CN111296292A - 一种百香果茎切面愈伤组织诱导分化成苗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种百香果茎切面愈伤组织诱导分化成苗方法，以成熟植株百香果茎为外植体，建立无菌体系、经过诱导培养和继代培养。此方法体系克服百香果其根状茎发达，节上生根，根茎多具浓密根毛，木质茎含有较丰富的内生菌，对杀菌剂反应敏感，容易变色，无菌体系建立困难等问题，解决了百香果愈伤组织不易分化成芽、阻碍了快速繁殖这道技术的瓶颈。

Description

一种百香果茎切面愈伤组织诱导分化成苗方法
技术领域
本发明属于植物栽培领域，具体涉及一种百香果茎切面愈伤组织诱导分化成苗方法。
背景技术
百香果：西番莲科Passion fruit又称西番莲、巴西果、鸡蛋果。百香果富含人体所需的氨基酸、多种维生素、类胡萝卜素、超氧化物岐化酶（SOD）、硒以及各种微量元素。百香果被称为水果中的VC之王。常食用百香果具有提神醒脑、养颜美容、生津止渴、帮助消化、化痰止咳、缓解便秘、活血强身、提高人体免疫功效。目前百香果种苗质量参差不齐、苗木带病（主要病毒病）、品种不纯正等问题，制约了百香果产业进一步发展壮大。为确保品种纯正、质量优良的无病种苗供应，建立标准化的百香果现代生物技术繁育中心作为百香果产业发展的重点工作。
研究表明利用愈伤组织诱导分化成苗是获得无病毒植株有效方法。百香果其根状茎发达，节上生根，根茎多具浓密根毛。木质茎含有较丰富的内生菌，对杀菌剂反应敏感，容易变色。愈伤组织不易分化成芽成为百香果克隆技术的一道瓶颈，组织培养没有较权威的成熟技术可以参考，现未查到有关无芽茎切面分化成苗百香果组织培养的报道。本发明以成熟植株百香果无芽茎切面为外植体分化成无病种苗，从而更好地发展壮大百香果产业。目前，国内围绕百香果开展的科学研究主要涉及栽培技术、食品加工、化学成分、生理活性等方面，经检索，代表着本行业的生物技术发展水平和方向的百香果专利文献量仍较少，且对百香果无芽茎切面愈伤组织诱导分化成苗技术的分析研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种百香果茎切面愈伤组织诱导分化成苗方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种百香果茎切面愈伤组织诱导分化成苗方法，包括以下步骤：
（1）外植体采集与消毒；以成熟植株百香果茎为外植体，选择生长旺盛无病植株的新枝条，经自来水表面冲洗后，放在 1wt.% 次氯酸钠溶液浸泡 15 min，用自来水冲洗干净，放人体积分数75％酒精中灭菌 10 秒，再以0.1wt.％升汞灭菌5 ~ 6min，用无菌水冲洗 4 ~5 次；
（2）诱导培养；在无菌条件下将消毒过的枝条切成1.2 ~1.3cm的茎段直立插到诱导培养基中，每天连续光照8 h ，光照强度1000 ~1500 lx，培养温度21 ~27 ℃，培养130天；
（3）继代培养；诱导培养基上形成的小苗在无菌条件下切成带芽的茎段移接到生长培养基中，每天连续光照 12 h ，光照强度2 000 ~ 2500 lx，培养温度25±1 ℃，培养80天；
（4）瓶苗移植；继代培养的种苗生长到13cm，形成完整的根、茎、叶，用自来水把基部培养基冲洗干净，移植到土壤疏松基质中，浇透水盖上塑料膜保湿，在23--28℃条件下培养10天揭膜，苗圃阶段防止强光照，继续培养30--35天后待叶片长至6-7片，定植到大田。
所述诱导培养基为MS基本培养基中附加6-BA3.0m g/L、KT 0.5m g/L、NAA 1m g/L、IBA 0.3m g/L和GA 0.5m g/L，白糖30g/L。
所述生长培养基为 3/5 MS 基本培养基中附加NAA 0.2m g/L、IBA 0.3m g/L 、碧益4m g/L、甘乐8m g/L、白糖20g/L、土豆50 g/L、活性炭2.0 g/L、蛋白胨1.0g/L 。
步骤（2）中诱导培养温度为白天27 ℃，晚上21℃。
