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-8)的合成：
Figure GDA0002484425020000171
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为柠康酸酐(Ⅱ-2)和对氯苯胺(Ⅲ-6)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 83.5％,Purity 96.4％.1H NMR(500MHz,CDCl3)7.46-7.42(m,2H),7.35-7.31(m,2H),6.50(q,J＝1.7Hz,1H),2.19(d,J＝1.8Hz,3H).HRMS[M+H]+:222.0253.
实施例33：N-(4-溴苯基)-3-甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-9)的合成：
Figure GDA0002484425020000172
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为柠康酸酐(Ⅱ-2)和对溴苯胺(Ⅲ-7)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 69.5％,Purity 98.1％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.62-7.48(m,2H),7.46-7.31(m,2H),6.96(s,1H),1.93-1.89(m,3H).HRMS[M+H]+:265.9742.
实施例34：N-(4-甲苯基)-3-甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-10)的合成：
Figure GDA0002484425020000173
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为柠康酸酐(Ⅱ-2)和对甲基苯胺(Ⅲ-8)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 64.7％,Purity 98.3％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.50-7.36(m,2H),7.31-7.17(m,2H),6.97(s,1H),2.36-2.32(m,3H),1.93-1.89(m,3H).HRMS[M+H]+:202.0788.
实施例35：N-(4-羟基苯基)-3-甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-11)的合成：
Figure GDA0002484425020000181
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为柠康酸酐(Ⅱ-2)和对羟基苯胺(Ⅲ-9)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 79.2％,Purity 96.9％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.39-7.25(m,2H),6.96(s,1H),6.93-6.78(m,2H),3.62(s,1H),1.93-1.89(m,3H).HRMS[M+H]+:204.0587.
实施例36：N-(4-甲氧基苯基)-3-甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-12)的合成：
Figure GDA0002484425020000182
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为柠康酸酐(Ⅱ-2)和对甲氧基苯胺(Ⅲ-10)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 64.8％,Purity 96.4％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.53-7.39(m,2H),7.05-6.94(m,3H),3.83-3.79(m,3H),1.93-1.89(m,3H).HRMS[M+H]+:218.0743.
实施例37：N-(4-氟苯基)-3-苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-13)的合成：
Figure GDA0002484425020000183
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)改为一苯基马来酸酐(Ⅱ-3)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 77.2％,Purity 97.0％.1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.64-7.05(m,6H),3.59-3.56(m,2H),3.35-3.26(m,2H).HRMS[M+H]+:268.0687.
实施例38：N-(4-氯苯基)-3-苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-14)的合成：
Figure GDA0002484425020000191
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为一苯基马来酸酐(Ⅱ-3)和对氯苯胺(Ⅲ-6)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 72.7％,Purity 98.5％.1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.65-7.00(m,6H),3.69-3.51(m,2H),3.25-3.20(m,2H).HRMS[M+H]+:284.0412.
实施例39：N-(4-溴苯基)-3-苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-15)的合成：
Figure GDA0002484425020000192
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为一苯基马来酸酐(Ⅱ-3)和对溴苯胺(Ⅲ-7)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 77.7％,Purity 97.8％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.60-7.50(m,11H),7.50-7.38(m,32H),7.38(d,J＝0.7Hz,1H),7.37-7.28(m,11H).HRMS[M+H]+:327.9892.
实施例40：N-(4-甲苯基)-3-苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-16)的合成：
Figure GDA0002484425020000193
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为一苯基马来酸酐(Ⅱ-3)和对甲苯胺(Ⅲ-8)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 70.1％,Purity 96.9％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.53-7.42(m,4H),7.42-7.35(m,4H),7.29-7.15(m,2H),2.36-2.32(m,3H).HRMS[M+H]+:264.0943.
实施例41：N-(4-羟基苯基)-3-苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-17)的合成：
Figure GDA0002484425020000201
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为一苯基马来酸酐(Ⅱ-3)和对羟基苯胺(Ⅲ-9)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 75.6％,Purity 97.5％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.53-7.38(m,23H),7.38(d,J＝1.1Hz,1H),7.35-7.22(m,8H),6.91-6.76(m,8H),3.59(s,4H).HRMS[M+H]+:266.0742.
实施例42：N-(4-甲氧基苯基)-3-苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-18)的合成：
Figure GDA0002484425020000202
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为一苯基马来酸酐(Ⅱ-3)和对甲氧基苯胺(Ⅲ-10)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 74.7％,Purity 95.9％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.51-7.34(m,8H),7.03-6.88(m,2H),3.83-3.79(m,3H).HRMS[M+H]+:280.0893.
实施例43：N-(4-氟苯基)-3，4-二甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-19)的合成：
Figure GDA0002484425020000203
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)改为2,3-二甲基马来酸酐(Ⅱ-4)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 85.7％,Purity 96.2％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.45(m,2H),7.23(m,2H),2.72(s,6H).HRMS[M+H]+:220.0687.
实施例44：N-(4-氯苯基)-3，4-二甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-20)的合成：
Figure GDA0002484425020000211
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二甲基马来酸酐(Ⅱ-4)和对氯苯胺(Ⅲ-6)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 83.5％,Purity 98.3％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.43(m,2H),7.34(m,2H),2.07(s,6H).HRMS[M+H]+:236.0412.
实施例45：N-(4-溴苯基)-3，4-二甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-21)的合成：
Figure GDA0002484425020000212
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二甲基马来酸酐(Ⅱ-4)和对溴苯胺(Ⅲ-7)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 74.1％,Purity 98.5％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.64-7.49(m,1H),7.42-7.28(m,1H),1.84-1.80(m,3H).HRMS[M+H]+:279.9886.
实施例46：N-(4-甲苯基)-3,4-二甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-22)的合成：
Figure GDA0002484425020000213
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二甲基马来酸酐(Ⅱ-4)和对甲基苯胺(Ⅲ-8)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 72.2％,Purity 97.4％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.47-7.33(m,2H),7.33-7.18(m,2H),2.37-2.33(m,3H),1.84-1.80(m,6H).HRMS[M+H]+:216.0939.
实施例47：N-(4-羟基苯基)-3,4-二甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-23)的合成：
Figure GDA0002484425020000221
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二甲基马来酸酐(Ⅱ-4)和对羟基基苯胺(Ⅲ-9)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 79.7％,Purity 98.0％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.37-7.22(m,2H),6.94-6.80(m,2H),3.67(s,1H),1.84-1.80(m,6H).HRMS[M+H]+:218.0745.
实施例48：N-(4-甲氧基苯基)-3,4-二甲基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-24)的合成：
Figure GDA0002484425020000222
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二甲基马来酸酐(Ⅱ-4)和对甲氧基苯胺(Ⅲ-10)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 77.3％,Purity 97.9％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.50-7.36(m,2H),7.06-6.92(m,2H),3.84-3.80(m,3H),1.84-1.80(m,6H).HRMS[M+H]+:232.0887.
实施例49：N-(4-氟苯基)-3,4-二氯顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-25)的合成：
Figure GDA0002484425020000223
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)改为2,3-二氯马来酸酐(Ⅱ-5)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 87.2％,Purity 97.4％.1H NMR(500MHz,CDCl3)7.37-7.32(m,2H),7.22-7.17(m,2H).HRMS[M+H]+:259.9612.
实施例50：N-(4-氯苯基)-3,4-二氯顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-26)的合成：
Figure GDA0002484425020000231
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二氯马来酸酐(Ⅱ-5)和对氯苯胺(Ⅲ-6)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 82.7％,Purity 96.8％.1H NMR(500MHz,CDCl3)7.50-7.45(m,2H),7.35-7.31(m,2H).HRMS[M+H]+:275.9313.
实施例51：N-(4-溴苯基)-3,4-二氯顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-27)的合成：
Figure GDA0002484425020000232
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二氯马来酸酐(Ⅱ-5)和对溴苯胺(Ⅲ-7)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 83.2％,Purity 97.5％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.64-7.49(m,1H),7.41-7.27(m,1H).HRMS[M+H]+:319.8811.
实施例52：N-(4-溴苯基)-3,4-二氯顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-28)的合成：
Figure GDA0002484425020000233
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二氯马来酸酐(Ⅱ-5)和对甲基苯胺(Ⅲ-8)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 78.7％,Purity 96.8％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.46-7.33(m,2H),7.33-7.18(m,2H),2.37-2.33(m,3H).HRMS[M+H]+:255.9863.