本发明的优点在于：
本发明以成熟植株百香果茎为外植体，建立无菌体系、经过诱导培养和继代培养。此方法体系克服百香果其根状茎发达，节上生根，根茎多具浓密根毛，木质茎含有较丰富的内生菌，对杀菌剂反应敏感，容易变色，无菌体系建立困难等问题，解决了百香果愈伤组织不易分化成芽、阻碍了快速繁殖这道技术的瓶颈。本发明继代培养阶段形成的种苗粗状，根、茎、叶分化完整（如图3），种植成活率高，成活率达95%，且生长快。本发明实现了无菌条件下的种苗快繁，从而解决目前百香果种苗质量参差不齐、苗木带病、品种不纯正等问题,与现有多采用的嫁接育苗时间缩短了30天，成本是嫁接苗的一半，实现了无病苗快繁。本发明已进入生产应用阶段，更好地发展壮大百香果产业。
附图说明
图1茎切面形成愈伤组织。
图2愈伤组织分化成小苗。
图3继代培养的种苗。
图4移植土壤的种苗。
具体实施方式
实施例1
（1）外植体采集与消毒；以成熟植株百香果茎为外植体，选择生长旺盛无病植株的新枝条，经自来水表面冲洗后，放在 1wt.% 次氯酸钠溶液浸泡 15 min，用自来水冲洗干净，放人体积分数75％酒精中灭菌 10 秒，再以0.1wt.％升汞灭菌5 min，用无菌水冲洗 4次；
（2）诱导培养；在无菌条件下将消毒过的枝条切成1.2 cm的茎段直立插到诱导培养基中，每天连续光照8 h ，光照强度1200 lx，培养温度为白天27 ℃，晚上21℃，培养130天；
（3）继代培养；诱导培养基上形成的小苗在无菌条件下切成带芽的茎段移接到生长培养基中，每天连续光照 12 h ，光照强度2300 lx，培养温度25±1 ℃，培养80天；
（4）瓶苗移植；继代培养的种苗生长到13cm，形成完整的根、茎、叶，用自来水把基部培养基冲洗干净，移植到土壤疏松基质中，浇透水盖上塑料膜保湿，在25℃条件下培养10天揭膜，苗圃阶段防止强光照，继续培养32天后待叶片长至7片，定植到大田。
所述诱导培养基为MS基本培养基中附加6-BA3.0m g/L、KT 0.5m g/L、NAA 1m g/L、IBA 0.3m g/L和GA 0.5m g/L，白糖30g/L。
所述生长培养基为 3/5 MS 基本培养基中附加NAA 0.2m g/L、IBA 0.3m g/L 、碧益4m g/L、甘乐8m g/L、白糖20g/L、土豆50 g/L、活性炭2.0 g/L、蛋白胨1.0g/L 。
本发明继代培养阶段形成的种苗粗状，根、茎、叶分化完整（如图3），种植成活率高，成活率达95%，且生长快。
实施例2
（1）外植体采集与消毒；以成熟植株百香果茎为外植体，选择生长旺盛无病植株的新枝条，经自来水表面冲洗后，放在 1wt.% 次氯酸钠溶液浸泡 15 min，用自来水冲洗干净，放人体积分数75％酒精中灭菌 10 秒，再以0.1wt.％升汞灭菌6min，用无菌水冲洗5 次；
（2）诱导培养；在无菌条件下将消毒过的枝条切成1.3cm的茎段直立插到诱导培养基中，每天连续光照8 h ，光照强度1000 lx，培养温度21 ~27 ℃，培养130天；
（3）继代培养；诱导培养基上形成的小苗在无菌条件下切成带芽的茎段移接到生长培养基中，每天连续光照 12 h ，光照强度2 000 lx，培养温度25±1 ℃，培养80天；
（4）瓶苗移植；继代培养的种苗生长到13cm，形成完整的根、茎、叶，用自来水把基部培养基冲洗干净，移植到土壤疏松基质中，浇透水盖上塑料膜保湿，在23℃条件下培养10天揭膜，苗圃阶段防止强光照，继续培养30天后待叶片长至6片，定植到大田。
所述诱导培养基为MS基本培养基中附加6-BA3.0m g/L、KT 0.5m g/L、NAA 1m g/L、IBA 0.3m g/L和GA 0.5m g/L，白糖30g/L。
所述生长培养基为 3/5 MS 基本培养基中附加NAA 0.2m g/L、IBA 0.3m g/L 、碧益4m g/L、甘乐8m g/L、白糖20g/L、土豆50 g/L、活性炭2.0 g/L、蛋白胨1.0g/L 。
步骤（2）中诱导培养温度为白天27 ℃，晚上21℃。
本发明继代培养阶段形成的种苗粗状，根、茎、叶分化完整，种植成活率高，成活率达95%，且生长快。
实施例3
（1）外植体采集与消毒；以成熟植株百香果茎为外植体，选择生长旺盛无病植株的新枝条，经自来水表面冲洗后，放在 1wt.% 次氯酸钠溶液浸泡 15 min，用自来水冲洗干净，放人体积分数75％酒精中灭菌 10 秒，再以0.1wt.％升汞灭菌6min，用无菌水冲洗 4 次；
（2）诱导培养；在无菌条件下将消毒过的枝条切成1.3cm的茎段直立插到诱导培养基中，每天连续光照8 h ，光照强度1500 lx，培养温度21 ~27 ℃，培养130天；
（3）继代培养；诱导培养基上形成的小苗在无菌条件下切成带芽的茎段移接到生长培养基中，每天连续光照 12 h ，光照强度2500 lx，培养温度25±1 ℃，培养80天；
（4）瓶苗移植；继代培养的种苗生长到13cm，形成完整的根、茎、叶，用自来水把基部培养基冲洗干净，移植到土壤疏松基质中，浇透水盖上塑料膜保湿，在28℃条件下培养10天揭膜，苗圃阶段防止强光照，继续培养35天后待叶片长至6片，定植到大田。
所述诱导培养基为MS基本培养基中附加6-BA3.0m g/L、KT 0.5m g/L、NAA 1m g/L、IBA 0.3m g/L和GA 0.5m g/L，白糖30g/L。
所述生长培养基为 3/5 MS 基本培养基中附加NAA 0.2m g/L、IBA 0.3m g/L 、碧益4m g/L、甘乐8m g/L、白糖20g/L、土豆50 g/L、活性炭2.0 g/L、蛋白胨1.0g/L 。
步骤（2）中诱导培养温度为白天27 ℃，晚上21℃。
本发明继代培养阶段形成的种苗粗状，根、茎、叶分化完整，种植成活率高，成活率达95%，且生长快。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种百香果茎切面愈伤组织诱导分化成苗方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
（1）外植体采集与消毒；以成熟植株百香果茎为外植体，选择生长旺盛无病植株的新枝条，经自来水表面冲洗后，放在 1wt.% 次氯酸钠溶液浸泡 15 min，用自来水冲洗干净，放人体积分数75％酒精中灭菌 10 秒，再以0.1wt.％升汞灭菌5 ~ 6min，用无菌水冲洗 4 ~5 次；
（2）诱导培养；在无菌条件下将消毒过的枝条切成1.2 ~1.3cm的茎段直立插到诱导培养基中，每天连续光照8 h ，光照强度1000 ~1500 lx，培养温度21 ~27 ℃，培养130天；
（3）继代培养；诱导培养基上形成的小苗在无菌条件下切成带芽的茎段移接到生长培养基中，每天连续光照 12 h ，光照强度2 000 ~ 2500 lx，培养温度25±1 ℃，培养80天；
（4）瓶苗移植；继代培养的种苗生长到13cm，形成完整的根、茎、叶，用自来水把基部培养基冲洗干净，移植到土壤疏松基质中，浇透水盖上塑料膜保湿，在23-28℃条件下培养10天揭膜，苗圃阶段防止强光照，继续培养30-35天后待叶片长至6-7片，定植到大田。
2.根据权利要求1所述的一种百香果茎切面愈伤组织诱导分化成苗方法，其特征在于：所述诱导培养基为MS基本培养基中附加6-BA3.0m g/L、KT 0.5m g/L、NAA 1m g/L、IBA0.3m g/L和GA 0.5m g/L，白糖30g/L。
3.根据权利要求1所述的一种百香果茎切面愈伤组织诱导分化成苗方法，其特征在于：所述生长培养基为 3/5 MS 基本培养基中附加NAA 0.2m g/L、IBA 0.3m g/L 、碧益4m g/L、甘乐8m g/L、白糖20g/L、土豆50 g/L、活性炭2.0 g/L、蛋白胨1.0g/L 。
4.根据权利要求1所述的一种百香果茎切面愈伤组织诱导分化成苗方法，其特征在于：步骤（2）中诱导培养温度为白天27 ℃，晚上21℃。
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