实施例53：N-(4-羟基苯基)-3,4-二氯顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-29)的合成：
Figure GDA0002484425020000241
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二氯马来酸酐(Ⅱ-5)和对羟基苯胺(Ⅲ-9)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 81.4％,Purity 95.8％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.36-7.21(m,2H),6.94-6.80(m,2H),3.66(s,1H).HRMS[M+H]+:257.9639.
实施例54：N-(4-甲氧基苯基)-3,4-二氯顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-30)的合成：
Figure GDA0002484425020000242
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二氯马来酸酐(Ⅱ-5)和对甲氧基苯胺(Ⅲ-10)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 79.5％,Purity 97.4％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.49-7.35(m,2H),7.06-6.92(m,2H),3.84-3.80(m,3H).HRMS[M+H]+:271.9815.
实施例55：N-(4-氟苯基)-3,4-二苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-31)的合成：
Figure GDA0002484425020000243
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)改为2,3-二苯基马来酸酐(Ⅱ-6)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 81.4％,Purity 96.6％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.52(d,J＝7.3Hz,2H),7.46-7.38(m,12H).HRMS[M+H]+:360.0715.
实施例56：N-(4-氯苯基)-3,4-二苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-32)的合成：
Figure GDA0002484425020000251
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二苯基马来酸酐(Ⅱ-6)和对氯苯胺(Ⅲ-6)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 81.4％,Purity 96.1％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.52(d,J＝7.3Hz,2H),7.46-7.38(m,12H).HRMS[M+H]+:360.0715.
实施例57：N-(4-溴苯基)-3,4-二苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-33)的合成：
Figure GDA0002484425020000252
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二苯基马来酸酐(Ⅱ-6)和对溴苯胺(Ⅲ-7)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 82.6％,Purity 97.2％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.61-7.48(m,1H),7.48-7.35(m,2H),7.35-7.30(m,1H),7.30-7.23(m,2H),7.17-7.12(m,1H).HRMS[M+H]+:404.0215.
实施例58：N-(4-甲基苯基)-3,4-二苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-34)的合成：
Figure GDA0002484425020000253
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二苯基马来酸酐(Ⅱ-6)和对甲基苯胺(Ⅲ-8)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 83.4％,Purity 97.6％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.48-7.32(m,6H),7.36-7.17(m,6H),7.17-7.12(m,2H),2.36-2.32(m,3H).HRMS[M+H]+:340.1266.
实施例59：N-(4-羟基苯基)-3,4-二苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-35)的合成：
Figure GDA0002484425020000261
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二苯基马来酸酐(Ⅱ-6)和对羟基苯胺(Ⅲ-9)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 89.4％,Purity 97.2％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.48-7.35(m,4H),7.34-7.24(m,6H),7.17-7.12(m,2H),6.91-6.77(m,2H),3.61(s,1H).HRMS[M+H]+:342.1047.
实施例60：N-(4-甲氧基苯基)-3,4-二苯基顺丁烯二酰亚胺(Ⅰ-B-36)的合成：
Figure GDA0002484425020000262
将实施例25中原料马来酸酐(Ⅱ-1)和对氟苯胺(Ⅲ-5)改为2,3-二苯基马来酸酐(Ⅱ-6)和对甲氧基苯胺(Ⅲ-10)，其它操作同实施例25，投料比均保持不变。
Yield 72.4％,Purity 96.9％.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.46-7.37(m,6H),7.30-7.23(m,4H),7.17-7.12(m,2H),7.03-6.89(m,2H),3.83-3.79(m,3H).HRMS[M+H]+:356.1213.
实施例61：式(Ⅰ)所示所有化合物对油菜菌核病菌中的几丁质合成酶的活性测定：
本实施例使用的试剂均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1g吐温-80加入1000mL的去离子水，超声溶解，直至成均相溶液，制成质量浓度0.1％的吐温-80水溶液，作为药物的助溶剂。称量上述实施例1到实施例24中制备的化合物(Ⅰ-A-1)～(Ⅰ-A-24)、实施例25到实施例60中制备的化合物(Ⅰ-B-1)～(Ⅰ-B-36)各0.03g加入质量浓度0.1％的吐温-80水溶液，配制成95μg/mL(多抗霉素B对该几丁质合成酶的半抑制浓度)的含药溶液用于酶活测定进行初筛。
实验中用到的几丁质合成酶提取自实验室保藏的油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)。用直径为6.0mm的打孔器在土豆培养基的边缘取活化好的S.sclerotiorum菌碟接种到装有100mL PDA培养基的500mL锥形瓶中，23℃过夜培养36h。离心(1500g，10min)收集S.sclerotiorum菌体。将收集的S.sclerotiorum菌体使用超纯水清洗两次后，在液氮预冷的研钵中研磨。使用重悬液(10％甘油，50mM Tris-HCl缓冲液，pH8.0)重悬研磨好的S.sclerotiorum菌体细胞碎片。向重悬液中加入80μg/mL胰蛋白酶，30℃消化30min后加入120μg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂终止反应。1500g转速离心10min，收集上清制成几丁质合成酶粗酶液，4℃保存。几丁质是N-乙酰氨基葡萄糖胺即(UDP-GlcNAc)经β-1,4键连接的线状纤维素聚合物。几丁质合酶就是催化UDP-GlcNAc形成几丁质必需的酶，它在几丁质合成过程中起决定性的作用。
将酶与底物N-乙酰氨基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)置于96孔微量板上，孵化产生几丁质，生成的几丁质与微孔板上包被的WGA结合而被固定，用WGA-HRP与几丁质进一步结合。通过检测HRP吸光度的变化，就可以推算出几丁质的量多少，进而计算出酶的活性，从而测定出几丁质合成酶的活性。
WGA包被的酶标板的制备：向96孔酶标板中加入WGA包被液(100μL/孔)，室温静置过夜。清空酶标板，每孔加入300μL的酶标板封闭液，室温静置过夜。-20℃保存。
几丁质的合成：清空预制的WGA包被的酶标板中的液体，超纯水水洗三次。向每孔中加入48μL几丁质合成酶粗酶液、50μL反应底物(或对照品)和2μL抑制剂。摇晃混匀后，30℃反应2-4h，每次测定重复两次。
几丁质合成酶合成几丁质反应结束后，立即用超纯水清洗酶标板6次。向清洗干净的酶标板中加入100μL的WGA-HRP结合液，30℃静置30min。
清空酶标板并用单蒸水清洗酶标板8次，向酶标板中加入每孔100μL的TMB反应液。摇晃混匀后立即放入酶标仪中进行测定。测定时检测600nm吸光值，每3min检测一次，共检测20次。将测定得到的不同时间下的吸光值绘制成酶活曲线，根据曲线计算出反应速率。
将几丁质合成酶测活过程中不加入抑制剂和底物的本底反应速率记作V0、只加入底物时的反应速率记作V1、同时加入抑制剂和底物的反应速率V2，根据公式：
抑制率＝(V2－V0)/(V1－V0)
对化合物库中的60种化合物进行初筛，进行上述酶活测定，结果发现有17种化合物两次平行实验几丁质合成酶的抑制率均超过50％，然后选取了抑制活性较好的17种化合物测定了它们对几丁质合成酶的IC50值进行复筛。
表1顺丁烯二酰亚胺类化合物对S.sclerotiorum中几丁质合成酶的抑制情况
Table 1 Inhibition of chitin synthase in S.sclerotiorum by maleimide.
Figure GDA0002484425020000271
Figure GDA0002484425020000281
从上表可以看出所合成的顺丁烯二酰亚胺类化合物有部分都对几丁质合成酶表现出了较好的抑制活性，与多抗霉素B(IC50＝0.19mM)的抑制活性相当，尤其是化合物Ⅰ-A-20对该酶表现出了很好的抑制活性，其IC50值为0.12mM，低于多抗霉素B对几丁质合成酶的IC50值。因此，该类化合物具有巨大的应用前景和商业价值，有望成为替代多抗霉素B成为新型的几丁质合成酶抑制剂。

Claims (1)

1.顺丁烯二酰亚胺类化合物作为几丁质合成酶抑制剂的应用，所述的顺丁烯二酰亚胺类化合物为如下所示的化合物I-B-2：
Figure FDA0003150623970000011
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